表达抗新城疫病毒融合蛋白的细胞系及其构建方法和应用与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种表达新城疫病毒融合蛋白的细胞系及其构建方法和应用，具体涉及一种表达抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白的细胞系及其构建方法和应用。

背景技术：

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV) 引起的以感染禽类为主的一种急性、高度接触性传染病。该病以消化道和呼吸道病变为主要特征，发病率和死亡率高，给养禽业带来了严重的危害。新城疫病毒基因组编码6种结构蛋白，分别为膜蛋白、磷酸化蛋白、核衣壳蛋白(NP)、血凝素-神经氨酸酶蛋白、融合蛋白和大分子蛋白(L)。NP蛋白由489个氨基酸残基组成，分子量约为53kDa，该蛋白是NDV核衣壳的主要蛋白质成分，是病毒粒子中含量最丰富的蛋白，其具有天然的免疫原性，但是不具有免疫保护作用，因此常常用作监测疫苗接种程序和新城疫的临床诊断。

目前，NDV检测方法主要有病毒的分离与鉴定、电镜检测技术、血清学诊断方法以及分子生物学诊断方法等。ELISA方法是目前应用最广泛的一种免疫检测方法，具有敏感性好、特异性强、操作简单、重复性好等优点。临床上检测鸡源NDV抗体的ELISA试剂盒已经广泛的生产和使用，但该类试剂盒生产流程中或者需要制备酶标记的抗鸡的二抗 (间接ELISA)，或者需要抗NDV核衣壳蛋白的单抗，因此，具有生产过程复杂、成本高、商品化试剂盒的组装需要的成分多等缺点，例如：目前市场使用频率最高的来自IDEXX 公司的检测鸡血清中抗NDV抗体的ELSA试剂盒，该试剂盒需要制备辣根过氧化物酶 (HRP)标记的羊抗鸡二抗，其生产程序是首先需要分离纯化鸡IgY，然后将其免疫羊，分离羊抗鸡IgY后，再进行酶的标记，生成过程复杂，导致成本高。

纳米抗体是1989年Hamers-Casterman等在骆驼血液里发现的一种天然缺失轻链的重链抗体，其分子量为15kDa，直径2.2nm，长4.8nm，与传统抗体相比，纳米抗体具有更高亲和力与水溶性，构象稳定，易于基因工程改造以及穿过血脑屏障等优势。近年来，随着对纳米抗体研究的不断深入，该抗体已在蛋白可视化示踪、结构解析以及人类和动物疫病的诊治领域等得到广泛应用。因此，利用纳米抗体优势，寻找一种能够稳定将编码抗NDV核衣壳蛋白的纳米抗体基因表达的细胞系，通过细胞系稳定表达的纳米抗体直接应用到检测血清的NDV抗体的ELISE技术中，将会简化将现有的ELISA方法繁琐的酶标记程序，使得生产过程简易且降低生产成本。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种表达抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体与HRP融合蛋白的细胞系，该细胞系具有稳定表达抗新城疫病毒NP蛋白的纳米抗体和HRP融合蛋白的能力。

本发明还有一个目的是提供一种表达抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体与HRP融合蛋白的细胞系的构建方法，通过慢病毒载体构建及包装的过程，成功获得稳定表达抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体与HRP融合蛋白的细胞系。

本发明还有一个目的是提供一种抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体与HRP融合蛋白在新城疫抗体检测中的应用，该融合蛋白在抗新城疫病毒的阳性血清中可以与阳性血清的抗体竞争的与新城疫病毒核衣壳蛋白的抗原结合，可简化新城疫病毒的检测方法。

本发明还有一个目的是提供一种抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体与HRP融合蛋白在抗新城疫病毒阳性鸡血清检测中的应用，阳性鸡血清中加入本发明细胞系培养上清液，可阻断该融合蛋白与新城疫病毒NP蛋白的结合，利于简化鸡感染抗新城疫病毒检测的方法。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种表达抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白的细胞系，所述细胞系在中国典型培养物保藏中心的保藏号为 C201397；保藏单位地址：湖北武汉，武汉大学。

本发明提供一种所述的表达抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

a：合成编码抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体与HRP融合基因：将编码新城疫病毒NP 蛋白纳米抗体和HRP的核苷酸序列直接融合，中间用柔性序列连接，合成重组融合基因；

b：构建用于表达所述重组融合基因的重组慢病毒载体：将所述重组融合基因经酶切后，连接到慢病毒载体上，得到重组慢病毒载体；其中，慢病毒载体为 PLVX-IRES-ZsGreen1；

c：重组慢病毒载体的包装：将所述重组慢病毒载体及2个辅助质粒转染至培养的 HEK-293T细胞中，传代培养，筛选获得表达抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体与HRP融合蛋白的细胞系。

优选的是，所述新城疫病毒NP蛋白纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述HRP的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的是，所述辅助质粒为psPAXA2和pMD2.G。

本发明还提供一种表达抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白的细胞系是由所述的构建方法构建。

本发明还提供一种抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白由所述细胞系分泌表达。

本发明还提供一种所述的抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白在新城疫抗体检测中的应用。

本发明还提供一种所述的抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白在抗新城疫病毒阳性鸡血清检测中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明所述的表达抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白的细胞系，其培养的上清液中含有大量抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白；通过表达抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白的细胞系的构建方法，将具有抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体和HRP融合蛋白的重组基因成功转染至HEK-293T细胞，构成能稳定表达该融合蛋白的细胞系；将该细胞系表达的抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白应用到血清检测中，可避免现有技术中间接ELISA或者需要抗NDV核衣壳蛋白的单抗在检测新城疫抗体方法中繁琐程序和酶标二抗，增加生产成本，降低检测效率；而具体的将该细胞系表达的融合蛋白应用到阳性鸡血清的检测中，将待检测鸡血清与该细胞系培养后的上清液稀释1000倍液混合培养，可阻断纳米蛋白-HRP融合蛋白与抗新城疫病毒NP蛋白的反应，因此，本发明构建的细胞系经培养分泌表达的抗新城疫病毒纳米蛋白-HRP融合蛋白，仅需要用该细胞系培养的上清液即可用于鸡是否感染新城疫病毒的检测方法中，避免现有检测鸡血清中抗新城疫病毒抗体的ELSA试剂盒中酶标二抗等繁琐的过程，大大提高检测效率，还能降低检测成本。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的合成NDV-Nb5-HRP融合基因后的酶切鉴定结果；

图2为所述的筛选的稳定表达NDV-NP-Nb5-HRP的HEK-293细胞系在荧光显微镜下观测结果；

图3为所述的直接ELISA检测稳筛的细胞系的上清中HRP的活性；

图4为所述的间接ELISA检测稳筛细胞系分泌的NDV-NP-Nb5-HRP与抗原的特异性结合水平；

图5为所述的Western blotting检测筛选细胞的细胞裂解液和培养上清中 NDV-NP-Nb5-HRP表达量的结果；

图6a为所述的抗新城疫病毒LaSota株NP基因的扩增结果；

图6b为所述的构建的重组原核表达载体的酶切鉴定结果；

图7a为所述的SDS-PAGE分析核衣壳蛋白的表达结果；

图7b为所述的Western blot分析原核表达蛋白的抗原性的结果；

图8为所述的新城疫病毒抗体鸡血清中NDV-NP-Nb5-HRP与NDV-NP蛋白的结合水平；a为1-48孔血清的检测结果，b为49-96孔血清的检测结果；

图9为所述的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1的图谱；

图10为所述的辅助质粒psPAX2的图谱；

图11为所述的辅助质粒pMD2.G的图谱。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供一种表达抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白的细胞系，命名为人胚肾转化细胞HEK293T-NDV-Nb5-HRP，所述细胞系在中国典型培养物保藏中心的保藏号为C201981；保藏单位地址：湖北武汉，武汉大学，保藏时间为2019.05.29。

本发明还提供一种所述的表达抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白的细胞系的构建方法，包括以下步骤：

a：合成编码抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体与HRP融合基因：将编码新城疫病毒NP 蛋白纳米抗体和HRP的核苷酸序列直接融合，中间用柔性序列连接，合成重组融合基因；

b：构建用于表达所述重组融合基因的重组慢病毒载体：将所述重组融合基因经酶切后，连接到慢病毒载体上，得到重组慢病毒载体；其中，慢病毒载体为 pLVX-IRES-ZsGreen1；

c：重组慢病毒载体的包装：将所述重组慢病毒载体及2个辅助质粒转染至培养的 HEK-293T细胞中，传代培养，筛选获得表达抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体与HRP融合蛋白的细胞系。

一个优选方案中，所述新城疫病毒NP蛋白纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示，所述HRP的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一个优选方案中，所述辅助质粒为psPAX2和pMD2.G。

本发明还提供一种表达抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白的细胞系是由所述的构建方法构建。

本发明还提供一种抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白由所述细胞系分泌表达。

本发明还提供一种所述的抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白在新城疫抗体测中的应用。

本发明还提供一种所述的抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白在抗新城疫病毒阳性鸡血清检测中的应用。

本发明提供的抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体，具体为抗新城疫病毒LaSota株NP蛋白纳米抗体，命名为Nb5，是由122个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ NO.3所示；辣根过氧化物酶，即HRP有310个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ NO.4所示。

实施例1

1、表达抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合蛋白的细胞系的构建

1.1重组慢病毒载体的构建和包装

1.1.1合成编码抗新城疫病毒NP蛋白Nb5－HRP融合蛋白的基因序列

依据编码抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示和HRP 的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，由苏州金唯智生物技术公司直接合成，中间用柔性序列(AGTAGTAGTGGCAGTGGT)进行连接，并在融合基因的羧基端加入His标签(CATCACCACCATCAC)，易于后续检测；同时在重组融合基因的5’和3’端加入EcoR I和BamH I酶切位点，便于重组载体的构建，合成基因NDV-Nb5-HRP连入pUC57载体中，酶切去除EcoR I酶切位点GAATTC和BamH I酶切位点GGATCC之后进行鉴定。

图1为合成NDV-Nb5-HRP融合基因后的酶切鉴定结果，结果显示，酶切后获得1123bp 片段，证明成功合成抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体－HRP融合基因。

1.1.2重组慢病毒载体的构建

将1.1.1合成的重组融合基因产物以及慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1(如图9所示，购自Clontech公司)同时用EcoR I和BamH I进行双酶切，然后利用T4连接酶，将酶切的重组融合基因产物连接至慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1中，转化至DH5α感受态细胞(TransGen Biotech)，按照其操作说明，进行重组质粒的转化。利用质粒提取试剂盒 (TransGen Biotech)，按试剂盒操作说明提取质粒并进行酶切鉴定和测序。

测序正确的重组慢病毒载体载体命名为PLVX-NDV-Nb5-HRP-IRES-ZsGreen1。

1.1.3重组慢病毒载体的包装

HEK-293T细胞采用含有10％小牛血清的DMEM培养基进行培养，将HEK-293T细胞铺至6孔板，1×10⁵个细胞/孔，待细胞汇合度达到70％左右，将构建的重组慢病毒载体PLVX-NDV-Nb5-HRP-IRES-ZsGreen1、辅助质粒psPAX2(图谱如图10所示，购自 Clontech公司)及pMD2.G(图谱如图11所示，购自Clontech公司)按3:2:1比例转染至 6孔板中，转染16h后更换用血清含量为3％的DMEM培养基继续培养48h，观察到绿色荧光，说明包装的重组慢病毒分泌到细胞外的培养基中，此时收集细胞培养上清，其包含重组慢病毒。

1.2慢病毒的转导以及稳定表达细胞系的建立

1.2.1慢病毒转导实验

将培养的HEK-293T细胞铺至6孔板，3×10⁵个细胞/孔，待细胞融合度达到70％左右，将1.1.3制备获得的2mL重组慢病毒接入6孔板中，接种48小时后，荧光显微镜下观察，发现约80％细胞具有荧光，证明慢病毒转导成功，目的基因抗新城疫病毒NP蛋白纳米抗体-HRP(命名为：NDV-NP-Nb5-HRP)成功通过慢病毒转导入细胞中。

1.2.2稳定表达细胞系的建立

a：稳定表达细胞系的构建方法

将上述慢病毒介导转染成功具有绿色荧光的HEK-293T细胞传代至10cm的细胞培养皿中，待密度长至90％左右时，利用流式细胞仪分选表达绿色荧光蛋白的细胞，然后将筛选的具有绿色荧光的细胞采用有限稀释法铺至96孔细胞培养板继续筛选，最后筛选出1 株生长状态良好且具有绿色荧光的细胞株，进行后续鉴定试验；同时所筛选出的细胞株培养的细胞上清采用下述制备的NDVNP蛋白(如实施例2的1.1新城疫病毒LaSota株核衣壳蛋白的表达与纯化)为包被抗原，直接ELISA检测稳筛的细胞系的上清中HRP的活性；上清做不同的倍比稀释后，间接ELISA检测稳筛细胞系分泌的NDV-NP-Nb5-HRP与抗原的特异性结合情况。

b：结果分析

图2为筛选的稳定表达NDV-NP-Nb5-HRP的HEK-293细胞系在荧光显微镜下观测结果，结果显示，筛选出的生产状态良好细胞株在荧光显微镜下观察所有细胞均发绿色荧光，命名筛选的该细胞株为HEK-293T-NDV-Nb5-HRP；

图3为直接ELISA检测稳筛的细胞系的上清中HRP的活性，结果显示，筛选的细胞系分泌表达的抗新城疫病毒NP蛋白Nb5-HRP融合蛋白中，Nb5和HRP仍具有生物活性， Nb5仍具有与NDV-NP蛋白抗原结合的能力抗原结合的能力，并且HRP与底物反应的能力；

图4为间接ELISA检测稳筛细胞系分泌的NDV-NP-Nb5-HRP与抗原的特异性结合水平，其结果显示，筛选的该细胞系分泌的NDV-NP-Nb5-HRP能与抗原的特异性结合，且 NDV-NP-Nb5-HRP效价为1:1000。

1.2.3 Western blotting鉴定建立的细胞系纳米抗体的表达

将筛选的稳定表达细胞系HEK-293T-NDV-Nb5-HRP，以3×10⁵个细胞/孔，铺至6孔细胞板中，培养2天后，收集细胞及其培养上清，采用3000g离心10min，进行SDS-PAGE，并转膜后，按照常规的操作，进行目的蛋白表达的Westernblotting检测。利用抗His标签的单抗为一抗，HRP标记的羊抗鼠的IgG为二抗。

图5为Western blotting检测筛选细胞的细胞裂解液和培养上清中NDV-NP-Nb5-HRP 表达量的结果，其结果表明，在预期72kDa处，出现棕色条带，说明目的蛋白NDV-Nb5-HRP 成功表达并分泌到细胞培养上清中。

实施例2

1、构建细胞系分泌表达NDV-Nb5-HRP的免疫活性鉴定

1.1新城疫病毒LaSota株核衣壳蛋白的表达与纯化

1)新城疫病毒LaSota株NP基因的扩增及构建的重组原核表达载体

以GenBank上公布的NDV LaSota株基因组序列(基因序列号为AF077761)为参考序列，利用Primer 5.0软件进行设计，由西安擎科生物工程股份有限公司合成，其中，

上游引物NDV-NP-F：CGCATATGAGCAGCGTGTTCGATGAAT；

下游引物NDV-NP-R：TACTCGAGGTAACCCCAGTCGGTATC。

新城疫病毒LaSota株疫苗病毒液(购自：青岛易邦NDV的弱毒疫苗，包含LaSota 疫苗株)150μL，利用TRIzol法提取病毒RNA，反转录得到cDNA，然后以此为模板， RT-PCR扩增获得新城疫病毒NP基因，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得扩增NP基因；其中，反转录为20μL体系(以下试剂均购自大连宝生物技术有限公司)，如表1所示：

表1反转录体系(20μL)

反转录条件为50℃，30min，然后85℃，5s，获得cDNA；

PCR扩增体系(PCR扩增的所有试剂购自北京全式金生物技术有限公司)，如表2 所示，

表2 PCR扩增体系

扩增条件为95℃，10min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min，共30个循环； 72℃，10min；12℃终止，4℃保存。

将扩增获得NP基因的PCR产物用EcoR I和Xho I进行双酶切处理，胶回收试剂盒 (TransGen Biotech)回收获得NP基因，pET-28a载体用EcoR I和Xho I进行双酶切处理，与回收获得的NP基因进行连接后，转入DH-5α并均匀涂在含卡那霉素抗性的LB平板上，筛选阳性质粒，重组质粒pET-28a-NDV-NP双酶切，并测序鉴定正确后转入感受态 BL21(DE3)用于表达。

图6a为抗新城疫病毒LaSota株NP基因的扩增结果，结果显示成功获得预期1457bp 大小的片段；图6b为构建的重组原核表达载体的酶切鉴定结果，结果显示获得NP基因和载体pET-28a正确的重组载体。其中，图6a和图6b中：M为核酸Marker；1和2均为扩增的NP基因；3为酶切重组载体获得的NP基因；4为酶切重组载体获得的载体片段。

2)新城疫病毒LaSota株核衣壳蛋白的表达与纯化

将阳性质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)，37℃震荡培养至菌液OD600值达0.6时，用终浓度为1.0mM/L，IPTG 37℃诱导5h，取15mL菌液，6000g离心10min，去上清，加入结合缓冲液重悬沉淀，经超声处理后，6000g离心分离上清与沉淀样品，SDS-PAGE 检测，检测结果如图7a所示，确定重组核衣壳蛋白为可溶性表达。利用抗新城疫病毒的阳性鸡血清，Western blotting检测，其结果如图7b所示，原核表达的NP蛋白具有抗原性。将表达的可溶性NP蛋白，参照QIAGEN纯化试剂盒说明进行蛋白纯化，纯化样品经 SDS-PAGE检测，结果显示蛋白得到很好的纯化。图7a和图7b中M为蛋白Marker；Lane 1为空载体pET-28a对照；Lane 2为诱导表达菌体裂解液；Lane 3为包涵体；Lane 4为超声后上清；Lane 5为纯化的目的蛋白。

1.2分泌表达的NDV-Nb5-HRP与NDV-NP蛋白的反应性检测

将原核表达纯化的NDV-NP蛋白包被ELISA板，包被量为200ng/well，4℃孵育过夜后，200μL封闭液(2.5％脱脂奶粉的PBST)，37℃封闭1小时后，洗涤液PBST洗板3 次，直接加入不同稀释度(1:10-1:10000)的细胞培养上清(包含NDV-Nb5-HRP)，37℃孵育1小时后，直接加入TMB显色，ELISA自动酶标仪OD45nm读数。

如图3所示，结果显示构建的细胞系HEK-293T-NDV-Nb5-HRP，分泌表达的纳米抗体NDV-Nb5-HRP仍保持纳米抗体Nb5与NDV-NP蛋白抗原结合的能力，以及表达的HRP 与底物反应的能力(NP蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，HRP的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)。

实施例3

抗NDV阳性鸡血清阻断NDV-Nb5-HRP与NDV-NP蛋白的抗原结合

将原核表达的NDV-NP蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃孵育过夜，200μL封闭液， 37℃封闭1小时后，将不同稀释度的血清(1:10，1:20，1:40和1:80)加入到ELISA孔中， 37℃孵育1小时后，每孔加入1:1000稀释的细胞培养上清(包含NDV-Nb5-HRP)，37℃孵育1小时后，直接加入TMB显色10分钟后，加入3mol H2SO4终止显色，ELISA自动酶标仪OD45nm读数。

图8a和b为新城疫病毒抗体鸡血清中NDV-NP-Nb5-HRP与NDV-NP蛋白的结合水平，其结果表明，阳性鸡血清培养的中OD450nm值降低，说明抗新城疫病毒的阳性鸡血清可以很好的阻断NDV-Nb5-HRP与NDV-NP蛋白的反应，而阴性血清中OD450nm值不降低，说明抗新城疫病毒的阴性鸡血清不能阻断NDV-Nb5-HRP与NDV-NP蛋白的反应。

综合上述，通过构建携带抗新城疫病毒核衣壳蛋白Nb5-HRP融合蛋白的融合基因的慢病毒载体，并转染至HEK-293T细胞中，构成稳定表达抗新城疫病毒核衣壳蛋白 Nb5-HRP融合蛋白的细胞系；所构建的细胞系经培养的上清液中包含NDV-Nb5-HRP，可直接通过该上清液直接加入阳性鸡血清中，用于检测鸡是否感染新城疫病毒，相比现有技术血清检测技术，避免了制备酶标记的抗鸡的二抗(间接ELISA)或者需要抗NDV核衣壳蛋白的单抗的情况，简化检测过程，并节约成本，可提高检测的效率，在血清检测技术中具有很好的应用前景。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与附图。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 表达抗新城疫病毒融合蛋白的细胞系及其构建方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 461

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgcaggaga cagtacatat gaaataccta ttgcctacgg cagccgctgg attgttatta 60

ctcgcggccc agccggccat ggcccaggtg cagctgcagg agtctggggg aggctcggtg 120

caggctggag ggtctctgag actctcctgt gcagcctctg gatacaagtt tagtcccatg 180

tgtatgggct ggttccgcca ggctccaggg aaggagcgcg agggggtcgc agcgcttgat 240

agtgatggtc tgacaagcta cgcagactcc gtgaagggcc gattcaccat ctccaaagac 300

aacgccaaga acactctcta tctgcaaatg aacagcctga cacctgagga cactgccatg 360

tactactgtg cggcgagacg tagccggtac tgctctcgag tacctgagat ctatggctac 420

tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc tcagcggccg c 461

<210> 2

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcagctga cccccacatt ctacgataac tcttgtccca acgtgtccaa catcgttcgt 60

gacatcatcg tgaatgagct gaggagcgac cctaggatcg ccgccagcat tctgaggctg 120

cacttccacc tggataacac caccagcttt cgtaccgaaa aggacgcttt cggcaacgcc 180

aacagcgctc gtggcttcag cgtgatcgat cgtatgaaag ccgccgtgga aagcgcttgt 240

cccggcacag tgtgactgct tcgtgaatgg ctgcgacgcc tccattttac ttgtgccgat 300

ttattaacca ttgccgccca gcagtccgtg acactggccg gcggacctag ctggagagtg 360

cctctgggtc gtagggattc tttacaagcc tttttagatt tagccaacgc caatttaccc 420

gcccctttct tcactttacc tcagctcaag gacagcttca gaaacgtggg tttaaatagg 480

agcagcgatt tagtggcttt atccggcggc cacacatttg gcaagagcca gtgtcgtttc 540

attatggatc gtctgtacaa tttcagcaac accggtttac ccgaccccac actgaacacc 600

acctatctcc agactttaag aggtttatgc cctttaaacg gcaatctgtc cgctttagtg 660

gatttcgact tacgtacccc cacaatcttc gacaacaaat actacgtgaa tttagaggag 720

cagaagggtt taatccagag cgaccaagaa ctgttttcca gccccgatgc caccgacacc 780

atccctctgg tgaggagctt cgccaactcc acccagacct tcttcaacgc ctttgtggag 840

gccatggatc gtatgggcaa cattacccct ctgaccggca cccaaggtca gattcgtagg 900

aactgtaggg tggtgaatag caacagcgat tta 933

<210> 3

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Ser Pro Met Cys Met Gly

20 25 30

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Leu

35 40 45

Asp Ser Asp Gly Leu Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

50 55 60

Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

65 70 75 80

Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Arg

85 90 95

Ser Arg Tyr Cys Ser Arg Val Pro Glu Ile Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala

115 120

<210> 4

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gln Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Asn Ser Cys Pro Asn Val Ser

1 5 10 15

Asn Ile Val Arg Asp Ile Ile Val Ile Leu Arg Leu His Phe His Asp

20 25 30

Cys Phe Val Asn Gly Cys Asp Ala Ser Ile Leu Leu Asp Asn Thr Thr

35 40 45

Ser Phe Asn Glu Leu Arg Ser Asp Pro Arg Ile Ala Ala Ser Arg Thr

50 55 60

Glu Lys Asp Ala Phe Gly Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Ser Val

65 70 75 80

Ile Asp Arg Met Lys Ala Ala Val Glu Ser Ala Cys Pro Gly Thr Val

85 90 95

Ser Cys Ala Asp Leu Leu Thr Ile Ala Ala Gln Gln Ser Val Thr Leu

100 105 110

Ala Gly Gly Pro Ser Trp Arg Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu

115 120 125

Gln Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe

130 135 140

Thr Leu Pro Gln Leu Lys Asp Ser Phe Arg Asn Val Gly Leu Asn Arg

145 150 155 160

Ser Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Ser

165 170 175

Gln Cys Arg Phe Ile Met Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly

180 185 190

Leu Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Asp Leu Arg Thr Pro

195 200 205

Thr Ile Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr Val Asn Leu Glu Glu Gln Lys Gly

210 215 220

Leu Ile Gln Ser Asp Gln Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asp Ala Thr Asp

225 230 235 240

Thr Ile Pro Leu Val Arg Ser Phe Ala Asn Ser Thr Gln Thr Phe Phe

245 250 255

Asn Ala Phe Val Glu Gln Thr Leu Arg Gly Leu Cys Pro Leu Asn Gly

260 265 270

Asn Leu Ser Ala Leu Val Asp Phe Ala Met Asp Arg Met Gly Asn Ile

275 280 285

Thr Pro Leu Thr Gly Thr Gln Gly Gln Ile Arg Arg Asn Cys Arg Val

290 295 300

Val Asn Ser Asn Ser Asp Leu

305 310