一种复合特异性卵黄抗体及其制备方法和应用与流程

本发明属于免疫学技术领域，具体地说，涉及一种复合特异性卵黄抗体及其制备方法和应用，更具体的，涉及抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌特异性卵黄抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

据统计，我国牙龈、牙周疾病等口腔疾病患病率占人口的70％以上。口腔疾病与口腔中的病原细菌密切相关，牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis)和伴放线放线杆菌(aggregatibacteractinomycetemcomitans)就被认为是引起牙周炎的两种细菌。牙龈卟啉单胞菌是慢性龈缘炎、慢性牙周炎、侵袭性牙周炎等牙周病的主要可疑致病菌，其菌毛能够与口腔上皮细胞表面的甘油醛-3-磷酸脱氢酶结合，侵入牙龈上皮细胞和牙龈成纤维细胞，逃避免疫清除。伴放线放线杆菌表达多种毒力因子如cage蛋白、白细胞毒素、脂多糖和细胞致死膨胀毒素等，这些毒力因子与牙周病的发病机制有关。伴放线放线杆菌在侵袭性牙周炎(青少年牙周炎)中起重要作用，还会引起心内膜炎、脑膜炎、骨髓炎等并发症。

预防和治疗牙周炎等口腔疾病，从口腔致病菌着手，有效抑制这些致病菌，是一种较为直接和可行的办法。目前，市面上针对牙周炎、牙龈炎的一些产品主要是含有中草药成分、抗生素成分或者化学抑菌剂成分的产品，但这类产品的见效慢且对于致病菌往往没有针对性且会导致耐药性等副作用，其作用效果不理想。因此，研究和生产具有针对性强、作用显著、无副作用等特点的产品对于预防和治疗相关口腔疾病具有重大意义。

卵黄抗体又称卵黄免疫球蛋白，是禽类蛋黄中存在的唯一的免疫球蛋白，目前应用较多的是鸡卵黄抗体，是用抗原免疫产蛋母鸡后，鸡血清中可产生相应的抗体，母鸡又能以产蛋的方式将血清中的抗体有效地转移至卵黄中。不同的抗原免疫就会产生针对该抗原的特异性卵黄抗体。卵黄抗体无需采血符合现代动物保护规则，产生的抗体量大，专一性强，性质稳定，无毒副作用，且不仅具有能与抗原结合的能力还对抗原菌的生长具有生长抑制作用。

研究和生产具有抑制口腔致病菌作用的卵黄抗体是一种行之有效的预防和治疗相关口腔疾病办法。目前卵黄抗体的制备工艺不够稳定，得到的卵黄抗体效价高低不均，产量低，纯度低，生物活性差，且成本比较高。

有鉴于此特提出本发明。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种复合特异性卵黄抗体及其制备方法和应用，该复合特异性卵黄抗体可以特异性抑制伴放线放线杆菌和牙龈卟啉单胞菌，特异性好、效价高、安全无毒副作用；本发明的制备方法可以延长卵黄抗体维持高效价的时长，同时提高卵黄抗体的产量和纯度，并且使卵黄抗体具有较高的生物活性，降低卵黄抗体的生产成本，使卵黄抗体技术能够更好的应用于产业化生产。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种复合特异性卵黄抗体的制备方法，包括：

(1)培养和提取牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌；

(2)制备免疫原：分别取牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌菌体，超声破碎后按照比例混合得到混合菌悬液，利用混合菌悬液制备免疫抗原；

(3)免疫产蛋母鸡：选取未生产过蛋的母鸡雏鸡开始饲养，在产蛋前35-55天利用免疫抗原进行免疫；

(4)分离纯化抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体。

本发明的制备方法选取未生产过蛋的母鸡雏鸡开始饲养，在产蛋前35-55天利用免疫抗原进行免疫，可以延长卵黄抗体维持高效价的时长，同时提高卵黄抗体的产量和纯度，并且使卵黄抗体具有较高的生物活性，降低卵黄抗体的生产成本，使卵黄抗体技术能够更好的应用于产业化生产。

进一步的方案，步骤(2)中，超声破碎后，将牙龈卟啉单胞菌菌株碎片10-30份和伴放线放线杆菌菌株碎片70-90份混合得到两种菌的混合菌悬液。

本发明采用牙龈卟啉单胞菌单胞菌菌体碎片10-30份和伴放线放线杆菌70-90份复合配置成混合菌悬液来制备免疫抗原。由于牙龈卟啉单胞菌的免疫原性相对较强而伴放线放线杆菌的免疫原性相对较弱，因此，以这样的比例复合配置而成的抗原能够在免疫刺激上形成差值，使其得到的卵黄抗体在效价上能形成较好的互补，使得新得到的特异性卵黄抗体具有更强的生物活性。

进一步的方案，步骤(4)中，分离纯化抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体的步骤依次包括：水提取法粗提取卵黄抗体、亲和层析法精提取卵黄抗体、超滤浓缩换液以及冷冻干燥，获得纯化的复合特异性卵黄抗体。

进一步的方案，水提取法粗提取卵黄抗体的方法包括：

(1)收集免疫母鸡的鸡蛋，用75％酒精消毒鸡蛋外壳，破壳收集蛋黄，量取并记录蛋黄液体积v0。

(2)取质量分数为5-10％、ph为5.0-5.5的山梨糖醇水溶液，以10-15v0的体积加入到收集的蛋黄液中，搅拌，静置，离心去沉淀，取水溶液备用。

本发明改进了卵黄抗体的提取工艺，在水提法的基础上添加山梨糖醇作为稳定剂，降低其在水溶液中的效价损失。

进一步的方案，亲和层析法精提取卵黄抗体的方法包括：

(1)用2-巯基吡啶与琼脂糖凝胶偶联的亲和填料装填亲和层析柱，装填完成后用含0.5m硫酸钾的20mm、ph7.5的磷酸钠缓冲液平衡亲和柱；

(2)将粗提得到的卵黄抗体的水溶性溶液上样，上样完成后，用含0.5m硫酸钾的20mm、ph7.5的磷酸钠缓冲液平衡亲和柱；

(3)用20mm、ph7.5的磷酸钠缓冲液进行洗脱，获得精提的卵黄抗体的水溶液，量取并记录得到的水溶液体积v1。

本发明采用亲和层析的方法精提取复合特异性卵黄抗体，避免了加入高分子聚合物对卵黄抗体的活性影响，亲和层析后的水溶液即为含有卵黄抗体的水溶液，其中没有高分子聚合物结合，后续处理不需要进行盐析处理，减少了工艺流程，且避免了高浓度盐分对卵黄抗体活性的影响。

进一步的方案，超滤浓缩换液和冷冻干燥的方法包括：

(1)用超滤膜包对精提得到的卵黄抗体的水溶液进行超滤换液，换液溶液为10v1体积的pbs缓冲液，换液完成后，用超滤膜包将溶液浓缩；

(2)将浓缩后的卵黄抗体溶液分装到一次性无菌培养皿中，依次放入-80℃冰箱冷冻、真空冷冻干燥机中冷冻干燥，取出冷冻干燥后的样品，获得卵黄抗体纯品；

优选的，采用的超滤膜包的分子截留量为50kda；

优选的，放入-80℃冰箱冰冻2-5小时，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥12-15小时。

本发明采用超滤膜包替代透析进行换液，换液更彻底，并且超滤膜包可对卵黄抗体水溶液进行浓缩，降低冷冻干燥时处理量，提高了处理效率。

进一步的方案，步骤(2)中，获得混合菌悬液后将混合菌悬液与弗氏完全佐剂按照1:1的体积比进行复合，搅拌乳化，制成油包水弗氏完全佐剂抗原；

将混合菌悬液与弗氏不完全佐剂按照1:1的体积比进行复合，搅拌乳化，制成油包水弗氏不完全佐剂抗原。

进一步的方案，步骤(3)中对未生产过蛋的母鸡进行免疫的方法包括：

初次免疫使用油包水弗氏完全佐剂抗原，免疫剂量为0.8ml，采用皮下多点注射和肌肉注射的方式免疫；初次免疫10天后进行第一次加强免疫，加强免疫使用油包水弗氏不完全佐剂抗原，免疫剂量为0.8ml，以后每隔10天进行加强免疫一次，至少加强免疫八次，母鸡产蛋后收集鸡蛋。

本发明改进了免疫方案，选取了未产蛋的母鸡雏鸡进行饲养，在产蛋前35-55天就开始免疫，同时缩短免疫间隔时间，增加免疫剂量，持续对母鸡进行免疫刺激，改进免疫方案后，得到的卵黄抗体维持高效价的时长大大增加，传统制备工艺获得的卵黄抗体可用的高效价部分只能选取15天的卵黄抗体，而本发明制备工艺获得的卵黄抗体可用的高效价部分可用以选取60天的卵黄抗体，其可用产量大大增加。

具体的，本发明提供的复合特异性卵黄抗体的制备方法包括：

a.培养和提取牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌：

取来自广东省微生物菌种保藏中心的牙龈卟啉单胞菌(p.g)atcc33277菌株和伴放线放线杆菌(a.a)atcc29523菌株，用血琼脂平板培养基扩增培养并通过革兰氏染色鉴定。牙龈卟啉单胞菌(p.g)atcc33277菌株培养3天，伴放线放线杆菌(a.a)atcc29523菌株培养1天，用接种环刮取细菌于pbs缓冲溶液中。重复离心提取三次，收集菌体沉淀即为所需的细菌菌体。

b.制备免疫原：

b1.分别取牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌菌体，用无菌pbs调节菌落密度到3-5×10⁹cfu/ml，然后进行超声破碎，再将菌悬液按照相应比例混合得到两种菌的混合菌悬液；

b2.将混合菌悬液与弗氏完全佐剂按照1:1的体积比进行复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水弗氏完全佐剂抗原。

b3.将混合菌悬液与弗氏不完全佐剂按照1:1的体积比进行复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水弗氏不完全佐剂抗原。

c.免疫产蛋母鸡：

选取未生产过蛋的母鸡雏鸡开始饲养，在产蛋前35-55天开始进行免疫；初次免疫使用弗氏完全佐剂抗原，免疫剂量为0.8ml，采用皮下多点注射和肌肉注射的方式免疫；初次免疫10天后进行第一次加强免疫，加强免疫使用弗氏不完全佐剂抗原，免疫剂量为0.8ml，以后每隔10天进行加强免疫一次，一共加强免疫八次，母鸡产蛋后及时收集鸡蛋并提纯。

d.分离纯化抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体：

d1：改良水提取法粗提取卵黄抗体：

(1)收集免疫母鸡鸡蛋，用75％酒精消毒鸡蛋外壳，破壳收集蛋黄，量取并记录蛋黄液体积v0。

(2)用蒸馏水配置5-10％的山梨糖醇水溶液，用稀盐酸调节其ph至5.0-5.5，然后以10-15v0的体积加入到收集的蛋黄液中，将混合液在磁力搅拌器上以较低的转速搅拌30-60分钟，然后放入4℃条件静置过夜。静置过后用离心机以10000rpm转速离心20分钟，弃去沉淀，取水溶性溶液备用。

d2：亲和层析法精提取卵黄抗体：

(1)用2-巯基吡啶与琼脂糖凝胶偶联的亲和填料装填亲和层析柱，装填完成后用含0.5m硫酸钾的20mm磷酸钠缓冲液(ph7.5)平衡亲和柱。

(2)将d1中得到的水溶性溶液以5ml/分钟的流速进行上样，上样完成后，再用5个柱体积的含0.5m硫酸钾的20mm磷酸钠缓冲液(ph7.5)平衡亲和柱，使卵黄抗体充分被亲和吸附到柱子中的亲和填料上。

(3)用10个柱体积的20mm磷酸钠缓冲液(ph7.5)进行洗脱，使吸附到亲和柱上的卵黄抗体被充分洗脱下来，所得到的溶液即为含纯度较高的卵黄抗体的水溶液，量取并记录得到的溶液体积v1。

d3：超滤浓缩换液和冷冻干燥

(1)用分子截留量为50kda的超滤膜包对d2中得到的溶液v1进行超滤换液，换液溶液为10v1体积的pbs缓冲液，换液完成后，继续用超滤膜包将溶液缓慢浓缩到20-50ml。

(2)将浓缩后的卵黄抗体溶液分装到一次性无菌培养皿中，先放入-80℃冰箱冰冻2-5小时，然后放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥12-15小时，取出冷冻干燥后的样品，即为卵黄抗体纯品，记为m纯品。

本发明的第二目的是提供上述一种方案或者组合方案所述的制备方法制备得到的复合特异性卵黄抗体。

本发明提供的抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌的特异性卵黄抗体可以特异性结合伴放线放线杆菌和牙龈卟啉单胞菌的细胞壁，抑制细菌生物膜的形成，具有特异性好、效价高、无副作用的优点，对牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌具有特别强的针对性。

本发明的第三目的是提供一种如上所述的特异性卵黄抗体在制备预防和/或治疗口腔疾病的药品和/或生活用品中的应用；

优选的，特异性卵黄抗体在制备预防和/或治疗牙周炎、牙龈炎的药品和/或生活用品中的应用。

牙龈卟啉单胞菌是一种主要的可以引起多种口腔疾病的致病菌，伴放线放线杆菌是引起侵袭性牙周炎的一种致病菌，因此本发明提供的一种抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体具有防止牙周炎、牙龈炎等口腔疾病作用，可作为抗牙周炎、牙龈炎的药品或生活用品的有效成分，用在药品及生活用品生产中。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1.本发明采用牙龈卟啉单胞菌单胞菌菌体碎片10-30份和伴放线放线杆菌70-90份复合配置成混合菌悬液来制备免疫抗原。由于牙龈卟啉单胞菌的免疫原性相对较强而伴放线放线杆菌的免疫原性相对较弱，因此，以这样的比例复合配置而成的抗原能够在免疫刺激上形成差值，使其得到的卵黄抗体在效价上能形成较好的互补，使得新得到的特异性卵黄抗体具有更强的抑菌作用。

2.本发明改进了免疫方案，选取了未产蛋的母鸡雏鸡进行饲养，在产蛋前35-55天就开始免疫，同时缩短免疫间隔时间，增加免疫剂量，持续对母鸡进行免疫刺激，改进免疫方案后，得到的卵黄抗体维持高效价的时长大大增加，传统制备工艺获得的卵黄抗体可用的高效价部分只能选取15天的卵黄抗体，而本发明制备工艺获得的卵黄抗体可用的高效价部分可用以选取60天的卵黄抗体，其可用产量大大增加。

3.本发明改进了卵黄抗体的提取工艺，在水提法的基础上添加山梨糖醇作为稳定剂，降低其在水溶液中的效价损失。本发明采用亲和层析的方法精提取卵黄抗体，避免了加入高分子聚合物对卵黄抗体的活性影响，亲和层析后的水溶液即为含有卵黄抗体的水溶液，其中没有高分子聚合物结合，后续处理不需要进行盐析处理，减少了工艺流程，且避免了高浓度盐分对卵黄抗体活性的影响。本发明采用超滤膜包替代透析进行换液，换液更彻底，并且超滤膜包可对卵黄抗体水溶液进行浓缩，降低冷冻干燥时处理量，提高处理效率。

4.本发明将获得的卵黄抗体通过生物膜抑制实验和透射电镜实验进行验证。透射电镜实验结果表明：所获得的复合特异性卵黄抗体可以特异性得结合到牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌的细胞壁上，从而影响两种细菌的生长繁殖。生物膜抑制实验结果表明：所获得的复合特异性卵黄抗体可以抑制牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌生物膜的形成且效果显著，生物膜是形成牙菌斑的前提，因此本发明获得的复合特异性卵黄抗体可以在一定程度上降低牙菌斑的产生，抑制牙菌斑的发展。综上所述，本发明获得的复合特异性卵黄抗体具有很高的生物活性，可用作预防牙周炎、牙周病的药品或生活用品的有效成分。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1是本发明实施例1与对比例1的抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌的复合特异性卵黄抗体电泳图；图中条带1.1为实施例1的卵黄抗体粗提取物；条带1.2为实施例1的卵黄抗体纯提取物；条带2.1为对比例1的卵黄抗体粗提取物；条带2.2为对比例1的卵黄抗体纯提取物；条带m为marker；

图2为本发明实施例1与对比例1的抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌的复合特异性卵黄抗体效价曲线图；

图3为本发明抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌的复合特异性卵黄抗体抑制伴放线放线杆菌生物膜形成的效果图；

图4为本发明抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌的复合特异性卵黄抗体抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的效果图；

图5为本发明抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌的复合特异性卵黄抗体抑制伴放线放线杆菌细胞壁的效果图；图中较大的黑色阴影为伴放线放线杆菌，细小的黑色小颗粒为卵黄抗体；

图6为本发明抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌的复合特异性卵黄抗体抑制牙龈卟啉单胞菌细胞壁的效果图；图中较大的黑色阴影为牙龈卟啉单胞菌，细小的黑色小颗粒为卵黄抗体。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体的制备：

a.培养和提取牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌：

取来自广东省微生物菌种保藏中心的牙龈卟啉单胞菌(p.g)atcc33277菌株和伴放线放线杆菌(a.a)atcc29523菌株，用血琼脂平板培养基扩增培养并通过革兰氏染色鉴定。牙龈卟啉单胞菌(p.g)atcc33277菌株培养3天，伴放线放线杆菌(a.a)atcc29523菌株培养1天，用接种环刮取细菌于pbs缓冲溶液中。重复离心提取三次，收集菌体沉淀即为所需的细菌菌体。

b.制备免疫原：

b1.分别取牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌菌体，用无菌pbs调节菌落密度到3-5×10⁹cfu/ml，然后在超声破碎仪上以25hz，超声3s，停4s循环超声破碎25min，再将菌悬液按照牙龈卟啉单胞菌：伴放线放线杆菌＝30:70的比例混合得到二种菌的混合菌悬液；

b2.将混合菌悬液与弗氏完全佐剂按照1:1的体积比进行复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水弗氏完全佐剂抗原。

b3.将混合菌悬液与弗氏不完全佐剂按照1:1.2的体积比进行复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水弗氏不完全佐剂抗原。

c.免疫产蛋母鸡：

选取未产蛋的母鸡雏鸡开始饲养，在产蛋前45天开始进行免疫；初次免疫使用弗氏完全佐剂抗原，免疫剂量为0.8ml，采用皮下多点注射和肌肉注射的方式免疫；初次免疫10天后进行第一次加强免疫，加强免疫使用弗氏不完全佐剂抗原，免疫剂量为0.8ml，以后每隔10天进行加强免疫一次，一共加强免疫八次，母鸡产蛋后及时收集鸡蛋并提纯。

d.分离纯化抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体：

d1：改良水提取法粗提取卵黄抗体：

(1)收集免疫母鸡鸡蛋，用75％酒精消毒鸡蛋外壳，破壳收集蛋黄，量取并记录蛋黄液体积v0。

(2)用蒸馏水配置8％的山梨糖醇水溶液，用稀盐酸调节其ph至5.0-5.5，然后以12v0的体积加入到收集的蛋黄液中，将混合液在磁力搅拌器上以较低的转速搅拌40分钟，然后放入4℃条件静置过夜。静置过后用离心机以10000rpm转速离心20分钟，弃去沉淀，取水溶性溶液备用。

d2：亲和层析法精提取卵黄抗体：

(1)用2-巯基吡啶与琼脂糖凝胶偶联的亲和填料装填亲和层析柱，装填完成后用含0.5m硫酸钾的20mm磷酸钠缓冲液(ph7.5)平衡亲和柱。

(2)将d1中得到的水溶性溶液以5ml/分钟的流速进行上样，上样完成后，再用5个柱体积的含0.5m硫酸钾的20mm磷酸钠缓冲液(ph7.5)平衡亲和柱，使卵黄抗体充分被亲和吸附到柱子中的亲和填料上。

(3)用10个柱体积的20mm磷酸钠缓冲液(ph7.5)进行洗脱，使吸附到亲和柱上的卵黄抗体被充分洗脱下来，所得到的溶液即为含纯度较高的卵黄抗体的水溶液，量取并记录得到的溶液体积v1。

d3：超滤浓缩换液和冷冻干燥

(1)用分子截留量为50kda的超滤膜包对d2中得到的溶液v1进行超滤换液，换液溶液为10v1体积的pbs缓冲液，换液完成后，继续用超滤膜包将溶液缓慢浓缩到50ml。

(2)将浓缩后的卵黄抗体溶液分装到一次性无菌培养皿中，先放入-80℃冰箱冰冻2小时，然后放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥12小时，取出冷冻干燥后的样品，即为卵黄抗体纯品，记为m纯品。

获得复合特异性卵黄抗体后，分别对其进行琼脂糖凝胶电泳实验和效价检测实验，检验复合特异性卵黄抗体的纯度和效价，并统计其收率。

实施例2

抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体的制备：

a.培养和提取牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌：

取来自广东省微生物菌种保藏中心的牙龈卟啉单胞菌(p.g)atcc33277菌株和伴放线放线杆菌(a.a)atcc29523菌株，用血琼脂平板培养基扩增培养并通过革兰氏染色鉴定。牙龈卟啉单胞菌(p.g)atcc33277菌株培养3天，伴放线放线杆菌(a.a)atcc29523菌株培养1天，用接种环刮取细菌于pbs缓冲溶液中。重复离心提取三次，收集菌体沉淀即为所需的细菌菌体。

b.制备免疫原：

b1.分别取牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌菌体，用无菌pbs调节菌落密度到3-5×10⁹cfu/ml，然后在超声破碎仪上以25hz，超声3s，停4s循环超声破碎25min，再将菌悬液按照牙龈卟啉单胞菌：伴放线放线杆菌＝10:90的比例混合得到二种菌的混合菌悬液；

b2.将混合菌悬液与弗氏完全佐剂按照1:1的体积比进行复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水弗氏完全佐剂抗原。

b3.将混合菌悬液与弗氏不完全佐剂按照1:1的体积比进行复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水弗氏不完全佐剂抗原。

c.免疫产蛋母鸡：

选取未产蛋的母鸡雏鸡开始饲养，在产蛋前35天开始进行免疫；初次免疫使用弗氏完全佐剂抗原，免疫剂量为0.8ml，采用皮下多点注射和肌肉注射的方式免疫；初次免疫10天后进行第一次加强免疫，加强免疫使用弗氏不完全佐剂抗原，免疫剂量为0.8ml，以后每隔10天进行加强免疫一次，一共加强免疫八次，母鸡产蛋后及时收集鸡蛋并提纯。

d.分离纯化抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体：

d1：改良水提取法粗提取卵黄抗体：

(1)收集免疫母鸡鸡蛋，用75％酒精消毒鸡蛋外壳，破壳收集蛋黄，量取并记录蛋黄液体积v0。

(2)用蒸馏水配置8％的山梨糖醇水溶液，用稀盐酸调节其ph至5.0-5.5，然后以10v0的体积加入到收集的蛋黄液中，将混合液在磁力搅拌器上以较低的转速搅拌30分钟，然后放入4℃条件静置过夜。静置过后用离心机以10000rpm转速离心20分钟，弃去沉淀，取水溶性溶液备用。

d2：亲和层析法精提取卵黄抗体：

(1)用2-巯基吡啶与琼脂糖凝胶偶联的亲和填料装填亲和层析柱，装填完成后用含0.5m硫酸钾的20mm磷酸钠缓冲液(ph7.5)平衡亲和柱。

(2)将d1中得到的水溶性溶液以5ml/分钟的流速进行上样，上样完成后，再用5个柱体积的含0.5m硫酸钾的20mm磷酸钠缓冲液(ph7.5)平衡亲和柱，使卵黄抗体充分被亲和吸附到柱子中的亲和填料上。

(3)用10个柱体积的20mm磷酸钠缓冲液(ph7.5)进行洗脱，使吸附到亲和柱上的卵黄抗体被充分洗脱下来，所得到的溶液即为含纯度较高的卵黄抗体的水溶液，量取并记录得到的溶液体积v1。

d3：超滤浓缩换液和冷冻干燥

(1)用分子截留量为50kda的超滤膜包对d2中得到的溶液v1进行超滤换液，换液溶液为10v1体积的pbs缓冲液，换液完成后，继续用超滤膜包将溶液缓慢浓缩到35ml。

(2)将浓缩后的卵黄抗体溶液分装到一次性无菌培养皿中，先放入-80℃冰箱冰冻3小时，然后放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥13小时，取出冷冻干燥后的样品，即为卵黄抗体纯品，记为m纯品。

获得复合特异性卵黄抗体后，分别对其进行琼脂糖凝胶电泳实验和效价检测实验，检验卵黄抗体的纯度和效价，并统计其收率。

实施例3

抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体的制备：

a.培养和提取牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌：

取来自广东省微生物菌种保藏中心的牙龈卟啉单胞菌(p.g)atcc33277菌株和伴放线放线杆菌(a.a)atcc29523菌株，用血琼脂平板培养基扩增培养并通过革兰氏染色鉴定。牙龈卟啉单胞菌(p.g)atcc33277菌株培养3天，伴放线放线杆菌(a.a)atcc29523菌株培养1天，用接种环刮取细菌于pbs缓冲溶液中。重复离心提取三次，收集菌体沉淀即为所需的细菌菌体。

b.制备免疫原：

b1.分别取牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌菌体，用无菌pbs调节菌落密度到3-5×10⁹cfu/ml，然后在超声破碎仪上以25hz，超声3s，停4s循环超声破碎30min，再将菌悬液按照牙龈卟啉单胞菌：伴放线放线杆菌＝25:75的比例混合得到两种菌的混合菌悬液；

b2.将混合菌悬液与弗氏完全佐剂按照1:1的体积比进行复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水弗氏完全佐剂抗原。

b3.将混合菌悬液与弗氏不完全佐剂按照1:1.3的体积比进行复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水弗氏不完全佐剂抗原。

c.免疫产蛋母鸡：

选取未产蛋的母鸡雏鸡开始饲养，在产蛋前55天开始进行免疫；初次免疫使用弗氏完全佐剂抗原，免疫剂量为0.8ml，采用皮下多点注射和肌肉注射的方式免疫；初次免疫10天后进行第一次加强免疫，加强免疫使用弗氏不完全佐剂抗原，免疫剂量为0.8ml，以后每隔10天进行加强免疫一次，一共加强免疫九次，母鸡产蛋后及时收集鸡蛋并提纯。

d.分离纯化抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体：

d1：改良水提取法粗提取卵黄抗体：

(1)收集免疫母鸡鸡蛋，用75％酒精消毒鸡蛋外壳，破壳收集蛋黄，量取并记录蛋黄液体积v0。

(2)用蒸馏水配置8％的山梨糖醇水溶液，用稀盐酸调节其ph至5.0-5.5，然后以15v0的体积加入到收集的蛋黄液中，将混合液在磁力搅拌器上以较低的转速搅拌60分钟，然后放入4℃条件静置过夜。静置过后用离心机以10000rpm转速离心20分钟，弃去沉淀，取水溶性溶液备用。

d2：亲和层析法精提取卵黄抗体：

(1)用2-巯基吡啶与琼脂糖凝胶偶联的亲和填料装填亲和层析柱，装填完成后用含0.5m硫酸钾的20mm磷酸钠缓冲液(ph7.5)平衡亲和柱。

(2)将d1中得到的水溶性溶液以5ml/分钟的流速进行上样，上样完成后，再用5个柱体积的含0.5m硫酸钾的20mm磷酸钠缓冲液(ph7.5)平衡亲和柱，使卵黄抗体充分被亲和吸附到柱子中的亲和填料上。

(3)用10个柱体积的20mm磷酸钠缓冲液(ph7.5)进行洗脱，使吸附到亲和柱上的卵黄抗体被充分洗脱下来，所得到的溶液即为含纯度较高的卵黄抗体的水溶液，量取并记录得到的溶液体积v1。

d3：超滤浓缩换液和冷冻干燥

(1)用分子截留量为50kda的超滤膜包对d2中得到的溶液v1进行超滤换液，换液溶液为10v1体积的pbs缓冲液，换液完成后，继续用超滤膜包将溶液缓慢浓缩到20ml。

(2)将浓缩后的卵黄抗体溶液分装到一次性无菌培养皿中，先放入-80℃冰箱冰冻5小时，然后放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥12小时，取出冷冻干燥后的样品，即为卵黄抗体纯品，记为m纯品。

获得卵黄抗体后，分别对其进行琼脂糖凝胶电泳实验和效价检测实验，检验卵黄抗体的纯度和效价，并统计其收率。

对比例1

采用传统制备工艺制备抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体，其方法步骤如下：

a.培养和提取牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌：

a1.细菌种类：牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis，p.g)atcc33277菌株和伴放线放线杆菌(aggregatibacteractinomycetemcomitans，a.a)atcc29523菌株；

a2.取来自广东省微生物菌种保藏中心的牙龈卟啉单胞菌(p.g)atcc33277菌株，用血琼脂平板培养基在37℃，厌氧产气袋中培养扩增3天；取来自广东省微生物菌种保藏中心的伴放线放线杆菌atcc29523菌株，用血琼脂平板培养基在37℃，5％co2条件下培养扩增1天；培养扩增后将细菌从培养基上刮取下来，在4℃，8000rpm条件离心15min后得到菌体。

b.制备免疫原：

b1.取牙龈卟啉单胞菌用pbs溶液调节浓度使其在紫外分光光度计吸光度od595时读数为1.1，取伴放线放线杆菌用pbs溶液调节浓度使其在紫外分光光度计吸光度od595时读数为1.2；在超声破碎仪上以25hz，超声3s，停4s循环超声破碎25min，再将种菌悬液按照体积比1:1进行混合得到两种菌的混合菌悬液；

b2.将混合菌悬液与弗氏完全佐剂按照1:1的体积比进行复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水弗氏完全佐剂抗原；

b3.将混合菌悬液与弗氏不完全佐剂按照1:1的体积比进行复合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水弗氏不完全佐剂抗原。

c.产蛋母鸡免疫：

选取20周龄产蛋母鸡；初次免疫使用弗氏完全佐剂抗原，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.6ml；初次免疫15天后进行第一次加强免疫，使用弗氏不完全佐剂抗原，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.6ml，以后每隔15天进行加强免疫一次，一共加强免疫五次，从第一次加强免疫开始收集免疫鸡蛋，并及时分离提取。

d.卵黄抗体粗提物制备：

收集免疫后母鸡鸡蛋，用75％酒精消毒鸡蛋外壳，破壳收集蛋黄并记录蛋黄液体积v0；加入3v0体积的含3.0％(w/v)的peg6000的pbs缓冲液，混匀，搅拌40min后，在2～4℃条件下静置12h；在4℃，10000rpm条件离心20mim，取上清液，过滤，得到滤液v1；滤液中缓慢加入peg6000，使peg6000终浓度为12％(w/v)，搅拌40min；在4℃，10000rpm条件离心20mim，弃上清得沉淀，即为卵黄抗体粗品m粗品。

e.卵黄抗体纯化步骤：

具体是将抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体粗提取用v0体积的pbs溶液溶解，加v0体积的饱和硫酸铵使硫酸铵在溶液中的饱和度为50％，充分混匀搅拌40min，在4℃条件下静置12h；在4℃，10000rpm条件离心20mim，取沉淀；将沉淀用1/5v0体积的pbs溶液溶解，再加入1/10v0体积的饱和硫酸铵使硫酸铵在溶液中的饱和度为33％，充分混匀搅拌40min，在4℃条件下静置12h；在4℃，10000rpm条件离心20mim，取沉淀，即为卵黄抗体半纯品m半纯品；用1/5v0体积的pbs溶液溶解卵黄抗体半纯品，然后用透析袋将样品放在pbs溶液中透析3天，透析过程中适时更换pbs溶液，透析完成后取出样品，分装到无菌平皿中；将抗体溶液先放到-80℃中冰冻，然后转移到冷冻干燥机中冷冻干燥12h，即得抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体纯品m纯品。

获得卵黄抗体后，分别对其进行琼脂糖凝胶电泳实验和效价检测实验，检验卵黄抗体的纯度和效价，并统计其收率。

实施例1与对比例1的比较结果

图1为实施例1和对比例1所获得的抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体电泳图。从图中看出，实施例1的卵黄抗体粗提取物的蛋白条带较多，说明粗提取物含有较多的杂质蛋白；纯提取物中只有一个约70kda的重链条带和一个约20kda的轻链条带，说明经过系列提纯步骤，大大提高了抗体的纯度，该复合特异性卵黄抗体纯品中，卵黄抗体的纯度经还原性sds-page和灰度值软件分析测定纯度为95％以上。

对比例1中的卵黄抗体粗提取物也含有较多的杂质蛋白，其纯提取物中除了一个约70kda的重链条带和一个约20kda的轻链条带外，还有一条约38kda的杂质条带，说明对比例1获得的卵黄抗体纯提取物仍然含有部分杂质，该卵黄抗体的纯度经还原性sds-page和灰度值软件分析测定纯度为75％左右。

综上所述，本发明中改良的卵黄抗体制备方法大大提高了卵黄抗体的纯度。

图2为实施例1和对比例1获得的抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体效价曲线图。图中可看出，对比例1中获得的卵黄抗体制剂纯品经elisa方法测定，该卵黄抗体纯品中，每毫克卵黄抗体纯品抗牙龈卟啉单胞菌的最大比活性为1:10240，持续15天，抗伴放线放线杆菌的最大比活性为1:5120，持续15天，对比例1中获得的卵黄抗体的效价上升期和下降期都很长，最大比活性的维持期很短。而实施例1中获得的卵黄抗体制剂纯品每毫克卵黄抗体抗抗牙龈卟啉单胞菌的最大比活性为1:20480，比活性在1:10240以上的持续时间约为65天，抗伴放线放线杆菌的最大比活性为1:20480，比活性在1:10240以上的持续时间约为60天，实施例1中获得的卵黄抗体效价上升期和下降期都很短，较大比活性的维持期很长。从图上还看出，实施例1中获得的卵黄抗体抗牙龈卟啉单胞菌和抗伴放线放线杆菌的效价在时间上形成了互补。综上所述，本发明改良的抗原复配方案能使卵黄抗体的效价在时间上形成互补，增大免疫效果。

实施例1与对比例1的卵黄抗体制备方法和效果综合比较的结果如表1中所示。

表1实施例1和对比例1的卵黄抗体制备方法及效果的比较表

本发明优化了免疫方案，用未产蛋的母鸡替代已产蛋的母鸡进行免疫，这大大缩短了卵黄抗体的效价上升期和下降期，显著延长了卵黄抗体高效价的维持期。同时，本发明的提取方法从制备工艺的各个环节入手，尽量减少杂质引入，降低提取过程中卵黄抗体的效价损失，这对保持卵黄抗体的高效价有重要的意义。

试验例1

为了验证所获得抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体纯品对细菌生物膜形成的影响，采用结晶紫染色法检验复合特异性卵黄抗体对牙龈卟啉单胞菌(p.g)和伴放线放线杆菌(a.a)生物膜形成的影响。其方法步骤如下：

(1)取来自广东省微生物菌种保藏中心的牙龈卟啉单胞菌(p.g)atcc33277菌株，用血琼脂平板培养基在37℃，厌氧产气袋中培养扩增3天；取来自广东省微生物菌种保藏中心的伴放线放线杆菌atcc29523菌株，用血琼脂平板培养基在37℃，5％co2条件下培养扩增1天；培养扩增后将细菌从培养基上刮取下来，用bhi液体培养基将细菌调节到od595处读数为0.8，然后稀释50倍待用。

(2)用实施例1获得的特异性卵黄抗体作实验组，起始浓度稀释到2.5mg/ml，2倍倍比稀释成3个浓度梯度；用空白卵黄抗体(非特异性卵黄抗体)作阴性对照，起始浓度稀释到2.5mg/ml，2倍倍比稀释成2个浓度梯度；用0.1mg/ml的氨苄青霉素作阳性对照；用空白培养基作为空白对照。分别各取0.05ml加入到96孔酶标板中，然后取0.05ml稀释好的细菌分别加入到96孔酶标板中，充分混合均匀，在对应细菌培养条件下培养。

(3)细菌培养结束后，吸出培养物，用蒸馏水洗板两次。然后在96孔酶标板中分别加入0.05ml0.1％的结晶紫溶液，在室温条件下染色15min。

(4)吸出结晶紫，用蒸馏水洗板3次，在自然条件下风干。然后在96孔酶标板中分别加入0.2ml95％的乙醇溶液，充分混匀后，用酶标仪在od590处读板，绘图分析结果。

结果：

图3和4分别为抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体抑制伴放线放线杆菌和牙龈卟啉单胞菌细菌形成的效果图。图中可看出，作为阳性对照的0.1mg/ml氨苄青霉素可以显著的抑制细菌生物膜的形成；实验组中特异性卵黄抗体对细菌生物膜的抑制作用随其浓度变化而变化，其中1.25mg/ml的特异性卵黄抗体对细菌生物膜的抑制作用与阳性对照的效果基本相同；作为空白对照的空白培养基中细菌正常生长，细菌生物膜形成未受到抑制；作为阴性对照的空白卵黄抗体与空白对照相同，没有浓度梯度的差别，空白卵黄抗体不能抑制细菌生物膜的形成。

试验例2

为了验证所获得抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌复合特异性卵黄抗体纯品对细菌细胞壁的结合效果，采用透射电镜法检验复合特异性卵黄抗体对牙龈卟啉单胞菌(p.g)和伴放线放线杆菌(a.a)的结合作用。其方法步骤如下：

(1)使用pbs从血平板上收集生长良好的的细菌，离心，用pbs溶液洗涤二次。调节细菌浓度至10⁷cfu/ml，取其中的1ml细菌溶液。

(2)以实施例1获得的复合特异性卵黄抗体为实验组，空白卵黄抗体(非特异性卵黄抗体)为对照组，分别稀释到6mg/ml；分别取1ml实验组与对照组抗体溶液与1ml细菌混合，在37℃条件下孵育2h，然后在4℃放置过夜。

(3)吸出混合物，用pbs-bsa洗液洗涤两次；将胶体金偶联的兔抗鸡igy抗体用pbs-bsa稀释14倍，然后各取0.3ml分别加入实验组和对照组样品中，并将样品孵育在37℃条件下2h。

(4)吸出培养物，用pbs-bsa洗液漂洗两次，除去未结合的抗体；用pbs溶液重新悬浮至原来体积。取5μl样品溶液滴在一个300目的铜网，吸附5min。

(5)用2％的磷钨酸(ph＝7.0，磷钨酸钠或钾，用氢氧化钠或氢氧化钾调节ph)进行负染色5min，清洗干燥后，使用日立ht7700透射电子显微镜下进行观察。

结果：

图5和6分别为复合特异性卵黄抗体结合伴放线放线杆菌和牙龈卟啉单胞菌细胞壁的效果图。从图5中看出，实验组中的复合特异性卵黄抗体大量吸附在伴放线放线杆菌的细胞壁上，对照组中的空白卵黄抗体则只能游离在伴放线放线杆菌的周围，无法结合到其细胞壁上；同样的，从图6中看出，实验组中的复合特异性卵黄抗体大量吸附在牙龈卟啉单胞菌的细胞壁上，对照组中的空白卵黄抗体则只能游离在牙龈卟啉单胞菌的周围，无法结合到其细胞壁上。通过该实验证明，本发明所获得的复合特异性卵黄抗体可以特异性结合在伴放线放线杆菌和牙龈卟啉单胞菌的细胞壁上，从而影响其生长繁殖。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。