本发明属于藻类多肽提取技术领域，尤其涉及一种血红裸藻多肽的提取方法。
背景技术：
血红裸藻，属于鞭毛藻，具有很强的趋光性，是裸藻门的代表植物，是生长于湖泊及池塘的浮游藻类。在水产养殖环境中，常常在下风口溶氧高的地方聚集比较多；并且水体伴随大量油膜，油膜多为死亡的藻类、菌类等。同时池塘水色会有发暗、发红现象。血红裸藻也是爆发水华的主要藻类之一。
血红裸藻当中含有比较高的营养价值，富含蛋白质、维生素等对人体有益的营养成分。血红裸藻多肽是血红裸藻蛋白经过酶水解，精制后获得的肽类，具备抗疲劳以及耐缺氧等多种功能。
目前现有的血红裸藻多肽提取方法操作比较粗糙，多肽的提取率低。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提取率高、活性蛋白含量高的血红裸藻多肽的提取方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种血红裸藻多肽的提取方法，包括以下步骤：
1)血红裸藻加水浸提获得浸提液，超声辅助酶解所述浸提液获得酶解液，干燥所述酶解液获得血红裸藻多肽粗品；
所述超声辅助酶解用酶为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的质量为所述浸提液质量的3.5％～4.5％，所述超声辅助酶解体系的ph值为8.4～8.6，所述超声辅助酶解的超声功率为253～255w，所述超声辅助酶解的时间为22.9～24min；
2)将步骤1)中所述的血红裸藻多肽粗品以水溶解后，对获得的血红裸藻多肽溶液进行酶解、透析、干燥、重新溶解、g-75葡聚糖凝胶过滤、干燥获得血红裸藻多肽纯品；
所述酶解用酶为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的质量为所述血红裸藻多肽溶液质量的3.5％～4.5％，所述酶解的ph值为8.4～8.6，所述酶解的温度为45～55℃，所述酶解的时间为6～8h；
所述透析用透析膜的截留分子量为500～1000d。
优选的，步骤1)中所述血红裸藻的含水量≤10％。
优选的，步骤1)中加水的体积为每1g(血红裸藻质量):100ml(水)，所述浸提的时间为1.5～2.5h。
优选的，步骤1)中获得所述酶解液后，干燥之前，还包括离心、活性炭吸附离心的上清液以及减压浓缩步骤。
优选的，所述减压浓缩的温度为-22～-18℃，所述减压浓缩的时间为8～12min，所述减压浓缩的真空度为13.3～40pa。
优选的，步骤1)中所述干燥为冷冻干燥；所述冷冻干燥的真空度为13.3～40pa，所述冷冻干燥的温度为-22～-18℃，所述冷冻干燥的时间为10～14h。
优选的，步骤2)中所述透析的总时间为6h；所述透析过程中，每0.5h换水一次。
优选的，步骤1)中所述超声辅助酶解的温度为50℃，所述超声辅助酶解的时间为2h。
本发明的有益效果：本发明提供的血红裸藻多肽的提取方法，通过浸提、超声辅助酶解获得血红裸藻多肽粗品，并对所述血红裸藻多肽粗品进行进一步的酶解、透析、g-75葡聚糖凝胶过滤获得血红裸藻多肽纯品。本发明所述方法获得的血红裸藻多肽的提取率高达5.3％，提取获得的血红裸藻多肽纯品呈绿色粉末状，蛋白质含量≥90％(g/100g)；小分子低聚肽≥80％(g/100g)；水分≤5％；其中的蛋白质分子量主要分布在500～1000d之间，游离氨基酸含量低，保证了血红裸藻多肽的纯度。
具体实施方式
本发明提供了一种血红裸藻多肽的提取方法，包括以下步骤：1)血红裸藻加水浸提获得浸提液，超声辅助酶解所述浸提液获得酶解液，干燥所述酶解液获得血红裸藻多肽粗品；所述超声辅助酶解用酶为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的质量为所述浸提液质量的3.5％～4.5％，所述超声辅助酶解体系的ph值为8.4～8.6，所述超声辅助酶解的超声功率为253～255w，所述超声辅助酶解的时间为22.9～24min；2)将步骤1)中所述的血红裸藻多肽粗品以水溶解后，对获得的血红裸藻多肽溶液进行酶解、透析、干燥、重新溶解、g-75葡聚糖凝胶过滤、干燥获得血红裸藻多肽纯品；所述酶解的用酶为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的质量为所述血红裸藻多肽溶液质量的3.5％～4.5％，所述酶解的ph值为8.4～8.6，所述酶解的温度为45～55℃，所述酶解的时间为6～8h；所述透析用透析膜的截留分子量为500～1000d。
在本发明中，所述血红裸藻在加水浸提前优选的还包括预处理步骤；所述预处理步骤包括除杂、清洗、风干和剪碎。本发明对所述除杂和清洗的步骤没有特殊限定，采用本领域常规的除杂和清洗手段即可；在本发明具体实施过程中，优选的人工将明显的颗粒杂质剔除后，用去离子水清洗过滤细小颗粒杂质。本发明在所述除杂和清洗后，进行风干，所述风干的温度优选为65～75℃，更优选为70℃；本发明对所述风干的时间没有特殊限定，只要保证风干后的血红裸藻的含水量≤10％即可。本发明在所述风干后，将所述风干后的血红裸藻剪碎，本发明对所述剪碎的方法和剪碎后的力度大小没有特殊限定，采用本领域常规的手术剪刀将所述血红裸藻剪为碎片即可。
在本发明中，将剪碎后的血红裸藻加水浸提。本发明中，所述加水的体积优选为每1g(血红裸藻质量):100ml(水)，所述浸提的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h；所述加水浸提的作用为溶解血红裸藻中的蛋白。本发明在所述浸提结束后，优选的还包括过滤所述浸提液，所述过滤优选为脱脂棉过滤。本发明在所述过滤后调节所述过滤后的浸提液的ph值；所述ph值的调节优选的采用naoh溶液进行。
本发明在调节ph值后，超声辅助酶解所述浸提液获得酶解液。在本发明中，所述超声辅助酶解用酶为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的质量为所述浸提液质量的3.5％～4.5％，优选为3.8％；所述超声辅助酶解体系的ph值为8.4～8.6，优选为8.5；所述超声辅助酶解的超声功率为253～255w，优选为254w，所述超声辅助酶解的时间为22.9～24min，优选为23min。
本发明在获得所述酶解液后，优选的进行离心、活性炭吸附离心的上清液以及减压浓缩步骤。在本发明中，所述离心的转速优选为4500～5500rpm，更优选为5000rpm；所述离心的时间优选为15～25min，更优选为20min；所属离心的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。在本发明中，所述离心后，收集上清液；将所述上清液用活性炭吸附；所述活性炭吸附的时间优选为8～12min，更优选为10min。在本发明中，所述减压浓缩的温度优选为-22～-18℃，更优选为-20℃；所述减压浓缩的时间优选为8～12min，更优选为10min；所述减压浓缩的真空度优选为13.3pa。
本发明在所述减压浓缩以后，进行干燥。在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥；所述冷冻干燥的真空度优选为13.3～40pa，所述冷冻干燥的温度优选为-22～-18℃，更优选为-20℃；所述冷冻干燥的时间优选为10～14h，更优选为12h。
本发明在获得所述血红裸藻多肽粗品后，将所述的血红裸藻多肽粗品以水溶解。在本发明中，所述溶解用水的体积优选为每1g(血红裸藻质量):100ml(水)。
本发明对获得的血红裸藻多肽溶液进行酶解、透析、干燥、重新溶解、g-75葡聚糖凝胶过滤、干燥获得血红裸藻多肽纯品。
在本发明中，所述酶解用酶为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的质量为所述血红裸藻多肽溶液质量的3.5％～4.5％，优选为3.8％；所述酶解的ph值为8.4～8.6，优选为8.5；所述酶解的温度为45～55℃，优选为50℃；所述酶解的时间为6～8h，优选为7h。本发明在所述酶解后，对所述酶解液进行透析；所述透析用透析膜的截留分子量为500～1000d；所述透析的总时间优选为6h；所述透析过程中，每0.5h换水一次。本发明中，所述透析的作用为去除酶解液中的游离氨基酸，保证血红裸藻多肽的纯度。本发明在所述酶解后，进行干燥；所述干燥优选为冷冻干燥，所述冷冻干燥与上述记载的冷冻干燥的参数一致，在此不再赘述。
本发明在所述干燥后，对干燥产物进行重新溶解后，用g-75葡聚糖凝胶过滤；本发明对所述g-75葡聚糖凝胶过滤的方法和步骤没有特殊限定采用本领域常规的方法和步骤即可。本发明在所述g-75葡聚糖凝胶过滤后，收集过滤液进行浓缩和干燥。在本发明中，所述减压浓缩的温度优选为-22～-18℃，更优选为-20℃；所述减压浓缩的时间优选为8～12min，更优选为10min；所述减压浓缩的真空度优选为13.3pa。本发明在所述减压浓缩以后，进行干燥。在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥；所述冷冻干燥的真空度优选为13.3～40pa，所述冷冻干燥的温度优选为-22～-18℃，更优选为-20℃；所述冷冻干燥的时间优选为10～14h，更优选为12h。本发明在所述干燥后获得所述血红裸藻多肽纯品；所述血红裸藻多肽纯品成绿色粉末状。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)血红裸藻除杂和洗净：人工将明显的颗粒杂质剔除，用去离子水清洗过滤细小颗粒杂质；
(2)风干：将除杂洗净后的血红裸藻放置于烘干器，温度设置在70℃，烘干至水分低于10％；
(3)称量：称取10.0g；
(4)剪碎:用实验室手术剪刀，将风干后的血红裸藻剪成碎片状；
(5)加水浸提：加入去离子水1l，浸提2h
(6)脱脂棉过滤：将浸提液用脱脂棉过滤获得粗滤液
(7)用naoh溶液调节ph至8.5
(8)超声辅助胰蛋白酶酶解：胰蛋白酶最优用量为3.8％，超声辅助提取功率254w，提取时间为23min；
(9)提取后4℃5000rpm离心20min，收集上清液；
(10)将离心后的上清液放入活性炭吸附10min；
(11)使用真空浓缩仪，-20℃旋转浓缩10min；
(12)13.3～40pa，-20℃，12h冷冻干燥获得血红裸藻多肽粗品。
(13)称取血红裸藻粗品1.0g，加水100ml调节ph后进行酶解：胰蛋白酶3.8％，水解ph8.5，50℃，7h；
(14)酶解液透析，截留分子量500～1000d透析袋透析；
(15)冷冻干燥：13.3～40pa，-20℃，12h；
(16)用水溶解干燥产物；
(17)g-75葡聚糖凝胶过滤：
(18)收集滤液；
(19)使用真空浓缩仪，-20℃旋转浓缩滤液10min；
(20)13.3～40pa，-20℃，12h冷冻干燥获得血红裸藻多肽纯品。
其中步骤(17)的具体步骤如下：
1.乙醇浸泡:
在室温下，将g-75葡聚糖凝胶干粉浸泡于50～60％乙醇中至少24h，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇，滤干；
2.无盐水浸泡:
室温下，在无盐水中充分溶胀24h，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀，然后；
3.盐酸浸泡:
在常温下再用0.2nhcl浸泡12h，间隙搅拌，滤干，水洗至中性；
4.将溶胀好的凝胶脱气后(真空抽滤或超声波)根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层；
5.上样前平衡层析柱至少3-5个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止(流出液的ph值等于上柱的buffer的ph值)；
6.凝胶过滤的上样量为5％的柱床体积；
7.洗脱方法:
采用上柱时的缓冲液洗脱；在上柱buffer中加入nacl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化。
获得血红裸藻多肽纯品后，采用福林(folin)-酚试剂法测定血红裸藻多肽提取率；凯氏定氮法和重量法，测定蛋白质、低聚肽和水分含量；结果如下：
血红裸藻多肽的提取率达5.3％，蛋白质90.5％(g/100g)；小分子低聚肽81％(g/100g)；水分3.2％；分子量主要分布在500～1000d之间，游离氨基酸含量低，保证了血红裸藻多肽的纯度。
对比例1
血红裸藻除杂和洗净：人工将明显的颗粒杂质剔除，用去离子水清洗过滤细小颗粒杂质；
(21)风干：将除杂洗净后的血红裸藻放置于烘干器，温度设置在70℃，烘干至水分低于10％；
(22)称量：称取10.0g；
(23)剪碎:用实验室手术剪刀，将风干后的血红裸藻剪成碎片状；
(24)加水浸提：加入去离子水1l，浸提2h
(25)脱脂棉过滤：将浸提液用脱脂棉过滤获得粗滤液
(26)用naoh溶液调节ph至8.5
(27)超声辅助胰蛋白酶酶解：胰蛋白酶最优用量为3.8％，超声辅助提取功率254w，提取时间为23min；
(28)提取后4℃5000rpm离心20min，收集上清液；
(29)将离心后的上清液放入活性炭吸附10min；
(30)使用真空浓缩仪，-20℃旋转浓缩10min；
(31)13.3～40pa，-20℃，12h冷冻干燥获得血红裸藻多肽粗品。
(32)称取血红裸藻粗品1.0g，加水100ml调节ph后进行酶解：胰蛋白酶3.8％，水解ph8.5，50℃，7h；
(33)酶解液透析，截留分子量500～1000d透析袋透析；
(34)冷冻干燥：13.3～40pa，-20℃，12h；
(35)用水溶解干燥产物；
(36)g-75葡聚糖凝胶过滤：
(37)收集滤液；
(38)使用真空浓缩仪，-20℃旋转浓缩滤液10min；
(39)13.3～40pa，-20℃，12h冷冻干燥获得血红裸藻多肽纯品。
结果：血红裸藻多肽的提取率4.2％，蛋白质88.9％(g/100g)；小分子低聚肽79％(g/100g)；水分4％；
由上述实施例可知，本发明提供的血红裸藻多肽的提取方法，多肽提取率高，活性蛋白含量高，纯度高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。