一种丁酸梭菌及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高效利用淀粉质基质的丁酸梭菌，该菌株在利用玉米淀粉和木薯淀粉发酵生产丁酸并制备丁酸梭菌活菌制剂的方法。

背景技术：

正丁酸(butyricacid)是一种含四个碳原子的短链有机羧酸(short-chainfattyacids)，丁酸及其衍生物在化工、食品、医药和饲料行业等领域有着广泛的用途[dwidarmetal.thefutureofbutyricacidinindustry.sciworldj,2012,471417]。目前，丁酸的生产主要有化学合成和微生物发酵两种方法，目前化学合成法主要采用氧化正丁醛法制备丁酸，该方法具有工艺简单，条件易于控制，产品收率高的优势，是目前是工业化丁酸生产的主要方法，但原料源于不可再生的化石资源，且反应过程会产生有毒金属污染物，因此其可持续性和环保性受到制约。微生物发酵法生产丁酸是近年来新兴的丁酸生产方法，具有原料成本低，发酵条件温和，环境污染小，且生物基丁酸更受食品、医药和饲料行业青睐，但目前微生物发酵法仍存在丁酸转化率低，副产物难于分离等问题，导致其生产成本高，工业化应用受到限制。因此近年来对于微生物发酵法生产丁酸的研究主要集中于降低原料成本，提升丁酸转化率和选择性等问题[jiangletal.butyricacid:applicationsandrecentadvancesinitsbioproduction.biotechnologyadvances，2018，36(8)：2101-2117]。

丁酸可由梭菌属(clostridium)、丁酸杆菌属(butyribacterium)、丁酸弧菌属(butyrivibrio)、真杆菌属(eubacterium)、八叠球菌属(sarcina)、巨球形菌属(megasphaera)、梭杆菌属(fusobacterium)等微生物发酵生产，其中梭菌属的酪丁酸梭菌(clostridiumtyrobutyricum)和丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)具有相对较好的丁酸产量、丁酸转化率，因此被认为是最具商业化开发潜力的丁酸发酵菌株。但酪丁酸梭菌碳源利用谱相对较窄，主要为葡萄糖、果糖和木糖等，限制了其对廉价底物的直接利用，往往需要复杂的底物预处理过程才能用于发酵。而丁酸梭菌则具有广泛的底物利用范围，包括六碳糖、五碳糖、糖蜜、乳清、淀粉及甘油等，此外自2009年起丁酸梭菌已被批准为新饲料添加剂，因此菌种安全性方面具有保障，但其丁酸产量和产物选择性方面略逊于酪丁酸梭菌。

开发廉价的生物质底物发酵工艺是降低微生物发酵法产成本重要策略之一，而淀粉作为一种可再生生物质资源，具有生产工艺简单，价格低廉等优点，可替代葡萄糖作为工业发酵底物，因此筛选一种能高效利用淀粉基质且丁酸产能性状优良的菌种，可提供一条新型微生物发酵法产丁酸工艺路线。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一株可高效利用淀粉基质生产丁酸的丁酸梭菌菌株，能够直接利用玉米淀粉和木薯淀粉作为碳源，利用效率高，丁酸转化率高；本发明的目的之二在于提供该丁酸梭菌的培养方法；本发明的目的之三在于提供该丁酸梭菌利用淀粉生产丁酸的发酵方法及发酵后固体残渣用于丁酸梭菌活菌菌剂的制备方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种丁酸梭菌，该菌为丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)scut620，于2019年3月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为gdmccno：60623，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。

一种发酵生产丁酸的方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化：将丁酸梭菌scut620菌液稀释后，涂布于固体活化培养基，37℃培养48h，挑取单菌落接种于种子培养基中，35±2℃静置厌氧培养16～24h，至od600为1.5～2；

(2)种子培养；取丁酸梭菌scut620活化菌液接种于种子培养基中，35±2℃静置厌氧培养8～16h，od600为1.5～2，此为种子培养液；

(3)发酵培养：将发酵培养基加热糊化淀粉，然后灭菌，将丁酸梭菌scut620种子培养液接种于发酵培养基中进行发酵；

(4)发酵液经离心分离，从上清液中分离得到丁酸。

优选地，所述丁酸梭菌以淀粉或淀粉加工残渣为碳源发酵生产丁酸。

优选地，所述淀粉为木薯淀粉或玉米淀粉。

优选地，所述活化培养基为：胰蛋白胨10g/l；牛肉膏10g/l；葡萄糖5g/l；氯化钠5g/l；酵母粉3g/l；乙酸钠3g/l；可溶性淀粉1g/l；l-半胱胺酸盐酸盐0.5g/l；在固体培养时还添加琼脂15g/l。

优选地，所述种子培养基为：葡萄糖20g/l；氯化钠5g/l；酵母粉5g/l；硫酸铵3g/l；磷酸氢二钾1.5g/l；mgso4·7h2o0.6g/l，feso4·7h2o0.03g/l。

优选地，发酵培养基为：磷酸氢二钾2g/l；硫酸铵1g/l；酵母粉5g/l；mgso4·7h2o0.6g/l；feso4·7h2o0.03g/l；碳源20～60g/l；碳酸钙50g/l；初始ph＝7.0。

优选地，所述发酵条件为：35±2℃，摇床转速100～150rpm，培养48～72h。

优选地，将步骤(4)离心分离后的发酵液沉淀物直接冷冻干燥得到丁酸梭菌活菌制剂。

优选地，所述上清液通过超滤去除残留菌体和可溶性蛋白，浓缩至40～60g/l丁酸浓度后，采用三辛胺作为萃取剂，辛醇作为稀释剂，萃取条件为三辛胺浓度为40％(v/v)，发酵液ph值2～3，相比0.8，温度25℃萃取后用naoh对有机相进行反萃取，最终分离得到纯的丁酸。

上述丁酸梭菌scut620，具体的筛选方法包括如下步骤：

取约1g奶牛新鲜粪便样品，加入到9mlpbs中，放入80℃水浴10min以杀死非芽孢菌，颠倒混匀后取2ml接种于富集培养基(胰蛋白胨10g/l；牛肉膏10g/l；葡萄糖5g/l；氯化钠5g/l；酵母膏3g/l；乙酸钠3g/l；可溶性淀粉1g/l；l-半胱胺酸盐酸盐0.5g/l)于37℃静置厌氧培养48h；将培养液稀释到10^-4，涂布于梭菌固体筛选培养基(胰蛋白胨15g/l；酵母粉10g/l；亚硫酸钠0.5g/l；新生霉素0.02g/l；多粘菌素0.05g/l；枸椽酸铁0.5g/l；琼脂15g/l；ph＝7.2)，37℃厌氧培养48h后，挑取单菌落于富集培养基中，37℃厌氧培养24h后取少量样品进行革兰氏染色镜检观察，挑选革兰氏染色为阳性，显微形态为杆状具有芽孢的菌株进行后续16srdna序列菌种鉴定和代谢特征鉴定。

上述丁酸梭菌scut620具有以下特征：

(1)菌落特征：菌落呈圆形，表面光滑，边缘不整齐，凸起，白色或乳白，菌落直径1.5-2mm；

(2)细胞形态特征：细胞为杆状，顶端圆钝；革兰氏染色阳性；

(3)生理生化特征：严格厌氧生长，能够利用葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、淀粉等，不能利用纤维素；代谢产物主要为丁酸、乙酸。

(4)丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)scut620的16srrna基因序列长度为1,427bp，其核苷酸序列如seqidno：1所示。

上述丁酸梭菌scut620培养方法：

本发明培养基所需的厌氧环境通过充入100％n2得到，一般注入达到0.5个大气压。

活化培养基组成(/l)：胰蛋白胨10g；牛肉膏10g；葡萄糖5g；氯化钠5g；酵母粉3g；乙酸钠3g；可溶性淀粉1g；l-半胱胺酸盐酸盐0.5g；固体培养时添加琼脂15g。

种子培养基组成(/l)：葡萄糖20g；氯化钠5g；酵母粉5g；硫酸铵3g；磷酸氢二钾1.5g；mgso4·7h2o0.6g，feso4·7h2o0.03g。

摇瓶发酵培养基组成(/l)：磷酸氢二钾2g；硫酸铵1g；酵母粉5g；mgso4·7h2o0.6g；feso4·7h2o0.03g；相应碳源20～60g；碳酸钙50g；初始ph为7.0。

所述的丁酸梭菌scut620发酵淀粉基底物生产丁酸的方法：

(1)菌种活化：丁酸梭菌scut620菌液稀释到10^-4，涂布于固体活化培养基，37℃培养48h。挑取单菌落接种于装有5～10ml子培养基离心管中，37℃静置培养16～24h，至od600约为1.5～2。

(2)种子培养；用无菌注射器取2～5ml丁酸梭菌scut620活化菌液接种于装有50～100ml种子培养基的血清瓶中，37℃静置厌氧培养8～16h，od600约为1.5～2，以获得种子培养液。

(3)摇瓶发酵：用玉米淀粉，木薯淀粉作为碳源配制摇瓶发酵培养基，其碳源终浓度为40g/l灭菌前培养基沸水浴10min糊化淀粉，然后115℃灭菌20min。用无菌注射器取2.5ml丁酸梭菌scut620种子培养液接种于装有50ml相应碳源的摇瓶发酵培养基中，37℃，150rpm，72h。

(4)淀粉发酵后发酵液通过固液分离，收集沉淀，通过冷冻干燥后，得丁酸梭菌活菌制剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

所提供的丁酸梭菌scut620具有较广泛的底物利用谱，尤其对淀粉基生物质底物具有较好的分解代谢能力，可利用玉米淀粉和木薯淀粉甚至淀粉加工过程中的残渣生物发酵转化丁酸，具有较高的丁酸转化率，丁酸转化率达到0.33g/g玉米淀粉和0.37g/g木薯淀粉，此外本发明还提供丁酸梭菌淀粉发酵方法，发酵后的固体沉淀物冷冻干燥后丁酸梭菌活菌数量可达2×10⁸cfu/g以上，且具有较好的贮藏稳定性，室温放置21天后活菌数大于1×10⁷cfu/g，可直接作为丁酸梭菌活菌制剂，用于畜牧养殖行业的饲料添加。该发酵方法相比较于利用葡萄糖作为碳源发酵生产丁酸而言，原料成本更低，工艺步骤简单，可操作性强，无生产废料产生，适合工业化生产，具有较好的经济效益。

附图说明

图1系统发育树。

图2丁酸梭菌scut620菌落形态图。

图3丁酸梭菌scut620细胞形态图。

图4不同碳源条件下摇瓶发酵结果图。

图5利用玉米淀粉和木薯淀粉摇瓶发酵结果图。

图6丁酸梭菌活菌制剂稳定性测试图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、丁酸梭菌分离筛选

取约1g奶牛新鲜粪便样品，加入到9mlpbs中，放入80℃水浴10min以杀死非芽孢菌，颠倒混匀后取2ml接种于富集培养基(胰蛋白胨10g/l；牛肉膏10g/l；葡萄糖5g/l；氯化钠5g/l；酵母膏3g/l；乙酸钠3g/l；可溶性淀粉1g/l；l-半胱胺酸盐酸盐0.5g/l)于37℃静置厌氧培养48h；将培养液稀释到10^-4，涂布于固体筛选培养基(胰蛋白胨15g/l；酵母粉10g/l；亚硫酸钠0.5g/l；新生霉素0.02g/l；多粘菌素0.05g/l；枸椽酸铁0.5g/l；琼脂15g/l；ph＝7.0)，37℃静置厌氧培养48h，挑取单菌落于富集培养基中，37℃厌氧培养24h后取少量样品进行革兰氏染色镜检观察，挑选革兰氏染色为阳性，显微形态为杆状具有芽孢的菌株进行后续菌种鉴定。

实施例2、菌种鉴定

一、细胞形态特征鉴定

挑取实施例1中分离得到的单菌落，接种于含有富集培养基中的离心管中，37℃厌氧培养24h后取少量菌液进行革兰氏染色镜检观察。

革兰氏染色试验：

(1)染色：取适量菌滴加到载玻片上，通过火焰2～3次固定，滴加草酸铵结晶紫液，染于固定过的涂片染色1min。

(2)水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。

(3)媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。

(4)脱色：吸去残留水，连续滴加95％乙醇脱色20～30s至流出液无紫色，立即水洗。

(5)吸去残留水，连续滴加95％乙醇脱色20～30s至流出液无紫色，立即水洗。

通过革兰氏染色镜检观察，参照《bergey’smanualofsystematicbacteriology》(第二版)，梭菌属形态特征描述，筛选相似菌株进行后续16srdna基因序列分析鉴定。

二、16srdna基因序列分析鉴定：

挑取实施例2细胞形态特征鉴定中分离得到的菌株，接种于含有富集培养基中的离心管中，37℃厌氧培养24h后取少量样品进行pcr扩增16srdna序列。采用27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’和1492r：5’ggttaccttgttacgactt-3’分别作为正向和反向引物，pcr反应体系(25μl)为：takaraprimerstarmix12.5μl；ddh2o9.5μl；正反向引物各1μl；菌液1μl。

pcr扩增程序：98℃预变性10min，98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸2min，进行30循环，最后72℃延伸10min,4℃保存。pcr产物利用1％琼脂糖凝胶电泳检测，片段为1500bp左右的阳性产物经纯化后进行序列测定。测序结果表明，所挑选菌株scut620的16srrna基因序列长度为1,427bp，其核苷酸序列如seqidno：1所示。运用ncbi上的blast将测得的基因序列和genbank数据库进行同源性比较，利用mega6.0构建丁酸梭菌系统发育树，鉴定结果如图1所示，所筛选出的scut620菌株与clostridiumbutyricum菌种同源性最高。

三、菌落形态及细胞形态特征

将所筛选出的scut620菌株的培养液稀释到10^-4，涂布于固体富集培养基，37℃厌氧培养48h后，观察其菌落形态。结果如图2所示，scut620菌株菌落呈圆形，表面光滑，边缘不整齐，凸起，白色或乳白色。此外革兰氏染色鉴定为阳性，如图3所示，细胞形态为杆状，顶端圆钝，具有芽孢。

综上所述，根据《bergey’smanualofsystematicbacteriology》(第二版)，细胞形态、菌落形态特征描述和其16srrna基因序列分析鉴定结果，所筛选出的scut620菌株被鉴定为丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)。

四、摇瓶发酵特征

将上述分离得到的丁酸梭菌(clostridiumbutyricumscut620)接种于液体活化培养基为(胰蛋白胨10g/l；牛肉膏10g/l；葡萄糖5g/l；氯化钠5g/l；酵母粉3g/l；乙酸钠3g/l；可溶性淀粉1g/l；l-半胱胺酸盐酸盐0.5g/l),37℃静置厌氧培养48h后，用无菌注射器取2.5ml丁酸梭菌scut620活化菌液接种于装有50ml种子培养基(葡萄糖20g/l；氯化钠5g/l；酵母粉5g/l；硫酸铵3g/l；磷酸氢二钾1.5g/l；mgso4·7h2o0.6g/l；feso4·7h2o0.03g/l)的血清瓶中，37℃静置厌氧培养8～16h，od600约为1.5～2，以获得种子培养液。用无菌注射器取2.5ml丁酸梭菌scut620种子培养液接种于装有50ml发酵培养基(磷酸氢二钾2g/l；硫酸铵1g/l；酵母粉5g/l；mgso4·7h2o0.6g/l；feso4·7h2o0.03g/l；相应碳源40g/l；碳酸钙50g/l；初始ph为7.0)，发酵培养基分别以终浓度40g/l的葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、可溶性淀粉和纤维素作为碳源，在120ml的血清瓶中装入配制好的发酵液50ml，抽真空充氮气，进行115℃，20min高温高压灭菌，冷却待用。发酵过程在37℃下静置厌氧培养60h进行培养，并定时取样，监测发酵产物。

结果如图4所示，分离得到的丁酸梭菌(clostridiumbutyricumscut620)具有很宽的底物谱，经测试可利用葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖和淀粉作为碳源生产丁酸，其产量达到10～14g/l；但不能直接利用纤维素作为碳源。

实施例3、玉米淀粉发酵生成丁酸及丁酸梭菌菌剂

依照实施例2摇瓶发酵特征中所描述流程制备种子培养液。用玉米淀粉直接作为碳源配制摇瓶发酵培养基，碳源终浓度为40g/l，灭菌前培养基沸水浴10min糊化淀粉，然后115℃灭菌20min。用无菌注射器取2.5ml丁酸梭菌scut620种子培养液接种于装有50ml发酵培养基中，37℃,150rpm,72h。发酵结果如图5所示，在摇瓶发酵水平上40g/l玉米淀粉可以转化为13.23g/l丁酸产物，丁酸转化率达到0.33g/g玉米淀粉，此外副产物仅有乙酸(见图5)。上述结果表明丁酸梭菌scut620具有较强的玉米淀粉利用能力，且具有较好的丁酸选择性和转化率。将上述发酵后的发酵液在室温和非厌氧条件下离心，上清液通过超滤去除残留菌体和可溶性蛋白，浓缩至约50g/l丁酸浓度后，用采用三辛胺作为萃取剂，辛醇作为稀释剂，萃取条件为三辛胺浓度为40％(v/v)，发酵液ph值2～3，相比0.8，温度25℃。萃取后用0.8mnaoh对有机相进行反萃取，最终分离得到纯的丁酸。发酵液沉淀物直接冷冻干燥后得到丁酸梭菌活菌制剂。将制备的丁酸梭菌活菌制剂在室温条件下连续放置3周，每周检测活菌数量。结果如图6所示，由发酵液废渣所制备的丁酸梭菌活菌制剂，数量可达到数量可达2×10⁸cfu/g以上，连续放置3周后活菌数量仍能保持1×10⁷cfu/g以上，具有较好的贮藏稳定性，且制备工艺简单、可操作性强。

实施例4、木薯淀粉发酵生成丁酸及丁酸梭菌菌剂

依照实施例2摇瓶发酵特征中所描述流程制备种子培养液。用木薯淀粉直接作为碳源配制摇瓶发酵培养基，碳源终浓度为40g/l，灭菌前培养基沸水浴10min糊化淀粉，然后115℃灭菌20min。用无菌注射器取2.5ml丁酸梭菌scut620种子培养液接种于装有50ml相应碳源的摇瓶发酵培养基中，37℃,150rpm,72h。发酵结果如图5所示，在摇瓶发酵水平上40g/l木薯淀粉可以转化为14.65g/l丁酸产物，丁酸转化率达到0.37g/g木薯淀粉，此外副产物仅有乙酸。上述结果表明丁酸梭菌scut620具有较强的木薯淀粉底物利用能力，且具有较好的丁酸选择性和转化率。将上述发酵后的发酵液在室温和非厌氧条件下离心，上清液通过超滤去除残留菌体和可溶性蛋白，浓缩至约50g/l丁酸浓度后，用采用三辛胺作为萃取剂，辛醇作为稀释剂，萃取条件为三辛胺浓度为40％(v/v)，发酵液ph值2～3，相比0.8，温度25℃。萃取后用0.8mnaoh对有机相进行反萃取，最终分离得到纯的丁酸；发酵液沉淀物直接冷冻干燥后得到丁酸梭菌活菌制剂。将制备的丁酸梭菌活菌制剂在室温条件下放置连续放置3周，每周检测活菌数量。结果如图6所示，由发酵液废渣所制备的丁酸梭菌活菌制剂，数量可达到数量可达4×10⁸cfu/g以上，连续放置3周后活菌数量仍能保持1×10⁷cfu/g以上，表明具有较好的贮藏稳定性，且制备工艺简单、可操作性强。

序列表

<110>华南理工大学

<120>一种丁酸梭菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1427

<212>dna

<213>丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)

<400>1

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