医院不动杆菌FK2及其在降解有机污染物中的应用的制作方法

本发明涉及一种医院不动杆菌(acinelobacternosocomialis)fk2及其在降解乙酸异戊酯等污染物中的应用。

(二)

背景技术：

酯是酸(羧酸或无机含氧酸)与醇起反应生成的一类有机化合物。低级的酯是有香气的挥发性液体，高级的酯是蜡状固体或很稠的液体。几种高级的酯是脂肪的主要成分。酯难溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂，其中低分子量的酯类是无色、易挥发的气体。低分子量的酯可用作溶剂，分子量较大的酯是良好的增塑剂。如甲基丙烯酸甲酯是制造有机玻璃(聚甲基丙烯酸甲酯)的单体；聚酯树脂主要用于纤维和油漆工业，也可制成压塑粉；许多带有支链的醇形成的酯是优良的润滑油。酯还用于香料、香精、化妆品、肥皂和药品等工业。小分子酯类经排放挥发进入大气环境后，对眼及呼吸道产生刺激作用，高浓度则会产生急性中毒。

乙酸异戊酯是优良的有机溶剂，广泛用于调味、制革、人造丝、胶片和纺织品等加工工业。可用于香皂、合成洗涤剂等日化香精配方中，但主要用于食用香精配方中，可调配香蕉、苹果、草莓等多种果香型香精。但是其蒸气对眼及上呼吸道粘膜有刺激性。其有麻醉作用，接触后出现咳嗽、胸闷、疲乏、限烧灼感。高浓度时，则有头晕、发烧感受。脉速、心悸、头痛、耳鸣、震颤、恶心、食欲丧失。可引起皮肤干燥、皮炎、湿疹。

因此研究环境中乙酸异戊酯的高效降解对人类健康很有必要，通过文献检索，未发现有关不动杆菌以乙酸异戊酯为唯一碳源来实现乙酸异戊酯高效降解的报道。本发明的医院不动杆菌(acinelobacternosocomialis)fk2对乙酸异戊酯的平均降解速度高达(89.45mg/(l·h)^-1)，并且生长环境温和，易扩大培养，目前，暂无有降解乙酸异戊酯降解菌的报道。该降解菌的发现对于工业废水废气中酯类污染物的高效净化具有重要意义。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种高效、去除能力强、具有乙酸异戊酯降解能力的医院不动杆菌及其应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种新的乙酸异戊酯降解菌——医院不动杆菌(acinelobacternosocomialis)fk2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年03月01日，保藏编号：cctccno:m2019117，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

本发明医院医院不动杆菌fk2的基本特征为：菌落浅黄色，边缘整齐，不透光，光滑湿润，易挑取。透射电镜下观察该菌体的形态为球杆菌，无鞭毛，革兰氏染色阴性。

本发明还提供一种所述医院不动杆菌fk2在降解有机污染物中的应用，具体所述的应用是将医院不动杆菌fk2经扩大培养获得的静息细胞加入ph＝6-8(优选7)、含有机污染物的无机盐培养液中，在25-35℃(优选30℃)、160rpm条件下进行培养，实现有机污染物的降解。

进一步，所述有机污染物包括乙酸异戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、苯、甲苯、对二甲苯、间二甲苯或邻二甲苯中的一种或多种，优选乙酸异戊酯。

进一步，所述无机盐培养液中，静息细胞加入量以菌体干重计为30mg/l。

进一步，所述无机盐培养液中有机污染物的初始浓度为100-1500mg/l，优选100-1000mg/l。

进一步，所述无机盐培养液组成为：kh2po41g/l、znso4·7h2o0.1mg/l、na2hpo44.5g/l、(nh4)2so40.5g/l、feso4·7h2o1mg/l、mgso40.1g/l、cacl20.02g/l、feso4·7h2o1mg/l、cuso4·5h2o0.02mg/l、cocl2·6h2o0.02mg/l、mnso4·4h2o0.1mg/l、na2moo4·2h2o0.02mg/l、h3bo30.02mg/l、ph6-8，溶剂为去离子水。

进一步，所述医院不动杆菌fk2静息细胞按如下步骤制备：

(1)斜面培养：将医院不动杆菌fk2接种至lb液体培养基中，在30℃，160rpm下培养2d，使保藏的细菌活化复苏，再将活化的细菌画线于lb平板，30℃培养箱培养，取单菌落继续平板画线以检测细菌的纯度，得到可常规保持(4℃)的细菌斜面，该细菌斜面需要每三个月转接一次，以保证菌种的活性；lb固体培养基组成：5g/l酵母膏，10g/lnacl，10g/l蛋白胨，15-20g/l琼脂，ph自然，溶剂为去离子水；lb液体培养基是去除lb固体培养基中的琼脂；

(2)扩大培养：将步骤(1)斜面菌体接种至lb液体培养基中，在30℃，160rpm下培养12h，获得扩大培养液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得医院不动杆菌静息细胞；lb液体培养基组成：5g/l酵母膏，10g/lnacl，10g/l蛋白胨，ph自然，溶剂为去离子水。

与现有技术相比，本发明有益效果体现在：

本发明提供的医院不动杆菌fk2取自污水厂污泥，对于酯类，尤其是乙酸异戊酯具有较好地降解效果，可以较为完全地把污染物转化为co2、h2o等无害物质；同时，该菌株也能不同程度地降解其他工业乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲苯、乙苯、邻二甲苯等工业常见污染物，因而在工业废气废水的生物净化中具有广阔的应用前景。

本发明所述的医院不定杆菌能将乙酸异戊酯完全降解为无机物(co2、h2o)和细胞生物质，实现完全矿化，且对于1000mg/l以内的乙酸异戊酯等有机污染物的去除率高达100％。因此，该医院不动杆菌对于工业常见污染物(如乙酸异戊酯、乙酸丁酯等)具有高效的降解能力，且能承受较高浓度的污染物。

(四)附图说明

图1为acinelobacternosocomialisfk2在lb培养基上菌落形态照片。

图2为acinelobacternosocomialisfk2的透射电子显微镜照片(×15000)。

图3为acinelobacternosocomialisfk2的系统发育树图。

图4acinelobacternosocomialisfk2在6h(a)和12h(b)内对不同浓度乙酸异戊酯的降解率。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所述无机盐培养液组成为：kh2po41g/l、znso4·7h2o0.1mg/l、na2hpo44.5g/l、(nh4)2so40.5g/l、feso4·7h2o1mg/l、mgso40.1g/l、cacl20.02g/l、feso4·7h2o1mg/l、cuso4·5h2o0.02mg/l、cocl2·6h2o0.02mg/l、mnso4·4h2o0.1mg/l、na2moo4·2h2o0.02mg/l、h3bo30.02mg/l、ph6-8，溶剂为去离子水。

lb固体培养基组成：5g/l酵母膏，10g/lnacl，10g/l蛋白胨，15-20g/l琼脂，ph自然，溶剂为去离子水。

lb液体培养基组成：5g/l酵母膏，10g/lnacl，10g/l蛋白胨，ph自然，溶剂为去离子水。

实施例1：acinelobacternosocomialisfk2的分离、纯化及其鉴定。

1、acinelobacternosocomialisfk2的分离及纯化

acinelobacternosocomialisfk2是从某城市污水处理厂曝气池中活性污泥里驯化、分离得到的一株革兰氏阴性菌。活性污泥中混合液悬浮固体浓度mlss2300mg/l,混合液挥发性悬浮固体浓度mlvss1820mg/l。筛选的具体步骤如下：

在300ml摇瓶中加入50ml无机盐培养液，并加入10ml活性污泥和终浓度500mg/l的乙酸异戊酯进行富集培养，待乙酸异戊酯浓度为初始的50％时从中取出5ml富集液于50ml新鲜无机盐培养液中，加入相同量的乙酸异戊酯，重复上述富集过程5次后，将最后一次富集液梯度稀释涂布lb固体培养基，选择单菌落，画线lb平板纯化(图1)。将得到的单菌落接种至无机盐培养基，并加入终浓度500mg/l的乙酸异戊酯作为唯一的碳源及能源进行验证(设置空白对照，一个只加乙酸异戊酯作为碳源及能源，一个不加乙酸异戊酯，进行对照。加有乙酸异戊酯的培养基上，微生物长势良好，不加有机物的，无微生物生长)，筛选得到菌株fk2，通过透射电子显微镜确定其形态(图2)。

2、菌株fk2的鉴定

(1)菌株fk2特征：菌落浅黄色，边缘整齐，不透光，光滑湿润，易挑取。透射电镜下观察该菌体的形态为球杆菌，无鞭毛，大小为966×1383nm，革兰氏染色阴性。

(2)菌株对梅里埃gn卡上48种碳源的利用能力。

利用梅里埃全自动鉴定仪考察菌株对48中不同碳源的代谢情况(委托给浙江天科高新技术发展有限公司(原浙江省微生物研究所))。鉴定结果如表1所示。经梅里埃全自动鉴定仪vitek生化反应，菌株fk2可较强利用11种碳源，对其他37种碳源不能利用。

表1菌株fk2梅里埃全自动鉴定仪vitek生化反应结果(gn卡)

表注：+，阳性反应；-：阴性反应

(3)通过16srrna序列分析和生理生化实验鉴定，确定该菌株为acinelobacternosocomialis。具体步骤如下：

采用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取和纯化菌株fk2的dna，4℃保存。用细菌的通用引物对纯化的dna进行pcr扩增，引物分别为7f(cagagtttgatcctggct)和1540r(aggaggtgatccagccgca)，pcr反应程序设定为94℃预变性4min，然后94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环30个周期，最后72℃修复延伸10min。将pcr产物纯化回收后进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，16srrna(seqidno.1所示)测序结果上传至ncbi，获得登录号mk346044，同时将该序列同ncbi数据库中的基因序列进行blast对比。发现其属于acinetobacter属，与acinetobacternosocomialisstrainruh2376、acinetobacternosocomialisstrain2012c01-137和acinetobacternosocomialisstrain2014n23-120具有99％的同源性。从结果中选取9株acinetobacter具有代表性的菌株，以16srrna基因序列同源性为基础，采用mega6.0软件构建系统发育树，如图3。通过遗传距离及16srrna序列对比，鉴定为菌株fk2为acinelobacternosocomialis，命名为医院不动杆菌(acinelobacternosocomialis)fk2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年03月01日，保藏编号：cctccno:m2019117，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

实施例2医院不动杆菌fk2静息细胞的获得

(1)斜面培养：

将医院不动杆菌fk2接种至lb液体培养基中，在30℃，160rpm下培养2d，再将活化的细菌画线于固体lb平板30℃培养箱培养，取单菌落继续平板画线以检测细菌的纯度，进行lb试管斜面常规(4℃)保存。

(2)扩大培养

将步骤(1)斜面菌体接种至lb液体培养基中，在30℃，160rpm下培养12h，获得扩大培养液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得医院不动杆菌fk2静息细胞。

实施例3：医院不动杆菌fk2对不同浓度乙酸异戊酯的降解性能检测

将无机盐培养液分装于体积均为330ml的摇瓶中，每瓶50ml，110℃灭菌40min。灭菌结束后室温放置2d，确定无杂菌生长。加入终浓度达到30mg/l(以细胞干重记)实施例2方法获得的医院不动杆菌fk2静息细胞，然后加入乙酸异戊酯作为唯一碳源使其终浓度分别为100、200、400、600、800、1000、1200、1400mg/l，摇瓶用聚四氟乙烯瓶塞密封后，30℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。定时测定摇瓶中残留的乙酸异戊酯浓度，绘制菌株6h和12h对于不同初始浓度乙酸异戊酯的去除率曲线，结果见图4所示。结果表明，当乙酸异戊酯浓度低于1000mg/l时，菌株fk2可以快速的降解所添加的底物。

实施例4：医院不动杆菌fk2降解底物的广谱性

在实际应用中，不仅仅存在乙酸异戊酯这一种有机污染物，工业废气中一般包含多种挥发性有机废气(如乙酸丁酯、乙酸乙酯、苯系物等)。因此，研究医院不动杆菌fk2对其他底物的降解效果很有必要。

接种终浓度达到30mg/l(以细胞干重计)实施例2方法获得的医院不动杆菌fk2静息细胞至无机盐培养液中，加入终浓度均为100mg/l的乙酸丁酯、乙酸乙酯、苯、甲苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯，在ph值为7.0，温度30℃，160rpm的条件下培养，医院不动杆菌fk2不同底物的降解效果如表2所示。

表2医院不动杆菌fk2对不同碳源的降解效果

如表2所示：菌株fk2只能少部分降解苯、甲苯、乙苯、对二甲苯等苯系物；乙酸丁酯、乙酸乙酯和异丙醇溶于水，溶解度相对较大，所以其去除率要高很多。进一步表明，细菌fk2能不同程度的降解苯、甲苯、乙酸乙酯、乙酸丁酯及异丙醇等类的碳氢化合物。

虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更改与润饰，均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>医院不动杆菌fk2及其在降解有机污染物中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>1138

<212>dna

<213>医院不动杆菌(acinetobacternosocomialis)

<400>2

cagcgggcagcacacagcaagcgagcggagagaaggagcgcacgaaccagcggcggacgg60

ggagaagcaggaacgccaaggggggacaacaccgaaagggagcaaaccgcaacgccacgg120

gagaaagcaggggaccggaccgcgcaaagagagccaagcggaagcagggggggaaaggcc180

accaaggcgacgacgagcgggcgagaggagaccgccacacgggacgagacacggcccaga240

cccacgggaggcagcagggggaaaggacaagggcgcaagccgaccagccagccgcgggga300

agaaggccagggaaagcacaagcgaggaggaggcacagaaaaccagagaagggacgaccg360

cagaaaagcaccggcaaccggccagcagccgcggaaacagaggggcaagcgaacggaacg420

ggcgaaagcgcgcgaggcggcaaaagcaaaggaaaccccgagcaacgggaagcacgaacg480

gagcagagggggagaggaggagaaccagggagcgggaaagcgagagacggaggaaaccga540

ggcgaaggcagccacggccaacacgacgcgagggcgaaagcaggggagcaaacaggaaga600

acccggagccagccgaaacgagcacagccgggggccgaggcagggcgcagcaacgcgaaa660

gagaccgccggggagacggcgcaagacaaaaccaaagaagacgggggcccgcacaagcgg720

ggagcagggaacgagcaacgcgaagaaccaccggccgacaagaagaacccagagaggagg780

gcccgggaacacaacagggcgcaggcgcgcagccggcggagaggggaagcccgcaacgag840

cgcaacccccagccagcgagaagcgggaacaaggaacgccaggacaaacggaggaaggcg900

gggacgacgcaagcacaggcccacggccagggcacacacggcacaaggcggacaaagggg960

cacacagcgaggagcaaccaaaaagccgacgagccggaggagcgcaaccgacccagaagc1020

ggaacgcagaacgcggacagaagccgcgggaaacgcccgggccgacacaccgcccgcaca1080

ccagggagggcaccagaagagcagccaacgcaaagagggcggaccacggggccgagcg1138