用于中华绒螯蟹易患颤抖病与否鉴定的微卫星标记引物及鉴定试剂盒与应用的制作方法

本发明涉及一种用于中华绒螯蟹易患颤抖病与否鉴定的微卫星标记引物及鉴定试剂盒与应用，属于动物分子遗传学领域。

背景技术：

中华绒螯蟹的人工养殖近年来蓬勃发展，产生了巨大的经济效益。与此同时，养殖区的中华绒螯蟹发生了一种流行病，以步足颤抖或卷缩为主要症状，俗称颤抖病。发病迅速，死亡率高，损失惨重。对于此病至今没有有效的根治方法。河蟹颤抖病是对其养殖危害最大的重大流行病，自从1994年发现以来，每年都是各地的河蟹养殖最严重的疾病之一，尽管近年来河蟹颤抖病发生有减缓趋势，但局部地区仍有大面积暴发，死亡率仍可高达50%以上，给河蟹养殖造成巨大损失。

技术实现要素：

本发明的目的是为了鉴定中华绒螯蟹正常个体和颤抖病个体提供一种用于中华绒螯蟹易患颤抖病与否鉴定的微卫星标记引物及鉴定试剂盒与应用。

本发明的技术方案如下：

一种用于中华绒螯蟹易患颤抖病与否鉴定的微卫星标记引物，所述的微卫星标记引物序列为：f:ctcaaggcaccaggacacttatct；r:cacctctcctctctaaatcaccca。

一种用于中华绒螯蟹易患颤抖病与否鉴定的试剂盒，包括以上所述的微卫星标记引物。

进一步地，还包括10×pcrbuffe、2.5mmol/ldntp、mgcl2、taq酶、dna模板和超纯水。

以上所述的试剂盒用于中华绒螯蟹易患颤抖病与否鉴定中的应用。

以上所述的应用，包括以下步骤：

（1）取待鉴定的中华绒螯蟹个体样本；

（2）中华绒螯蟹样本dna提取：

（3）利用权利要求1所述的微卫星标记引物对待测样本dna进行pcr扩增，扩增后的pcr产物在非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行银染；

（4）根据银染结果，判断待测样本个体在权利要求1下的微卫星引物中的基因型大小，如果此基因型大小为290/314基因型，则此个体为正常个体，不易患颤抖病。如果此基因型大小不是290/314基因型，则此个体就有可能为易患颤抖病的个体。

进一步地，步骤（3）pcr扩增反应条件为：95℃预变性2分钟；95℃变性30秒，退火温度60℃复性30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸10分钟；10℃保存。

进一步地，步骤（3）pcr扩增反应体系为25μl：10×pcrbuffer2.5μl，2.5mmol/ldntp1μl，mgcl22.5μl，上下游引物各1μl，taq酶0.2μl，dna模板2μl，超纯水14.8μl。

与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：

利用本发明提供的微卫星引物和方法可以较为准确判断中华绒螯蟹正常个体和易患颤抖病个体。

在中华绒螯蟹幼体时即可判断该个体是否为易患颤抖病个体。在选育优良中华绒螯蟹优良个体时，利用本方法可以有效避免选育的个体在以后的生长发育过程中得颤抖病。

本发明涉及的引物的基因型对中华绒螯蟹正常个体具有良好的特异性，且本发明首次从中华绒螯蟹微卫星方向检测是否为颤抖病易患个体，为中华绒螯蟹养殖提供新的思路，具有较大的应用价值。

附图说明

图1为1-24号个体pcr产物在聚丙烯酰胺凝胶的条带大小；

图2为25-48号个体pcr产物在聚丙烯酰胺凝胶的条带大小。

具体实施方式：

实施例1

中华绒螯蟹样本dna提取。

(l)取0.5g左右的肌肉组织，充分剪碎，放入1.5ml离心管中；

(2)向离心管中加入500μl的hombuffer和10~15μl的蛋白酶k,在55℃消化至少3h,每隔1h摇动一次；

(3)加500μl氯化钠(4.5m)，300μl氯仿，混20min，13000r/min下离心10min；

(4)转移上清液到新管(大概850μl左右)，加595μl无水异丙醇(0.7volume)，混20min，13000r/min下离心10min，倒掉上清；

(5)加500μl75%乙醇，55℃置5min，13000r/min下离心20min，倒掉上清；

(6)将试管倒立于吸水纸上，室温下自然干燥；

(7)加50-100μl的灭菌双蒸水溶解，-20℃保存。

实施例2

10%聚丙烯酞胺凝胶的制备

(1)清洗制胶玻璃板,烘干后,组装玻璃板，用1.0%的琼脂糖凝胶封底；

(2)30%丙烯酞胺16ml，5xtbe8ml，双蒸水16ml，10%过硫酸铵(ap)325μl，temed45μl，混匀后迅速灌胶；

(3)当胶灌至离玻璃板上缘0.5cm时停止灌胶,插入梳子,注意梳齿下不能有气泡,室温下聚合1-3h；

(4)凝胶聚合完全后,轻轻拔出梳子；

(5)取下玻璃板，固定在电泳槽上，倒入电泳缓冲液1xtbe，在200v电压下预电泳30min，使胶更加均匀；

(6)用10μl移液器取8μlpcr产物和4μl上样缓冲液混匀后加到点样孔,同时留出1个点样孔加入分子量标记物marker；

(7)上样完毕后,打开电泳仪在200v电压下先电泳30min左右，再调至160v电压电泳，电泳时间1小时。

银染检测

(1)电泳结束后关闭电泳议，倒出电泳缓冲液1xtbe，取出凝胶，剥到染色盒中，注意不要弄破胶，然后用双蒸水漂洗一次；

(2)银染：加入染色液，在摇床上轻摇染色15min，然后双蒸水迅速漂洗2次；

(3)显色：加入显色液，在摇床上轻摇显色，观察显色情况，出现比较清晰的条带时就停止显色，然后双蒸水迅速漂洗2次；

(4)拍照：将胶置于凝胶成像系统上，白光下用数码相机进行拍照，保存照片并作好记录，用于带型分析。

实施例3

中华绒螯蟹颤抖病易患与否的鉴定：

取中华绒螯蟹成熟个体48个，其中13-36号个体为未患颤抖病的正常个体，1-12，37-48号个体为患颤抖病个体。取这48个个体的dna。1-16号个体、41-48号个体为患颤抖病个体，17-40号个体为正常个体。利用引物f:ctcaaggcaccaggacacttatct（seqidno.1）；r:cacctctcctctctaaatcaccca（seqidno.2）对这48个个体的dna进行pcr扩增。

pcr扩增反应程序为：95℃预变性2分钟；95℃变性30秒，退火温度60℃复性30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸10分钟；10℃保存。pcr扩增反应体系为25μl：10×pcrbuffer2.5μl，2.5mmol/ldntp1μl，mgcl22.5μl，上下游引物各1μl，taq酶0.2μl，dna模板2μl，超纯水14.8μl。扩增后的pcr产物在非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行银染。根据银染结果，判断待测样本个体在权利要求1下的微卫星引物中的基因型大小。银染结果如图1和图2所示。在24个颤抖病个体中不存在290/314基因型（ad基因型），在24个正常个体中有5个个体（21%）存在该基因型。利用spss软件进行基因型与表型性状的线性回归分析，采用最大似然比法，以p＝0.05作为阈值检测单一分子标记与性状的连锁关系，检测到该微卫星位点和中华绒螯蟹未患颤抖病性状紧密连锁（p=0.022<0.05）。

根据以上实施例的鉴定过程，本发明又提供了一种用于中华绒螯蟹易患颤抖病与否鉴定的试剂盒，该试剂盒包括：

（1）微卫星标记引物：f:ctcaaggcaccaggacacttatct（seqidno.1）；r:cacctctcctctctaaatcaccca（seqidno.2），其中上下游引物各1μl；

（2）10×pcrbuffer；

（3）2.5mmol/ldntp；

（4）mgcl2；

（5）taq酶；

（6）dna模板；

（7）超纯水。

利用该试剂盒集合以上鉴定方法进行鉴定，能够得到良好的鉴定结果。

本发明提供的用于中华绒螯蟹易患颤抖病与否鉴定的微卫星标记引物及鉴定方法和应用，可以有效地对中华绒螯蟹是否易患颤抖病进行鉴定，同时其更大的意义在于可以将中华绒螯蟹群体中的易患颤抖病个体鉴定出来，并形成规模化的养殖，可以大大的降低养殖户养殖的中华绒螯蟹患颤抖病概率，能够极大地提高当前中华绒螯蟹养殖业的发展。

序列表

<110>中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120>用于中华绒螯蟹易患颤抖病与否鉴定的微卫星标记引物及鉴定试剂盒与应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ctcaaggcaccaggacacttatct24

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