植物生产口服索玛鲁泰（Semaglutide）与蚓激酶的融合蛋白降糖胶囊的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及植物生产口服索玛鲁泰(Semaglutide)与蚓激酶的融合蛋白降糖胶囊的应用。

背景技术：

糖尿病是以慢性高血糖为特征的常见病、多发病，是由体内胰岛素分泌或作用缺陷，或二者同时存在而引起的糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱。临床上主要有胰岛素依赖型(IDDM，I型)和非胰岛素依赖型(NIDDM，II型)两种类型。随着生活水平提高，无论在发达国家还是在发展中国家，糖尿病的发病率都在逐年上升。糖尿病作为一种严重的非传染性慢性疾病现已成为全世界各国密切关注的重大公共卫生问题之一，是全球范围内继心血管和肿瘤疾病之后的第三号杀手。从世界卫生组织公布的数据来看，1995年全球糖尿病患者仅3000万人左右，而到了1997年已增至1.35亿，到2030年将有3亿II型糖尿病患者，患者增幅最快的地区为亚洲和非洲。II型糖尿病患者的传统治疗模式一般是遵循饮食控制、口服抗糖尿病药物和外源性胰岛素的阶梯式治疗。但目前糖尿病治疗领域仍存在着诸多尚待解决的重要问题，而且还存在一些副作用和限制。

胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是由肠道内分泌细胞分泌的肠降血糖素，是胰高血糖素原基因翻译后加工产物，在体内有多种存在形式。它具有以下生理作用：以葡萄糖依赖方式作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录，增加胰岛素的生物合成和分泌；刺激β细胞的增殖和分化，抑制β细胞凋亡，从而增加胰岛β细胞数量，抑制胰高血糖素的分泌，抑制食欲及摄食，延缓胃内容物排空等。这些功能都有利于降低餐后血糖并使血糖维持在恒定水平。

尽管天然GLP-1在治疗糖尿病上有诸多优点，但它的体内半衰期仅为2分钟左右，限制了其在临床上的直接应用。而将天然的GLP-1中的某些氨基酸突变后可以在保证其活性的条件下延长它的半衰期，做到每周一次给药就可以保持正常的血糖水平。目前已经上市的相关产品有Liraglutide、Dulaglutide、Semaglutide等。由于多肽类药物本身的性质以及人体对其产生的各种屏障，其常规给药途经一直以注射为主。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了植物生产口服杜拉鲁肽与纳豆激酶降糖胶囊的应用。本发明利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白。并且制成口服降糖胶囊。因此，提供一种治疗糖尿病的口服制剂具有重要的现实意义。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了索玛鲁泰(Semaglutide)与蚓激酶的融合蛋白，其具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。

本发明还提供了编码所述融合蛋白的核苷酸，具有

(Ⅰ)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

(Ⅱ)、如SEQ ID 2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或

(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。

本发明还提供了表达载体，包括所述的核苷酸以及待转化载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述待转化载体为叶绿体表达载体。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的表达载体的构建方法，包括如下步骤：

步骤1：分别将所述索玛鲁泰(Semaglutide)与蚓激酶的融合蛋白的密码子优化为植物偏好的密码子，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

步骤2：将所述核苷酸序列克隆到pUC57载体中，获得pUC57-sem(索马鲁肽以及蚓激酶的融合蛋白)。

本发明还提供了所述的表达载体或植物在表达索玛鲁泰(Semaglutide)与蚓激酶的融合蛋白或制备包含所述融合蛋白的药物中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物为口服降糖制剂。

此外，本发明还提供了宿主，转化有所述表达载体的植物或微生物；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

本发明还提供了药物，包括所述的融合蛋白以及药学上可接受的辅料。

在本发明的一些具体实施方案中，所述药物为口服降糖制剂。

此外，本发明还提供了一种植物作为宿主表达索玛鲁泰(Semaglutide)与蚓激酶的融合蛋白的方法，将所述的表达载体用基因枪轰击叶片，在植物叶绿体中表达后获得再生植株，将植物叶片冻干粉碎灌装胶囊，制成降糖胶囊。

在本发明的一些具体实施方案中，所述基因枪轰击包括如下步骤：

步骤1：准备转化用载体；

步骤2：准备微粒子弹；

步骤3：基因枪轰击；

步骤4：转换后培养、再生为植株。

植物叶绿体表达技术是利用基因枪轰击、同源重组的方式将含有目标蛋白的质粒转移到植物叶绿体中，获得该基因植物叶绿体中高效表达的技术。与动物细胞表达系统相比，植物表达系统的成本非常低，仅为其千分之一到千分之二。

本发明将索玛鲁泰(Semaglutide)与蚓激酶融合表达，同样实现在口服给药，减轻病患长期频繁注射带来的痛苦。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示载体pUC57-sem示意图；

图2示western-blot结果；其中，泳道1示非表达植株；泳道2示生菜生产索玛鲁泰(Semaglutide)与蚓激酶融合蛋白。

具体实施方式

本发明公开了一种植物生产口服杜拉鲁肽与纳豆激酶降糖胶囊的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了植物作为宿主在表达索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白的应用。优选的，所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。本发明还提供了一种表达载体，包括索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白序列以及载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白密码子优化为植物偏好的密码子。

在本发明的一些具体实施方案中，所述优化的索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白序列如SEQ ID No.1所示；所述优化的索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在本发明的一些具体实施方案中，所述载体为植物叶绿体载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：

步骤1：将索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白的密码子优化为植物偏好的密码子；

步骤2：由金斯瑞进行基因合成克隆到pUC57载体中，获得pUC57-sem克隆载体；

具体的，为了提供外源蛋白在植物中的高效表达，本发明将索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。并由金斯瑞克隆到pUC57载体中，获得pUC57-sem载体(图1)。

本发明还提供了所述的表达载体在表达索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白中的应用。

将本发明提供的表达载体用基因枪轰击植物叶片，再生为植株后收获植物叶片并制成口服降糖胶囊。

本发明对具有降糖作用的活性多肽进行结构改造和修饰，使其获得可通过肠道进行吸收并在体内达到有效治疗浓度的特性，并通过植物来生产该活性物质本发明通过实验发现，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台，叶绿体可以高效的表达活性蛋白。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其它植物，如烟草等更容易获得并且更便宜，并且由于不需要复杂的特殊生产设备，成本可显著降低。综上所述，本发明可以利用生菜系统大规模生产索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白。

本发明利用植物叶片，生产口服降糖胶囊。该降糖产品不需要注射，减轻病患的痛苦，同时这一产品为长效降糖产品，病患可以做到一周用药一次。生菜不含有植物有毒物质，而且本产品不需蛋白纯化流程，可以大大缩短生产周期和生产成本。

本发明提供的植物作为宿主在表达索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1叶绿体表达载体的构建

为了将外源蛋白在植物中的高效表达，将Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。

实施例2转化材料准备

将植物种子用无菌水浸泡过夜，用70％乙醇浸泡1分钟后用无菌水冲洗1次；再用2％NaClO(加0.1％Tween-20)处理15分钟，每5分钟轻柔混匀1次，无菌水冲洗4-5次；用无菌滤纸吸干后种植于1/2MS培养基上(含3％蔗糖、0.7％琼脂粉、pH值为5.8)，置于光照培养箱中25℃，16h光照8h黑暗培养，约3周可用于转化。

实施例3基因枪准备

称取50-60mg金粉(0.6μm)于干燥的1.5mL灭菌EP离心管。加入1mL无水乙醇，涡旋2分钟。加入1mL无菌水，涡旋1分钟，室温放置1分钟，10,000rpm离心2分钟，去上清。加入1mL 50％甘油，重悬金粉，-20℃冻存。

甘油保存状态的金粉悬液涡旋5分钟使金粉重悬。取50μL金粉悬液于无菌1.5mL离心管，涡旋1分钟。加入10μg质粒DNA，涡旋30秒。加入50μL 2.5M CaCl2，涡旋30秒。加入20μL 0.1M亚精胺，混合物涡旋5分钟，冰上静置2分钟。加60μL预冷的无水乙醇，手指轻弹使之重悬，14,000rpm离心10秒，去上清，重复一次。加入50μL无水乙醇重悬，备用。

实施例4基因枪轰击

根据样品数量取一定数量的载体膜、可裂膜、阻挡网(注意：载体膜、可裂膜需每枪更换，阻挡网同一个样品可共用)于无水乙醇中浸泡15分钟，用无菌水冲洗2次，自然晾干，备用。将晾干的载体膜放入无菌铁环中，压平。将制备好的子弹涡旋充分混匀，取10μL子弹于载体膜中央，自然晾干。把微粒发射装置移出轰击室，旋下盖子，加入阻挡网，把微粒载片安装在固定槽中(有微粒的一面朝下)，旋上盖子，将微粒发射装置放回轰击室。

实施例5转化后培养及筛选

1.暗培养：将轰击后的生菜叶片剪下，切成10～20mm2的叶盘置于RMOL培养基(不加抗生素)中25℃暗培养2天。

2.筛选培养：将暗培养结束的材料转移至筛选培养基(抗生素浓度为50μg/mL)中进行筛选培养。

3.生根培养：将芽转移至生根培养基(抗生素浓度为100μg/mL)中诱导生根。

实施例6 Western blot检测目的蛋白表达情况

采用液氮研磨、变性裂解提取植物蛋白，将裂解上清和5×上样缓冲液(使用前加入β-巯基乙醇至终浓度为5％)按4:1的比例混合(如200μl蛋白裂解上清与50μl 5×上样缓冲液混合)，混匀，95℃加热6min，同时处理阴性对照及阳性对照；电泳电压积层胶80V，分离胶120V，待目的蛋白跑至分离胶中间位置后，停止电泳，回收下槽电泳液，拆开电泳装置，按照负极(黑色)、海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜(事先用甲醇活化15s、ddH2O洗涤后浸泡于1×转移缓冲液中)或NC膜(不需活化)、滤纸、海绵、正极(透明)的顺序放置，排气泡后组装，放入电泳槽(注黑色对应电泳槽黑色一面放入)，加满转移缓冲液，将整个电泳槽放入冰水混合液中，90V电泳1.0h；电泳快结束时配制5％脱脂奶粉(封闭液)，将转移后的膜放入封闭液中室温封闭至少1h，4℃孵育一抗过夜(一抗稀释于5％脱脂奶粉中，稀释比参考说明书)；使用PBST或TBST洗涤15min×3次，室温孵育二抗1～2h，PBST或TBST洗涤15min×3次，采用DAB试剂盒进行显色，拍照，凝胶显示蛋白大小为32kDa，与预期的索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白分子量大小一致，证明我们成功的表达并且纯化出来目的融合蛋白。

实施例7 Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白活性检测

在持续七周的稳定期后，将狗随机分为三个治疗组，每组10只，分别接收含有降糖蛋白(本发明实施例5制得的索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白)及不含降糖蛋白两种实验胶囊中的一种，商业用索玛鲁泰Semaglutide(按照体重喂食500ng/g)作为阳性对照，将狗随机分组，接受相同的实验饮食在每次重复结束后检测血糖反应。

在血糖检测开始前，狗禁食24小时。剃去导管插入部位的毛，无菌处理，导管插入右头静脉。大约间隔5分钟采集两基线样品。在采集最后一个基线样品后，立即给狗喂相当其体重1％的饮食并含有1片或3片降糖胶囊，至多允许其吃15分钟。如果在15分钟内狗不吃实验饮食，则当天不检测其血糖反应，次日重新检测。在进食后10、20、30、45、60、120、180和240分钟，采集额外的血液样品。血液样品1300×g离心15分钟，在采集后两小时内将每个时间点1ml血浆之两等分样品冻存。应用己糖激酶方法测定血浆葡萄糖浓度(mg/dl)。重复3次，收集的实验数据为平均值±SD，阳性对照组为商业用Semaglutide。

表1狗血液中糖浓度的实验结果

注：^*示与无降糖对照组比较具有显著差异(P＜0.05)；^**示与无降糖对照组比较具有极显著差异(P＜0.01)；

实验结果显示，比起商业用索玛鲁泰Semaglutide，含有索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白胶囊显著降低狗血糖含量(P<0.001)。经过2小时后，口服3颗融合蛋白胶囊狗血糖浓度检测为3.4±0.018mmol/L，而口服3次商业用索玛鲁泰Semaglutide的狗血糖浓度为4.1±0.011mmol/L。说明融合蛋白比起商业用索玛鲁泰Semaglutide更抵抗胃酸的分解，从而容易进入血液当中讲解血糖。

实施例8动物毒性试验

将7周大小的实验用小白鼠随机分为三个治疗组，每组10只，分别接收含有降糖蛋白(按照体重喂食500ng/g)(本发明得到的索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白)，商业用索玛鲁泰Semaglutid(按照体重喂食500ng/g)作为阳性对照，及不含降糖蛋白两种实验胶囊中的一种，接受相同的实验饮食。连续喂食10天，每次喂食后实进行观察，每天需要连续观察6小时以上，并没有看小鼠处于兴奋状态还是抑制状态，没有出现行动迟缓等现象，也没有出现腹泻等情况。证明索玛鲁泰Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白胶囊口服安全性高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 王跃驹

<120> 植物生产口服索玛鲁泰（Semaglutide）与蚓激酶的融合蛋白降糖胶囊的应用

<130> MP1902781

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 301

<212> PRT

<213> 索玛鲁泰(Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白Fusion protein of Semaglutide and lumbrokinase)

<400> 1

Met His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu

1 5 10 15

Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg His

20 25 30

Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln

35 40 45

Ala Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asp Gly Arg Gly Ile Val

50 55 60

Gly Gly Ile Glu Ala Arg Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gln Val Ser Val

65 70 75 80

Arg Arg Lys Ser Ser Asp Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Ile Ile Asn

85 90 95

Asp Arg Trp Val Val Cys Ala Ala His Cys Met Gln Gly Glu Ser Pro

100 105 110

Ala Leu Val Ser Leu Val Val Gly Glu His Asp Ser Ser Ala Ala Ser

115 120 125

Thr Val Arg Gln Thr His Asp Val Asp Ser Ile Phe Val His Glu Asp

130 135 140

Tyr Asn Gly Asn Thr Phe Glu Asn Asp Val Ser Val Ile Lys Thr Val

145 150 155 160

Asn Ala Ile Ala Ile Asp Ile Asn Val Gly Pro Ile Cys Ala Pro Asp

165 170 175

Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr Arg Lys Ser Gln Cys Ser Gly Trp Gly

180 185 190

Thr Ile Asn Ser Gly Gly Val Cys Cys Pro Asn Val Leu Arg Tyr Val

195 200 205

Thr Leu Asn Val Thr Thr Asn Ala Phe Cys Asp Asp Ile Tyr Ser Pro

210 215 220

Leu Tyr Thr Ile Thr Ser Asp Met Ile Cys Ala Thr Asp Asn Thr Gly

225 230 235 240

Gln Asn Glu Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser

245 250 255

Val Lys Asp Gly Ser Gly Ile Phe Ser Leu Ile Gly Ile Val Ser Trp

260 265 270

Gly Ile Gly Cys Ala Ser Gly Tyr Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Gly

275 280 285

Ser Gln Thr Gly Trp Ile Thr Asp Ile Ile Thr Asn Asn

290 295 300

<210> 2

<211> 906

<212> DNA

<213> 索玛鲁泰(Semaglutide与蚓激酶的融合蛋白Fusion protein of Semaglutide and lumbrokinase)

<400> 2

atgcacggag aaggtacttt tacttctgat gtttcttctt atcttgaagg acaagctgct 60

aaagaattca ttgcttggtt agttagaggt cgtcatggtg aaggtacttt tacttccgat 120

gtatcttcct atcttgaagg tcaagctgct caagaattca ttgcatggtt ggttgatgga 180

agaggtattg ttggaggaat tgaagctcgt ccttatgaat ttccatggca agtatctgtt 240

agacgtaaat cttctgattc tcatttctgt ggaggttcta ttattaatga tagatgggta 300

gtttgtgctg ctcattgtat gcaaggagaa tctcctgctt tagtttcttt agtagttggt 360

gaacatgatt cttctgctgc ttctactgta agacaaactc atgatgttga ttctattttc 420

gtacatgaag attataatgg taatactttt gaaaatgatg tatctgttat taaaactgtt 480

aatgctattg ctattgatat taatgtaggt ccaatttgtg ctcctgatcc agctaatgat 540

tatgtttata gaaaatctca atgttctgga tggggtacta ttaattctgg aggtgtatgt 600

tgtcctaatg tacttcgtta tgttactctt aatgtaacta ctaatgcttt ctgtgatgat 660

atctattctc cattatatac tattacttct gatatgattt gtgctactga taatactgga 720

caaaatgaga gagattcttg tcaaggagat tctggaggtc ctctttctgt taaagatgga 780

tctggtattt ttagtcttat tggaattgta tcttggggaa ttggttgtgc ttctggatat 840

ccaggtgttt atgctcgtgt aggatctcaa actggttgga ttactgatat tattactaat 900

aactaa 906