一种冬虫夏草多糖提取物及其制备方法和应用与流程

本发明属于中药材提取领域，涉及中药材多糖提取物的制备，特别是涉及冬虫夏草多糖提取物的制备及其应用。
背景技术：
：冬虫夏草为我国传统的名贵中药材，隶属于子囊菌门(Ascomycota)粪壳菌纲(Sordariomycetes)，肉座菌目(Hypocreales)，线虫草科(Ophiocordycipitaceae)，在我国具有悠久的药用历史，具有补肺益肾、止血化痰的功效。现代化学和药理研究表明，冬虫夏草含有核苷、糖类、甾醇、蛋白质等多类化学成分，具有调节免疫力、缓解肺部疾病、抗肿瘤等药理作用。前期也有文献报告冬虫夏草具有抗肿瘤作用，如文献《虫草多糖的药理作用》[中草药，1985，16(7):18-23]记载虫草多糖浓度为100mg/10g时对小鼠肉瘤S180抑制率为28％～33％；文献《EffectofcordycepssinensisontheproliferationanddifferentiationofhumanleukemicU937cells》[lifesciences,60(25):2349-2359]报道了冬虫夏草多糖浓度为10μg/mL时对人白血病U937细胞抑制率为78％～83％；也有部分研究是针对冬虫夏草粗提取液的抗肿瘤活性，如专利《一种抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物及其制备方法和应用》(申请号：CN201611221881.5)公开了鲜冬虫夏草水提取物在浓度为0.25～3mg/mL时对乳腺癌细胞MDA-MB-453的抑制率为39.0％～86.7％。多糖广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，是一类天然高分子化合物，真菌多糖是一类从真菌的子实体、菌丝体或发酵液中分离出来的，有些真菌多糖具有抗病毒、抗凝血、抗肿瘤、免疫调节、降血脂等多种生物活性。然而，由于真菌多糖提取过程中受到蛋白、色素脱除的影响，而且，还存在提取纯度差、稳定性不高，如多糖本身的高极性、挥发难、热不稳定性、分子量高等特点，使得真菌多糖的提取存在诸多难题。目前，对于具有较高抗肿瘤活性的冬虫夏草多糖提取物存在着很大的需求。技术实现要素：本发明提供了一种冬虫夏草多糖提取物的制备方法，提供了经这样的制备方法制备的具有较高抗肿瘤活性的冬虫夏草多糖提取物，还提供了这样的冬虫夏草多糖提取物在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。本发明的冬虫夏草多糖提取物是经脱蛋白并且脱色素的多糖提取物，对癌细胞具有较好的抑制活性，尤其是对血癌K-562细胞有良好的抑制活性。第一方面，本发明提供了一种冬虫夏草多糖提取物的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)将冬虫夏草用水加热提取得到提取物，并用水洗脱获得水提物；(2)向步骤(1)中获得的水提物中加入乙醇进行醇沉得到醇沉粗多糖；(3)将步骤(2)获得的醇沉粗多糖溶于水中得到粗多糖溶液，之后按照粗多糖溶液与sevag试剂的体积比为3:1～5:1加入sevag试剂进行脱蛋白，得到脱蛋白后的粗多糖；以及(4)将步骤(3)获得的脱蛋白后的粗多糖用大孔树脂进行脱色素。优选地，所述方法包括如下步骤：(1)将冬虫夏草用水在80℃-100℃下加热提取得到提取物，并用水洗脱获得水提物；(2)向步骤(1)中获得的水提物中加入乙醇进行醇沉得到醇沉粗多糖；(3)将步骤(2)获得的醇沉粗多糖按照料液比1:18～1:22(g/mL)溶于水中得到粗多糖溶液，之后按照粗多糖溶液与sevag试剂的体积比为3:1～5:1加入sevag试剂进行脱蛋白，得到脱蛋白后的粗多糖；以及(4)将步骤(3)获得的脱蛋白后的粗多糖用大孔树脂进行脱色素。优选地，所述步骤(1)中，加热提取为回流提取，加热提取的料液比为1:8-1:12(kg/L)，提取2-4小时；优选地，所述加热提取后的残渣继续按照料液比为1:8-1:12(kg/L)进行回流提取2-3次，每次提取2-4h，合并提取液。优选地，在步骤(1)得到提取物之后将提取物用大孔树脂吸附并用水洗脱获得水提物。优选地，所述步骤(2)中水提物为料液比为1:3-1:6(g/mL)的水提物水溶液；所述步骤(2)中乙醇为无水乙醇，所述无水乙醇与水提物水溶液的体积比为3:1-5:1。优选地，所述步骤(2)中水提物为料液比为1:5(g/mL)的水提物水溶液；所述步骤(2)中乙醇为无水乙醇，所述无水乙醇与水提物水溶液的体积比为4:1。优选地，所述步骤(2)中醇沉在室温下进行，醇沉时间大于8小时。优选地，所述步骤(3)中粗多糖溶液与sevag试剂的体积比为4:1。优选地，在步骤(4)之前重复进行步骤(3)直至离心后的水相层与有机相间无蛋白层，得到脱蛋白后的水相层溶液作为脱蛋白后的粗多糖，具体而言，重复如下步骤：向所述粗多糖溶液中加入sevag试剂，充分震荡后离心，取水相层并重复进行脱蛋白操作直至离心后的水相层与有机相间无蛋白层，得到脱蛋白后的水相层溶液即为脱蛋白后的粗多糖；优选地，所述脱蛋白后的水相层溶液中进一步加入4-5倍体积的无水乙醇，醇沉后离心得脱蛋白后的粗多糖。优选地，在所述步骤(3)中，向脱蛋白后的水相层溶液中边搅拌边缓慢加入4-5倍体积的无水乙醇，在4℃，醇沉过夜，然后5000rpm离心10分钟，得脱蛋白粗多糖(DPCSP)。优选地，在所述步骤(4)中，大孔树脂为AB-8大孔树脂，D-941大孔树脂，D-113大孔树脂，或D-101大孔树脂；更优选地，在所述步骤(5)中，大孔树脂为AB-8大孔树脂。优选地，所述步骤(4)为：将步骤(3)中获得的脱蛋白后的粗多糖加到AB-8大孔树脂柱上，用水洗脱得洗脱液，浓缩，并用2kDa透析袋纯水透析，得到透析后的透析袋内溶液；优选地，所述透析袋内溶液进一步冷冻干燥得到脱色素粗多糖(DCCSP)。优选地，本发明提供了一种冬虫夏草多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：(1)将粉碎的冬虫夏草用水回流提取2-4小时，提取的料液比为1:8-1:12(kg/L)；优选地，所述回流提取后的残渣继续按照料液比为1:8-1:12(kg/L)进行回流提取2-3次，每次提取2-4h，合并提取液；将提取液浓缩得到提取物，用HP-20大孔树脂吸附并用水洗脱，洗脱液浓缩、冷冻干燥后获得水提物；(2)将步骤(1)中获得的水提物按照料液比1:3～1:6(g/mL)溶于水中得到水提物水溶液；然后加入无水乙醇进行醇沉得到醇沉粗多糖，其中所述无水乙醇与水提物水溶液的体积比为3:1-5:1；(3)将步骤(2)获得的醇沉粗多糖按照料液比1:18～1:22(g/mL)加入水中得到粗多糖溶液，之后按照粗多糖溶液与sevag试剂的体积比4:1加入sevag试剂进行脱蛋白，具体操作为：向所述粗多糖溶液中加入sevag试剂，充分震荡后离心，取水相层并重复进行脱蛋白操作直至离心后的水相层与有机相间无蛋白层，得到脱蛋白后的水相层溶液即为脱蛋白后的粗多糖；优选地，所述脱蛋白后的水相层溶液中进一步加入4-5倍体积的无水乙醇，醇沉然后离心得到脱蛋白后的粗多糖；以及(4)将步骤(3)获得的脱蛋白后的粗多糖加到AB-8大孔树脂柱上，用水洗脱得洗脱液，浓缩，并用2kDa透析袋纯水透析得到透析后的透析袋内溶液；优选地，所述透析袋内溶液进一步冷冻干燥得到脱色素粗多糖(DCCSP)。优选地，本发明提供了一种冬虫夏草多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：(1)将粉碎的冬虫夏草用水回流提取2-4小时，提取的料液比为1:8-1:12(kg/L)，所述回流提取后的残渣继续按照料液比为1:8-1:12(kg/L)进行回流提取2-3次，每次提取2-4h，合并提取液；将提取液浓缩得到提取物，用HP-20大孔树脂吸附并用水洗脱，洗脱液浓缩、冷冻干燥后获得水提物；(2)将步骤(1)中获得的水提物按照料液比1:5(g/mL)溶于水中得到水提物水溶液；然后加入无水乙醇进行醇沉得到醇沉粗多糖，其中所述无水乙醇与水提物水溶液的体积比为4:1；(3)将步骤(2)获得的醇沉粗多糖按照料液比1:20(g/mL)加入水中得到粗多糖溶液，之后按照粗多糖溶液与sevag试剂的体积比4:1加入sevag试剂进行脱蛋白，具体操作为：向粗多糖溶液中加入sevag试剂后充分震荡后离心，取水相层并重复进行脱蛋白操作直至离心后的水相层与有机相间无蛋白层，得到脱蛋白后的水相层溶液；所述脱蛋白后的水相层溶液中进一步加入4-5倍体积的无水乙醇，在4℃醇沉然后5000rpm离心10min得到脱蛋白后的粗多糖；以及(4)将步骤(3)获得的脱蛋白后的粗多糖加到AB-8大孔树脂柱上，用水洗脱得洗脱液，浓缩，并用2kDa透析袋纯水透析得到后的透析袋内溶液，所述后的透析袋内溶液进一步冷冻干燥得到脱色素粗多糖(DCCSP)。第二方面，本发明提供了一种由本发明所述方法制备得到的冬虫夏草多糖提取物。第三方面，本发明提供了一种冬虫夏草多糖提取物，其总糖含量为85％-90％，包含低分子量多糖和高分子量多糖，所述低分子量多糖为平均分子量为6.5kDa-7.0kDa的多糖，以质量计占总糖的大约75％，所述高分子量多糖的平均分子量大于670kDa，以质量计占总糖的大约25％。优选地，所述冬虫夏草多糖提取物中低分子量多糖的平均分子量为6.86kDa。优选地，所述冬虫夏草多糖提取物经凝胶色谱分析显示在保留时间9.610分钟，12.225分钟和17.705分钟共显示三个峰，分别对应分子量大于670kDa占3.328％；分子量大于670kDa占21.849；以及分子量为6.86kDa占74.829％。第四方面，本发明提供了由本发明的方法制备的冬虫夏草多糖提取物或本发明所述的冬虫夏草多糖提取物在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。优选地，所述肿瘤为乳腺癌，淋巴癌，血癌，黑色素瘤，结肠癌和肺癌。优选地，所述肿瘤为乳腺癌MDA-MB-453，淋巴癌Raji，血癌K-562和黑色素瘤SK-MEL-28。本发明中所述“料液比”指投料量与所用溶剂量的比值。如本发明步骤(1)提取中料液比为1:8-1:12(kg/L)，表示冬虫夏草与提取溶剂水的比例为1:8-1:12(kg/L)，即表示当对1kg冬虫夏草用水进行提取时，所用水的体积为8L-12L。另外如水提物为料液比为1:3-1:6(g/mL)的水提物水溶液，则表示浓缩后不含溶剂的水提物与溶剂水的比例为1:3-1:6(g/mL)混合得到的水提物水溶液，即表示当对1g水提物用水溶解制成水溶液时，所用水的体积为3mL-18mL；本发明所述的sevag试剂为氯仿与正丁醇按照体积比4:1(mL:mL)混合后的溶液。本发明中所述“大约”表示一个近似的数值或范围，比如本发明中“以质量计占大约75％”表示低分子量多糖质量占总多糖提取物质量比例大约75％，即在75±5％范围内都属于“大约75％”定义的范围，比如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％/78％。、79％、80％的范围都属于“大约75％”的范围；优选地，在75±3％范围内都属于“大约75％”定义的范围。同样，“以质量计占大约25％”表示高分子量多糖质量占总多糖提取物质量比例大约25％，即在25±5％范围内都属于“大约75％”定义的范围；优选地，在25±3％范围内都属于“大约25％”定义的范围。本发明的冬虫夏草多糖提取物的制备方法操作简单、方便，获得的多糖提取物总糖含量高，活性高。D113阳离子交换树脂是一种大孔型弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂，在其交联丙烯酸骨架中含有羧酸功能基(-COOH)。该树脂主要用于工业水处理，也可以用于工业废水处理，金属回收、生化药物的分离和提纯。D941阴离子交换树脂该树脂是大孔结构的丙烯酸甲酯共聚交联高分子聚合物，通过多乙烯多胺进行胺解得到的多胺基弱碱性离子交换树脂，主要用于糖类等食品工业中的精制脱色，甜菊糖、人参皂苷、三七皂苷、抗生素等天然药物的脱色精制。D101树脂是一种球状、非极性聚合物吸附剂。该树脂是一个交联苯乙烯-二乙烯苯共聚物。基于适宜的孔径和比表面，该树脂对皂甙和黄酮有特殊的选择性。该树脂适于从水溶液中提取皂甙、黄酮类和某些有机物。AB-8树脂是一种球状、聚苯乙烯型弱极性吸附树脂(注释：该树脂表面有一定的酯基，原标为弱极性；但吸附机理仍为疏水性，现定为非极性)。该树脂是一种交联聚合物，它与早期的憎水吸附剂不同，在其骨架结构中附加了弱亲水基团；又与一般离子交换树脂不同，在其结构中仅有非离子化功能基。该树脂的比表面积和孔径较大，适合于吸附各类具有一定疏水性的中药成分，吸附量较大，洗脱容易，吸附动力学性能良好。对热、有机溶剂和一般使用条件下的酸、碱稳定，因此使用寿命较长。对蛋白、糖类、无机酸、碱、盐、小分子亲水性有机物均不吸附，因而可将一般中药成分与这些物质分离。最适宜水溶性、具有弱极性物质的提取、分离、纯化。附图说明图1为获得的冬虫夏草多糖提取物DCCSP的凝胶色谱图。具体实施例以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。本发明实施例中干冬虫夏草药材来源于宜昌山城水都冬虫夏草有限公司。实施例1.试剂与耗材表1：2.仪器与设备表2：实施例1冬虫夏草多糖的提取：(1)醇沉将15Kg干冬虫夏草药材粉碎，热水回流提取，每次用120L水共提取3次，每次提取2h。合并提取液，浓缩，将提取液用HP-20大孔树脂吸附，用水洗脱，洗脱液浓缩、冷冻干燥获得冬虫草夏草水提物固体。将300g冬虫夏草水提物固体置于5L烧杯中，加入1500mL水，60℃水浴溶解，冷却，得料液比为1:5(g/mL)的虫草水提物溶液。将虫草水提物溶液等量分装到2个5L量杯中，分别加入4倍体积无水乙醇，用保鲜膜封口，室温下醇沉过夜。然后，以3000g离心力离心30分钟，合并醇沉物，80℃水浴加热挥干乙醇，获得醇沉粗多糖46.5g。(2)Sevag脱蛋白将醇沉粗多糖溶于1L水中，80℃水浴溶解，将溶液分装到离心杯中，按4:1(样品：sevag试剂，V/V)加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4:1，V/V)，振荡30分钟，4000rpm离心10分钟，离心之后溶液分为三层，从下往上依次为有机层、蛋白层和水相层，取水相层，重复这个脱蛋白步骤11次，直至水相与有机相间无明显蛋白层。向脱蛋白后的水相层溶液中缓慢加入4倍体积的无水乙醇，边加边搅拌，然后在4℃醇沉过夜，5000rpm离心10分钟，获得脱蛋白粗多糖(DPCSP)。(3)脱色素分别称取预处理并抽滤后的大孔树脂D113、D941、D101和AB-8约2g于烧杯中，各加入10mL多糖溶液(将上述步骤(2)获得的脱蛋白粗多糖溶于600mL水中所得)，120次/分钟振荡3小时，离心后取5mL上清液于比色管中，选择吸附后上清液颜色最浅的大孔树脂进行后续试验。颜色深度为D113>D941>D101>AB-8。因此，在本实施例中采用AB-8大孔树脂。将步骤(2)获得的脱蛋白粗多糖溶于600mL水中，将多糖溶液加到AB-8大孔树脂柱(5.0×55cm)上，用水洗脱至洗脱液与苯酚硫酸不显色，合并洗脱液，浓缩，浓缩物用2kDa透析袋纯水透析得到透析后的透析袋内溶液，将该透析袋内溶液冷冻干燥，得脱色素粗多糖(DCCSP)粉末。苯酚硫酸法测定DCCSP的总糖含量为87.42％。实施例2脱色素粗多糖(DCCSP)抗肿瘤实验：(1)细胞培养：将血癌K-562细胞、乳腺癌MDA-MB-453细胞、淋巴瘤癌Raji细胞和结直肠癌COLO205细胞置于DMEM培养基中，将黑色素瘤SK-MEL-28细胞置于RPMI-1640(RoswellParkMemorialInstitute-1640)培养基中，然后均放置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。每日倒置显微镜观察细胞1次，隔2天换培养液一次。培养瓶中的细胞生长到85％～95％融合时进行细胞传代。弃去旧培养液，PBS反复冲洗2次，加入0.25％胰酶消化液(HL-60除外)2mL，细胞变圆﹑上浮后，加入4mL培养液终止消化，再转移至15mL无菌离心管中，1000r/分钟离心4分钟，弃上清液，以1:4比例转移至新的无菌培养瓶中培养。(2)药物配制：分别准确称取实施例1制备得到的脱色素粗多糖(DCCSP)粉末至培养基中，配制成6mg/mL的溶液，以该浓度为初始终浓度，按照3倍稀释成一系列梯度浓度，共设9个浓度点，然后经0.22μm无菌滤器过滤除菌。(3)活性检测：收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度至合适浓度，接种96孔板。在37℃，5％CO2条件下孵育24小时后。按100μL/孔分别加入脱色素粗多糖(DCCSP)。然后，置于37℃，5％CO2培养箱中，孵育72小时。加入10％CCK-8(细胞计数试剂盒-8)试剂，置于37℃培养箱中孵育1-2小时，酶标仪450nm处检测各孔的吸光度(A)值，数据处理软件分别计算各药物在72小时的IC50值(mg/mL)。结果如下表所示：表3：药物对肿瘤细胞的IC50值细胞DCCSP(mg/mL)RAJI0.1993K-5620.754COLO2051.586MDA-MB-4530.013SK-MEL-281.167实施例3脱色素粗多糖(DCCSP)分子量分布测定方法(1)溶液制备：20mM乙酸铵：称取乙酸铵1.54g，加水1000mL溶解，过滤，超声脱气。系列葡聚糖对照品溶液：取适量不同分子量(1、5、12、25、50、80、150、410、670kDa)的葡聚糖对照品配制成1mg/mL的溶液，过0.45μm膜。DCCSP溶液：取适量DCCSP配制成2mg/mL溶液，过0.45μm膜。(2)凝胶色谱分析：色谱柱：TSKgelG5000PWXL(7.8mm×30cm，10μm)及保护柱TSKgelguardcolumnPWXL(6.0mm×4cm)；流动相：20mM乙酸铵，等度洗脱；流速：0.6mL/min；柱温：室温；进样量：20μL；蒸发温度：30℃；漂移管温度：30℃；载气：空气，流速1.60SLM；增益值：1.0。(3)数据处理：以葡聚糖分子量的对数值对保留时间进行线性回归分析，得分子量校正曲线。根据供试品溶液中各色谱峰的保留时间，由校正曲线求得相应的分子量。以面积归一化法计算各组分在被分析色谱峰所占的比例。(4)结果：以系列葡聚糖分子量的对数值为纵坐标，保留时间为横坐标进行回归分析，得回归方程y＝-0.4218x+11.304，R2＝0.9762。由图1可看出，DCCSP由三个主要部分组成，通过回归方程可算出，峰1、2分子量均大于670kDa，峰3分子量为6.86kDa。通过归一化法得出峰1、2和3的比例为3.328％、21.849％和74.829％。表4-多糖DCCSP保留时间(min)及分子量(Da)峰名称保留时间分子量占比％19.610>670kDa3.328212.225>670kDa21.849317.7056.86kDa74.829当前第1页1 2 3