一株耐受锌离子毒性的无色杆菌及其应用的制作方法

本发明属于污水生物处理领域，具体涉及一种在好氧条件下能够耐受锌离子毒性且能够将水体中的硝酸盐氮同步脱除的无色杆菌及其在污水处理中的应用。

背景技术：

随着我国城市化、工业化的加速，工业生产的不断发展，大量的工业废水产生，对人类生活和健康产生了极大的威胁。由于我国的工业废水处理能力尚不能跟上工业用水的规模，导致仍然有部分工业废水未经处理直接排入城镇污水管网。锌离子作为一种重要的工业材料，被广泛应用于化工、冶金、电镀、制革和涂料行业，这些行业会产生大量的含锌废水，这些废水也不可避免的进入城镇污水处理厂。研究表明，zn(ii)浓度超过10mg/l会对传统反硝化作用中n2o的还原过程、反硝化速率和反硝化微生物活性产生明显的抑制，同时，改变微生物群落结构，进而影响城镇污水处理系统的出水质量。

近年来，好氧反硝化作用(即在有氧条件下将硝酸盐氮还原为含氮气体的过程)的发现为单一好氧反应器中实现同步硝化反硝化的提供了理论基础。自从第一株好氧反硝化菌t.pantotropha被成功分离后，近年来更多的高效好氧反硝化菌株得到分离，并被应用于实际污水处理系统中。好氧反硝化作用作为一种新型生物脱氮技术，因其工艺简单、脱氮效果好、不需补加酸碱等优势近年来得到了快速发展。

针对含锌废水进入生活污水，zn(ii)和硝酸盐氮共存的问题，如何有效地避免锌离子对硝酸盐氮去除的影响成为人们关注的焦点，因此，发掘具有耐受锌离子毒性的好氧反硝化细菌，并将其应用于污水处理中，将会有效削减锌离子对污水生物脱氮过程的潜在风险，为保障城镇污水处理系统的正常运行具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种耐受锌离子毒性的高效好氧脱氮菌株，通过该菌株强化污水处理系统的生物脱氮效果，以削减高浓度锌离子的存在对污水处理生物脱氮过程的影响。

本发明所提供的无色杆菌(achromobactersp.)是一株具有在单一好氧环境中实现硝酸盐氮去除能力的好氧反硝化细菌。

本发明通过下述技术方案予以实现：

本发明提供的具有锌离子耐受能力的无色杆菌(achromobactersp.)，其保藏号为cgmccno.2964。

如上所述的无色杆菌(achromobactersp.)，其特征在于：在不同锌离子浓度水平条件下，菌株achromobactersp.依然能够保持完整的细胞结构，细胞膜不被破坏。

如以上所述的无色杆菌(achromobactersp.)，其特征在于：该菌株能够在高浓度锌离子条件下以硝酸盐氮为氮源，以有机物为碳源进行好氧反硝化作用，从而将硝酸盐氮去除。

如以上所述的无色杆菌(achromobactersp.)在污水处理中的应用，其特征在于：在含锌污水中加入无色杆菌(achromobactersp.)，并且添加适量的碳源进行曝气，即可实现污水中硝酸盐氮的去除。

以上所述的方法，其特征在于：控制所述含锌污水中的温度为30℃，ph值为7.5，溶解氧为6mg/l，初始c/n比为4。

以上所述的方法，其特征在于：污水中锌离子浓度范围为0～50mg/l时，硝酸盐氮的去除率可达100％，总氮的去除率也可达100％。

本发明的有益效果是：

(1)本发明的无色杆菌(achromobactersp.)能够在高浓度锌离子条件下，以硝酸盐氮为氮源，以有机物为碳源进行好氧反硝化作用，实现硝酸盐氮的高效去除；解决了传统废水处理中生物脱氮需要采取缺氧反硝化、好氧硝化分段处理的问题；另外，简化了工艺流程，节省了设备和投资的成本，因此，具有巨大的经济效益和环保效益；

(2)将该菌株接种到含锌污水的生物处理中，在0～50mg/lzn(ii)存在条件下，优选的，在0～25mg/lzn(ii)存在条件下，25h内硝酸盐氮的去除率可达100％，说明菌株具有较强的耐受锌离子毒性和好氧反硝化能力。这种特性使得该菌株在城镇污水处理系统的实用性大大增强。

附图说明

图1为无色杆菌在锌离子存在条件下的扫描电镜图像。

图2为无色杆菌在10mg/lzn(ii)存在条件下的好氧反硝化特性。

图3为无色杆菌在25mg/lzn(ii)存在条件下的好氧反硝化特性。

图4为无色杆菌在50mg/lzn(ii)存在条件下的好氧反硝化特性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1.利用扫描电镜观察无色杆菌在锌离子存在时的表观形态

本实验所用高效好氧反硝化菌株为无色杆菌(achromobactersp.)，其分离自垃圾填埋场渗滤液处理系统。

将无色杆菌(achromobactersp.)接种于1l的lb培养基中(每升含nacl5g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g)，防止杂菌的侵入及保持菌体的生长活力，进行富集培养。将培养得到的菌液离心，用0.5％的nacl洗涤三次，制成光密度od600为1-2的菌悬液。然后再将菌悬液按10％的接种量分别接种于含有25mg/lzn(ii)的lb培养基中，8h后取样在8000rpm和4℃条件下离心5min去除上清液，并用pbs(磷酸盐缓冲液)清洗两次。用2.5％戊二醛固定1h，乙醇梯度洗脱后分散在无水乙醇中，取少量滴在硅片上晾干，在扫描电镜(sem)下观察细胞形态。

结果如图1所示，当锌离子浓度为25mg/l时，菌株achromobactersp.呈现完整和光滑的表面，说明菌株细胞形态对锌离子具有较强的耐受性。

实施例2.无色杆菌在10mg/lzn(ii)存在条件下的好氧反硝化特性

反硝化性能测试培养基(bm)配方为每升水中：8.45gch3coona,0.63gnh4cl,0.61gnano3,1.76gk2hpo4·3h2o,0.20gmgso4·7h2o,0.02gcacl2,0.005gfeso4·7h2o,0.1ml微量元素溶液。将培养基ph值调至7.5，在121℃灭菌30min。

将无色杆菌(achromobactersp.)接种于含有10mg/lzn(ii)的bm培养基中，在30℃和150rpm条件下进行震荡培养，每隔5h用具阀进样针分别抽取100μl顶空气体用于测定n2o，用无菌注射器抽取2ml气体注入到2l纯氦气袋中用于测定no。与此同时，用无菌注射器抽取2ml菌悬液，菌液在4℃下8000rpm离心5min，取上清液用于分析氨氮，硝酸盐氮、亚硝酸盐氮浓度。

结果如图2所示，100mg/l硝酸盐氮在接种后立即被菌株利用，并在10h内被完全消耗，硝酸盐氮的平均去除速率为10.0mg/l/h。随着硝酸盐氮的还原，亚硝酸盐氮快速积累，并在10h达到最高值32.1mg/l，然后在20h被还原。n2o也逐渐积累，在10h达到最高值0.42mg/l，然后在25h被全部还原。反硝化过程的中间产物no积累量的最高值为82.5μg/l，积累量较少，说明在10mg/lzn(ii)存在的条件下菌株仍能较好的发挥好氧反硝化的能力。

实施例3.无色杆菌在25mg/lzn(ii)存在条件下的好氧反硝化特性

将无色杆菌(achromobactersp.)接种于含有25mg/lzn(ii)的bm培养基中，测试其好氧反硝化性能。结果如图3所示，100mg/l硝酸盐氮在接种后立即被菌株利用，并在25h内被完全消耗，硝酸盐氮的平均去除速率为4mg/l/h。随着硝酸盐氮的还原，亚硝酸盐氮逐渐积累，并在15h达到最高值33.4mg/l，然后在25h被还原。n2o也逐渐积累，在20h达到最高值1.01mg/l，然后在45h被全部还原。必须指出，此时反硝化过程的中间产物no积累量的最高值为83.1μg/l，只占硝酸盐氮去除量的0.083％。由此可以看出，菌株在25mg/lzn(ii)条件下依然具有高效好氧反硝化的能力。

实施例4.无色杆菌在50mg/lzn(ii)存在条件下的好氧反硝化特性

将无色杆菌(achromobactersp.)接种于含有50mg/lzn(ii)的bm培养基中，测试其好氧反硝化性能。结果如图4所示，100mg/l硝酸盐氮在接种后立即被菌株利用，并在25h内被完全消耗，硝酸盐氮的平均去除速率为4.0mg/l/h。随着硝酸盐氮的还原，亚硝酸盐氮逐渐积累，并在20h达到最高值33.5mg/l，然后在30h被还原。同时，n2o也逐渐积累，在25h达到最高值1.23mg/l，然后在35h被全部还原。必须指出，此时反硝化过程的中间产物no积累量的最高值为17.3μg/l，只占硝酸盐氮去除量的0.017％。由此可以看出，菌株在50mg/lzn(ii)条件下依然具有高效好氧反硝化的能力。

实施例5.无色杆菌在100mg/lzn(ii)存在条件下的好氧反硝化特性

将无色杆菌(achromobactersp.)接种于含有100mg/lzn(ii)的bm培养基中，测试其好氧反硝化性能。该菌株的生长受到明显的抑制，且硝酸盐氮几乎不被去除，由此可以看出，100mg/lzn(ii)是该菌株的上限浓度，菌株在该条件下不具备好氧反硝化的能力。但是从上述实施例1-4中可以看出，将该菌株接种到含锌污水的生物处理中，在0～50mg/lzn(ii)存在条件下，硝酸盐氮的去除率可达100％，说明菌株具有较强的耐受锌离子毒性和好氧反硝化能力(见表1)。

表1无色杆菌在不同浓度zn(ii)存在条件下的脱氮特性

实施例6.无色杆菌和施氏假单胞菌在50mg/lzn(ii)存在条件下的好氧反硝化特性

将无色杆菌(achromobactersp.)和施氏假单胞菌(p.stutzeri)接种于含有50mg/lzn(ii)的bm培养基中，测试其好氧反硝化性能。结果如表2所示，100mg/l硝酸盐氮在接种后立即可被无色杆杆菌利用，硝酸盐氮的最大去除速率为5.8±0.5mg/l/h，且最终产物为n2，说明反硝化过程未受到抑制。而施氏假单胞菌在50mg/lzn(ii)存在的条件下，最大硝酸盐氮去除速率仅为2.9±0.4mg/l/h，尽管最终反硝化产物也为氮气，但速率仅为无色杆菌的一半。众所周知，施氏假单胞菌是典型的反硝化菌株，通过对比不难发现，本发明提出的无色杆菌在高效好氧反硝化的同时，能够对zn(ii)有较高的耐受能力(见表2)。

表2无色杆菌和施氏假单胞菌在50mg/lzn(ii)存在条件下的好氧反硝化特性比较

实施例7.无色杆菌在含锌废水中的应用

将无色杆菌投加入活性污泥系统处理含锌废水，连续曝气保持体系溶解氧为6mg/l，废水水质如下：ph为7.5，硝酸盐氮含量100mg/l，zn(ii)50mg/l。结果如表2所示，在普通活性污泥系统内，好氧条件下总氮去除率较低；加入50mg/lzn(ii)好氧脱氮性能受到了影响。然而，经无色杆菌强化后的系统，36h的硝酸盐氮去除率为96.4％，总氮去除率为90.5％(见表3)。

表3.无色杆菌应用于活性污泥体系中的生物脱氮结果

由此可见，针对含锌废水进入生活污水，zn(ii)和硝酸盐氮共存的问题，本发明所涉及到的菌株可以有效的避免锌离子对硝酸盐氮去除的影响，并可以广泛的应用于污水处理中，会有效削减锌离子对污水生物脱氮过程的潜在风险，为保障城镇污水处理系统的正常运行具有重要意义。

应当说明的是，以上实施例只是为了对本发明作进一步详细的描述，不是用来对本发明进行限定的，在不脱离本发明的构思和精神的范围内，本领域普通技术人员，可以进行各种改进或变化，仍然属于本发明所附的权利要求的保护范围。