一株广谱抗病的贝莱斯芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物领域，具体涉及生物防治领域，更具体涉及贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

生菜由于富含蛋白质、糖类和维生素等营养成分，在世界各地普遍栽培，倍受消费者青睐，近年来成为设施叶菜的主栽类型(时月，张慧君，袁伟杰，丁真真，马越，王宇滨，赵晓燕，张超.led光照处理对鲜切生菜品质和风味的影响[j].现代食品科技，2019，35(5):1-8.)，以北京市为例，其也是播种面积最大的绿叶蔬菜之一(雷喜红，李蔚，孙朝华，李新旭，冯颖，王艳芳.蔬菜工厂化生产(八)高品质生菜水培生产技术[j].中国蔬菜，2019(02):87-91.)。生菜在栽培过程中的常见病害包括菌核病、细菌性软腐病等，给蔬菜产业带来了严重的损失(周慧敏，谢学文，李宝聚.李宝聚博士诊病手记(四十)生菜菌核病的诊断、发生规律及防治技术[j].中国蔬菜，2011(19):23-25；晋知文，谢学文，马墨，柴阿丽，石延霞，李宝聚.蔬菜细菌性软腐病防治药剂活体组织筛选技术[j].植物保护学报，2017，44(2):269-275.)。并且随着我国生菜生产趋于产业化和规模化，近年来连作导致生菜发病日趋严重。生菜菌核病和细菌性软腐病分别主要由菌核菌(sclerotiniasclerotiorum)、胡萝卜果胶杆菌(pectobacteriumcarotovorum)引起，是世界范围内的重要病害(晋知文，谢学文，马墨，柴阿丽，石延霞，李宝聚.蔬菜细菌性软腐病防治药剂活体组织筛选技术[j].植物保护学报，2017，44(2):269-275.；李海波，张付平，徐秉良，薛应钰.六种杀菌剂对制种生菜菌核病防治效果[j].植物保护，2010，36(01):151-154.；刘彬，江小红，王桂英.生菜软腐病综合防治技术[j].上海蔬菜，2017(01):38,40.)，严重影响着生菜的产量和品质。

在现有防治措施中，生物防治相对于化学防治，较为符合绿色、安全的现代农业发展需求，对土传病害防治效果较好(周京龙，冯自力，冯鸿杰，李云卿，袁媛，李志芳，魏锋，师勇强，赵丽红，孙正祥，朱荷琴，周燚.棉花内生蜡状芽孢杆菌yupp-10对棉花黄萎病的防治作用及机制[j].中国农业科学，2017，50(14):2717-2727.)；也避免了选育抗病新品种周期过长的缺点，有望成为防治生菜菌核病、细菌性软腐病的新兴途径。目前在植物菌核病、软腐病等病害防治领域，研究报道较多的生防菌主要包括放线菌、真菌以及细菌中的假单孢菌属和芽孢杆菌属等(张猛，王琼，冯发运，袁建军，余向阳.植物内生特基拉芽胞杆菌的分离、鉴定及防治西瓜枯萎病效果[j].中国生物防治学报，2017，33(3):371-377.；刘邮洲，梁雪杰，乔俊卿，刘永锋，邵明灿.梨果贮藏期病害拮抗细菌的筛选、鉴定和评价[j].中国生物防治学报，2017，33(1):121-127.)。陈亚菲(陈亚菲，张强，高小宁，秦虎强，黄丽丽，韩青梅.植物内生放线菌hhs.015^t对油菜菌核病的防治效果[j].西北农业学报，2013，22(6):162-167.)从大棚黄瓜根部组织筛选得到一株植物内生放线菌hhs.015^t，可显著抑制菌核菌丝生长和菌核萌发，大田试验中喷施发酵液，防效可达41.27％。周丽洪(周丽洪，李淼，姬广海.防治软腐病的魔芋内生细菌的筛选与鉴定[j].云南农业大学学报(自然科学)，2015，30(4):547-553.)通过平板初筛、温室复筛试验，获得对魔芋软腐病具有良好防治效果的生防菌m2解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)、m3枯草芽孢杆菌(b.subtilis)和1-7成团泛生菌(pantoeaagglomerans)，温室防效分别达到了32.3％、74.0％和54.2％。前人研究表明生防细菌能产生蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶等水解酶，这是生防细菌发挥抑制作用的重要因素之一(孔庆科，丁爱云.内生细菌作为生防因子的研究进展[j].山东农业大学学报(自然科学版)，2001(2):256-260.)。魏海雷等(魏海雷，王烨，张力群，唐文华.生防菌株2p24与cpf-10的鉴定及其生防相关性状的初步分析[j].植物病理学报，2004，34(1):80-85.)研究发现这类代谢产物对某些病原菌具抑制或致死作用；如纤维素和蛋白是真菌细胞壁的主要成分，生防菌在代谢过程中分泌的纤维素酶、蛋白酶可能会对其产生裂解作用；几丁质酶能降解真菌菌丝末端新合成的几丁质，从而抑制病原真菌的生长(郑秀丽，郑爱萍，宋永燕，周华强，谭芙蓉，李平.抑制真菌病害几丁质酶产生菌的筛选、鉴定[j].西南农业学报，2006(3):423-427.；arorank,kimmj,kangsc,etal.roleofchitinaseandβ-1,3-glucanaseactivitiesproducedbyafluorescentpseudomonadandinvitroinhibitionofphytophthoracapsiciandrhizoctoniasolani[j].canadianjournalofmicrobiology,2007,53(2):207-212.)。目前，芽孢杆菌因其生长快、营养简单、耐热耐盐碱，定殖能力强等优点(陈太春.秦岭森林土壤芽孢杆菌的分离筛选、鉴定及抑菌作用研究[d].西北农林科技大学，2011，硕士论文.)，成为了世界范围内研究较多的生防菌。美国已有3个枯草芽孢杆菌gb03、mb1600、qst713和1个解淀粉芽孢杆菌fzb42获得商品化生产许可。虽然国内外利用芽胞杆菌做生防菌的研究都取得一定进展，但是芽孢杆菌作为生防菌防治病害的研究大多还处于试验阶段(陈志谊，刘永峰，刘邮洲，张荣胜.植物病害生防芽孢杆菌研究进展[j].江苏农业学报，2012，28(5):999-1006.；郑雪芳，刘波，朱育菁，葛慈斌，刘国红.番茄青枯病生防芽胞杆菌的筛选与鉴定[j].中国生物防治学报，2016，32(5):657-665)。

目前，细菌性病害的防治以预防为主，且市场上缺乏针对细菌性软腐病的专一性杀菌剂(晋知文，谢学文，马墨，柴阿丽，石延霞，李宝聚.蔬菜细菌性软腐病防治药剂活体组织筛选技术[j].植物保护学报，2017，44(2):269-275.)。而关于生防菌防治果蔬细菌性软腐病，目前国内针对魔芋软腐病和白菜软腐病的研究居多，但是针对生菜软腐病生防菌的研究还未见报道(周丽洪，李淼，姬广海.防治软腐病的魔芋内生细菌的筛选与鉴定[j].云南农业大学学报(自然科学)，2015，30(4):547-553.；王超，李宏伟，王翠.防治大白菜软腐病细菌菌株的筛选与鉴定[j].江苏农业科学，2013，41(12):114-117.)。而关于生防菌防治菌核病的研究多集中于油菜，但是对生菜菌核病生防菌的研究较少。

而芽孢杆菌作为重要的生物防治资源，能够产生多种抗菌蛋白及脂肽类物质，在防治植物病害、抑制病原真菌生长繁殖中发挥着重要作用(孔庆科，丁爱云.内生细菌作为生防因子的研究进展[j].山东农业大学学报(自然科学版)，2001(2):256-260.)。扈进冬(扈进冬，吴远征，李纪顺，魏艳丽，陈泉，杨合同.拮抗性多粘类芽孢杆菌pb-2及其制剂对葡萄霜霉病的防效测定[j].山东科学，2014，27(3):30-33)等研究发现，多粘类芽孢杆菌pb-2能够产生多种胞外胞壁降解酶，并产生多肽类抗菌物质，因此其无菌滤液对葡萄霜霉病菌具有较好的抑制作用；谢雪迎(谢雪迎，王贻莲，扈进冬，李纪顺，杨合同.葡萄霜霉病拮抗细菌bmjbn02的筛选及其抑菌效果研究[j].山东科学，2015，28(3):39-44，73.)等研究发现，巨大芽孢杆菌bmjbn02能抑制葡萄霜霉病菌孢子囊的萌发，也明显降低了葡萄叶片霉层的面积，这可能与其在生长过程中产生纤维素酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶有关。虽有从番茄、棉花、烟草土壤中分离到的芽孢杆菌对菌核病具有防治效果的报道，但未见针对单株生防菌同时防治菌核、软腐病菌的研究(郑雪芳，刘波，朱育菁，葛慈斌，刘国红.番茄青枯病生防芽胞杆菌的筛选与鉴定[j].中国生物防治学报，2016，32(5):657-665.；李全胜，谢宗铭，刘政，张国丽，武冬梅，田英.棉花黄萎病拮抗细菌h14的筛选鉴定及其拮抗机理分析[j].植物保护学报，2018，45(6):1204-1211；曹明慧，冉炜，杨兴明，沈其荣，沈标.烟草黑胫病拮抗菌的筛选及其生物效应[j].土壤学报，2011，48(1):151-159.)。

技术实现要素：

本文针对北京地区生菜菌核和软腐病原性腐烂严重的现状，通过定向筛选从发病生菜根际土壤中，经富集培养筛选出一株具有生防效果的bpc6菌株。虽然是从发病生菜根际土壤中筛选获得，但经研究发现其对多种细菌性病害和真菌性病害都具有广谱的抑菌和防治作用，可提供一种绿色、无公害的广谱生物防治菌株。

通过形态学、生理生化特征和分子生物学(16srdna和ani分析)鉴定，结果表明bpc6为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)。因此，本发明首先提供一种贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)菌株，其于2019年5月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.17805。

本研究发现bpc6贝莱斯芽孢杆菌不仅对生菜菌核病菌、生菜细菌性软腐病菌，而且还对灰葡萄孢菌、腐皮镰孢菌、尖孢镰刀菌、青霉菌、立枯丝核菌、西瓜嗜酸菌、丁香假单胞菌、水稻黄单胞菌、青枯雷尔氏菌和边缘假单胞菌均表现出良好的抑菌效果，表明该菌株具有对真菌和细菌的广谱抑菌活性。因此，本发明还提供所述菌株在植物细菌性病害或真菌性病害的生物防治中的应用。

优选地，其用于防治对象是优选所述病害由属于下述属的病菌所引起：真菌sclerotinia、botrytis、fusarium、penicillium、rhizoctonia或细菌pectobacterium、acidovorax、pseudomonas、xanthomonas、ralstonia。

更优选地，其用于防治对象是是由西瓜嗜酸菌(acidovoraxcitrulli)、丁香假单胞菌(pseudomonassyringaepv.tomato)、水稻黄单胞菌(xanthomonasoryzaepv.oryzae)、青枯雷尔氏菌(ralstoniasolanacearum)、灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)、腐皮镰孢菌(fusariumsolani)、尖孢镰刀菌(f.oxysporum)、青霉菌(penicilliumsp.)、立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)、菌核菌(s.sclerotiorum)、胡萝卜果胶杆菌(p.carotovorum)和边缘假单胞菌(p.marginalis)所引起的植物病害。

进一步优选，防治对象是生菜菌核病、生菜细菌性软腐病、番茄灰霉病、菊花茎腐病、橘子青霉病、棉花枯萎病、黄瓜立枯病、西瓜细菌性果斑病、番茄细菌性斑点病、水稻白叶枯病、番茄青枯病、或芹菜细菌性茎腐病。

最优选，其用于防治对象是生菜菌核病，或生菜细菌性软腐病。

在一个实施方式中，在上述应用中，将所述菌进行培养得到发酵液或过滤液，再将其稀释后，喷施到植株上。

在优选实施方式中，将所述菌进行培养得到发酵液培养至od600至4至8之间，优选5至6之间；发酵液稀释倍数为5～20倍，优选10～15倍,其od600＝0.3～2.0,优选为至od600＝0.5～1.0。

在另外的实施方式中，将所述菌的发酵液离心收集上清液，经微孔滤膜过滤后得无菌过滤液。

在某些实施方式中，只喷施一次，而另一些方式中，每隔15天喷施一次，共喷施2～4次。

在更具体实施方式中，用于生菜菌核病，或生菜细菌性软腐病生物防治，其自生菜定植20d起，每隔15d喷施一次所述菌的发酵液，共喷施三次。

本发明获得一株生防效果好且不同于现有技术的贝莱斯芽孢杆菌bpc6。一般认为，芽孢杆菌在ph7.0左右的环境中生长良好，ph低于6.0或高于8.0时生长受到显著抑制。而贝莱斯芽孢杆菌bpc6在ph9.0的lb液体培养基中仍生长良好，而且对nacl的浓度耐受能力达到10％，说明bpc6菌株具有一定的耐盐碱性。因此，该生防菌贝莱斯芽孢杆菌bpc6生存力强、适应性广、性能稳定，有望应用于盐碱地等复杂多样的生态环境中发挥生防作用。在应用方面，通过平板对峙培养表明，贝莱斯芽孢杆菌bpc6不仅对生菜菌核病菌、生菜细菌性软腐病菌，而且还对灰葡萄孢菌、腐皮镰孢菌、尖孢镰刀菌、青霉菌、立枯丝核菌、西瓜嗜酸菌、丁香假单胞菌、水稻黄单胞菌、青枯雷尔氏菌和边缘假单胞菌均表现出良好的抑菌效果，表明该菌株具有对真菌和细菌的广谱抑菌活性，具有生防开发利用潜力。而通过盆栽和大田实验也验证了其对生菜菌核病、生菜细菌性软腐病具有显著地防治效果。此外，还通过安全性试验，表明该菌株对环境和动物植物是安全的，因而也能够实际应用于田间的生物防治中。

本发明的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株bpc6已于2019年5月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc)(地址中国北京)，保藏编号为cgmccno.17805。

附图说明

图1显示bpc6菌落形态

其中，a：单菌落形态；b：革兰氏染色

图2基于16srdna序列构建的系统发育进化树

图3显示bpc6发酵原液、滤液和挥发性物质对菌核菌及软腐菌的抑菌效果

其中，a：菌核菌ck；b：bpc6挥发性物质对菌核菌的抑菌效果；c：bpc6发酵原液及滤液对菌核菌的抑菌效果；d：软腐菌ck；e：bpc6挥发性物质对软腐菌的抑菌效果；f：bpc6发酵原液及滤液对软腐菌的抑菌效果

图4bpc6对植物病原真菌的广谱性抑菌试验

其中，a1～e1依次为灰葡萄孢菌、腐皮镰孢菌、青霉菌、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌在平板上的生长情况；a2～e2依次为灰葡萄孢菌、腐皮镰孢菌、青霉菌、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌与bpc6发酵原液和滤液在平板上对峙培养后的生长情况。

图5bpc6对植物病原细菌的广谱性抑菌试验

其中，a：西瓜嗜酸菌；b：丁香假单胞菌；c：水稻黄单胞菌；d：青枯雷尔氏菌；e：边缘假单胞菌

图6bpc6对软腐病、菌核病盆栽防效试验

其中，a1：bpc6+软腐菌处理；a2：软腐菌(ck)；b1：bpc6+菌核菌处理；b2：菌核菌(ck)

图7bpc6生防酶检测结果

其中，a：纤维素酶；b：酪蛋白酶；c几丁质酶

图8bpc6耐盐生长曲线

图9bpc6耐碱生长曲线

图10bpc6安全性评价

其中，a：bpc6血平板；b：bpc6处理白菜；c：bpc6处理洋葱；d：bpc6处理牛油果；e：bpc6处理辣椒；f：bpc6处理大葱

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实质并不限于下述实施例。

下述实施例中用到的培养基是常规的。如lb培养基(固、液)、pda培养基、柠檬酸盐利用培养基、淀粉水解培养基参考东秀珠等的报道(东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[m].北京:科学出版社,2001,186-188.)。几丁质培养基：胶状几丁质15g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o0.01g，k2hpo40.7g，kh2po40.3g、琼脂20g，定容至1000ml，ph7.0～7.2。纤维素培养基：蛋白胨10g，酵母粉10g，羧甲基纤维素钠10g，nacl5g，kh2po41g，琼脂20g，定容至1000ml，ph7.0。酪蛋白培养基：葡萄糖10g，酵母粉4g，酪蛋白10g，k2hpo41g，mgso4·7h2o0.2g，蒸馏水1000ml，ph7.0。

数据统计与分析采用excel和spss处理，并进行duncan’s新复极差法进行方差分析。

实施例一菌株bpc6的分离

采集北京市昌平区兴寿镇麦庄村发病生菜根围土样共10份。采用梯度稀释涂布平板法分离细菌，将10g土样置于100ml无菌水中，28℃、180r/min振荡培养1h制备成土样悬浮液，用无菌水将土悬液分别稀释成10^-3、10^-4、10^-5梯度，各吸取100μl均匀涂布于lb固体培养基，28℃培养24h，挑取颜色、形态等不同性状的单菌落纯化。

将纯化后的菌株及胡萝卜果胶杆菌接种于10mllb培养基中，180r/min、28℃恒温培养16h，取100μl胡萝卜果胶杆菌悬液涂布于lb培养基，基于距中心2cm处的4个点上打孔，直径0.8cm，分别加入100μl纯化后待测菌液，再于28℃继续培养，72h后观测对胡萝卜果胶杆菌抑菌带情况。打取直径为0.5cm的菌核菌菌饼，接种至pda培养基中心，基于距中心2cm处的4个点上打孔，直径0.8cm，分别加入100μl纯化后待测菌液，再于28℃继续培养；设置pda平板中心仅接种菌核菌饼作为对照。待对照组中菌核菌菌丝长满平板，观测对菌核菌抑菌带情况。选取抑菌效果最好的一株菌株作为初步筛选得到的对软腐菌、菌核菌有防效的菌株，命名为bpc6。

实施例二菌株bpc6的生理生化特性鉴定

1、形态特征鉴定

参照东秀珠等(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[m].北京:科学出版社，2001，186-188.)中的方法，观察bpc6在lb固体培养基上的菌落形态，通过革兰氏染色，观察bpc6形态特征。

经lb培养的bpc6，形态如图1a所示，菌落直径为0.95～12.3mm，呈乳白色，不透明，菌落形态不规则，表面状态光滑、湿润、有光泽，中央凸起，边缘形态整齐，无气味。镜检为革兰氏阳性菌，呈球杆状、杆状，大小为(0.6～1.0)μm×(2.0～4.0)μm，有芽胞(图1b)。

2、生理生化试验

参照东秀珠等(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[m].北京:科学出版社，2001，186-188.)中的方法。通过淀粉水解、触酶反应、柠檬酸利用、碳水化合物利用等试验，进行生防细菌生理生化检测。结果表明淀粉水解试验、柠檬酸盐试验、v-p试验、甲基红试验、硝酸盐还原试验和接触酶试验为阳性，能够利用鼠李糖、甲基葡萄糖苷、异麦芽糖和蜜二糖，无法利用阿拉伯糖、菊糖和山梨糖醇(表1)。

表1bpc6生理生化特征

注：+：阳性反应；-：阴性反应。

实施例三菌株bpc6的分子生物学鉴定

1、采用easypureplantgenomic(北京全式金生物技术有限公司)试剂盒提取dna，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度。以提取的基因组dna为模板，用细菌通用引物扩增16srdna序列。引物bsf(27f)：agagtttgatcctggctcag；bsr(1541r)：aaggaggtgatccagccgca。pcr反应条件：95℃，4min；94℃，40s，55℃，45s，72℃，1min，32个循环；72℃，5min。pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测后，由北京博迈德公司完成测序，测得的序列如seqidno：3所示。将测得的16srdna序列在ncbi核酸数据库上采用blast程序进行同源性搜索，并通过megax软件，采用neighbor-joiningtree法构建16srdna系统发育树(重复抽样1000次)，如图2所示。

结果表明：菌株bpc6与b.velezensis和b.anyloliquefaciens的相似性最高，均为91％。

2、使用柏尔dna快速建库试剂盒构建bpc6细菌基因组dna文库。将构建好的基因组文库于illuminahiseqxten测序平台进行双端150bp(pe150)测序完成全基因组测序。对基因组测序的数据进行质控和预处理后，使用soapdenovo组装软件进行组装。利用pyani对包含bpc6在内的439株芽孢杆菌使用mummer进行两两比对，根据比对结果计算一致性矩阵，获得bpc6与其他芽孢杆菌间的全基因组平均核苷酸同源性(averagenucleotideidentity，ani)值，结果如表2所示(展示了与bpc6相比ani值最高的前20株菌的信息及ani比对结果。)，菌株bpc6与b.velezensiscc09(genbankaccession:gca_001593395.2)ani值最接近，为99.54％％。

表2bpc6与其它芽孢杆菌的平均核苷酸同源性(ani)值

根据bpc6的分子鉴定结果，结合形态学及生理生化特征，可以将菌株bpc6鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)。

实施例四菌株bpc6的生防实验

1、供试植物病原菌

西瓜嗜酸菌(acidovoraxcitrulli)、丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)、水稻黄单胞菌(xanthomonasoryzae)、青枯雷尔氏菌(ralstoniasolanacearum)由中国农业大学张力群教授馈赠；灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)、腐皮镰孢菌(fusariumsolani)、尖孢镰刀菌(f.oxysporum)、青霉菌(penicilliumsp.)、立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)、菌核菌(s.sclerotiorum)、胡萝卜果胶杆菌(p.carotovorum)和边缘假单胞菌(p.marginalis)保存于本实验室。

2、bpc6平板拮抗测定

将活化后生长良好的bpc6、胡萝卜果胶杆菌(p.carotovorum)分别接种于50mllb培养基中，180r/min、28℃恒温培养16h，使其浓度达到od600＝1.8～2.2，制成种子液。将10μlbpc6种子液加入100mllb培养基中，摇菌至od600＝5～6，即制成发酵液,置于4℃备用。将bpc6发酵液，5000r/min离心5min收集上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤后，将无菌过滤液置于4℃备用。

2.1对峙培养法

测定bpc6发酵液、滤液对菌核菌的影响，打取直径为0.5cm的菌核菌菌饼，接种至pda培养基中心，基于距中心2cm处的4个点上打孔，直径0.8cm，分别加入100μl生防菌发酵液及滤液，以不接种供试菌株作对照，再于28℃继续培养，待对照组中菌核菌菌丝长满平板，测量抑菌带宽度及抑菌率(张斌，杨晓云，陈志谊.番茄枯萎病致病镰刀菌种类鉴定及优势种群的研究[j].植物病理学报，2016，46(4):561-565.)，相对抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100，试验重复3次。

测定bpc6发酵液、滤液对软腐病菌的影响，取软腐菌种子液100μl涂布于lb平板，基于距中心2cm处的4个点上打孔，直径0.8cm，分别加入100μl生防菌发酵液及滤液，再于28℃继续培养，72h后测量抑菌带宽度(张斌，杨晓云，陈志谊.番茄枯萎病致病镰刀菌种类鉴定及优势种群的研究[j].植物病理学报，2016，46(4):561-565.)，试验重复3次。

2.2对扣培养法

测定bpc6挥发性物质对菌核菌的影响，取直径为0.5cm的菌核菌菌饼，接种至pda培养基平板中心，于lb固体培养基上涂布100μlbpc6发酵液，将两个平板对扣并密封，以空白的lb与菌核菌平板对扣为对照，28℃恒温培养3d，利用十字交叉法测定菌核菌直径，计算抑菌率(周京龙等.棉花内生蜡状芽孢杆菌yupp-10对棉花黄萎病的防治作用及机制[j].中国农业科，2017，50(14):2717-2727)。试验重复3次。

测定bpc6挥发性物质对软腐病菌的影响，将5μl软腐病菌种子液接于一个lb培养基平板中心并晾干，在另一个lb培养基平板上涂布100μlbpc6发酵液，将两个平板对扣并密封，以空白的lb与软腐菌平板对扣培养作为对照，28℃恒温培养7d，利用十字交叉法测定软腐病菌直径，计算抑菌率(周京龙，冯自力，冯鸿杰，李云卿，袁媛，李志芳，魏锋，师勇强，赵丽红，孙正祥，朱荷琴，周燚.棉花内生蜡状芽孢杆菌yupp-10对棉花黄萎病的防治作用及机制[j].中国农业科学，2017，50(14):2717-2727.)，试验重复3次。

bpc6与菌核菌对峙培养3d后，结果如表3、图3a～c所示，对照菌核菌生长正常；生防菌处理(图3c)，bpc6发酵原液与滤液均具有抑菌效果，且抑菌率差异不显著，均达到了57％以上，说明滤液在抑菌作用中起主要作用。此外，挥发性气体(图3b)对菌核菌也有抑制作用，相对菌丝抑菌率是58.75％。

bpc6与软腐病菌对峙培养7d后，结果如表3、图3d～f所示，对照软腐菌生长正常；而在处理中，发酵原液、滤液对软腐病菌均产生抑菌带，且抑菌带宽度相差不显著；此外，软腐病菌菌落生长受到挥发性气体的抑制，菌落边缘光滑，菌落生长抑制率达到23.87％，表明生防菌挥发性代谢产物对软腐病菌的生长也具有一定的抑制作用(图3e)。

表3bpc6发酵液、滤液、挥发性气体与菌核菌、软腐菌的平板对峙

注：发酵原液和滤液的数据进行了显著性差异比较，相同的小写字母表示0.05水平上差异不显著。

2.3广谱抑菌实验

对bpc6采用上述方法测定bpc6发酵液、滤液对多种真菌和细菌致病菌的影响。植物病原真菌广谱性平板对峙试验结果如表4、图4所示，生防菌bpc6对灰葡萄孢菌、腐皮镰孢菌、尖孢镰刀菌、青霉菌、立枯丝核菌等病原真菌均表现出良好的抑菌效果，在每个抑菌平板上都形成了明显的抑菌带，带宽均大于0.20cm。通过测算，该菌株发酵原液对番茄灰霉病菌的抑制率高达68.59％，发酵滤液对青霉菌的抑制率最低，为25.39％，对其他病原菌的抑制率为37.18％～63.76％。植物病原细菌广谱性平板对峙试验结果如表5、图5所示，生防菌bpc6对西瓜嗜酸菌、丁香假单胞菌、水稻黄单胞菌、青枯雷尔氏菌和边缘假单胞菌均表现出良好的抑菌效果，在每个抑菌平板上发酵液和发酵滤液都形成了明显的抑菌带，带宽均大于0.25cm。该菌株发酵原液对峙西瓜嗜酸菌的抑菌带最大达0.75cm，发酵滤液对丁香假单胞菌抑菌带最低为0.26cm。测定结果说明该菌株既具有病原真菌广谱抑菌活性，又具有病原细菌广谱抑菌活性，具有生防开发利用潜力。

表4bpc6对植物病原真菌的广谱抑菌试验

注：每种菌的发酵原液和滤液的数据进行了显著性差异比较，不同的小写字母表示0.05水平上差异显著，反之，相同则表示不显著。

表5bpc6对植物病原细菌的广谱抑菌试验

注：每种菌的发酵原液和滤液的数据进行了显著性差异比较，不同的小写字母表示0.05水平上差异显著，反之，相同则表示不显著。

实施例五菌株bpc6的盆栽及大田生防试验

1、盆栽防效试验：

生菜种子(大橡生1号和罗生3号)催芽后，选取长势基本相同的生菜苗，每个营养钵(口径9cm)移栽1株，待长至6～8叶期时，将bpc6发酵液(od600＝5～6)稀释10～15倍至od600＝0.5～1.0，均匀喷施全株，设清水对照(ck)。两天后再次喷施bpc6或清水对照，晾干后，每株生菜选择大小相近且健康的三片叶片，接种活化3d的生菜菌核病菌，每片叶接种一个菌饼(直径为0.5cm)；或者接种软腐菌，即用10ml注射器在叶片基部刺出伤口，将1滴od600＝0.2的软腐菌菌悬液接种在伤口处。每个处理与ck各15盆，室温保湿培养，观测病斑扩展情况，2d后测量病斑直径。试验重复3次。计算病情指数(病情指数＝∑(各级病叶数×相对级数的代表值)/(调查总叶数×最高级数的代表值)×100)和防治效果(防治效果(％)＝(对照组病情指数－处理组病情指数)/对照组病情指数×100)。

菌核病病斑分级标准(r＝病斑长度)：

0级：叶片不发病；

1级：叶片刚发病，病斑长r<0.5cm；

2级：病斑长0.5cm<r≤2cm；

3级：病斑长2cm<r≤4cm；

4级：病斑长r>4cm。

软腐病病斑分级标准：

0级：接种位点无侵染病症；

1级：病斑刚开始形成，成水浸状；

3级：病斑长r≤1cm；

5级：病斑长1cm<r≤2cm；

7级：病斑长r>2cm。

9级：叶柄大部分或全部腐烂。

2、大田菌核病防效试验：

在北京房山区日光温室种植区种植生菜，于2017年进行春、秋两茬生菜大田生防试验。将bpc6发酵液(od600＝5～6)稀释10～15倍至od600＝0.5～1.0，均匀喷施全株，设清水对照(ck)。自生菜定植20d起，每隔15d喷施一次，共三次，待生菜收获期调查菌核病自然发病率情况，以发病率计算大田防效。

3、实验结果：

1)盆栽防治效果：喷施生防菌防治软腐和菌核病的盆栽结果如图6所示，bpc6处理的发病率和病情指数均较其ck显著降低(表6)。其中软腐病盆栽试验中，发病率降低了22.43％，病情指数防效达到了44.09％；菌核病盆栽试验中，发病率降低了30.42％，病情指数防效达到了53.58％。该结果说明bpc6对生菜菌核病和软腐病均具有明显的防治效果。

表6bpc6对生菜软腐病、菌核病的盆栽防病作用

注：不同的小写字母表示0.05水平上差异显著，反之，相同则表示不显著。

2)大田防治效果：从大田的小区试验结果可知(表7)，bpc6对生菜菌核病有较好的生防效果。经生防菌处理，在生菜成熟期，春秋两季生菜菌核病发病率均显著低于对照，其防效分别为76.09％和86.39％，说明生防菌bpc6对生菜菌核病具有较好的防效，且防效稳定。

表7bpc6对生菜菌核病的防病作用(大田)

注：不同的小写字母表示0.05水平上差异显著，不同的大写字母表示0.01水平上差异显著，反之，相同则表示不显著。

实施例六菌株bpc6的相关特性测定

1几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶测定

将5μlbpc6种子液分别接种在几丁质培养基、纤维素培养基和酪蛋白培养基平板上，每种培养基平板重复3次，28℃恒温培养3d。观察菌株在以上三种培养基上产生水解圈情况。

在3种检测培养基上，纤维素、酪蛋白培养基均出现了水解圈(图7)，而几丁质培养基上没有水解圈，说明生防菌bpc6能够产生蛋白酶、纤维素酶，具备分解蛋白质、纤维素的能力，而不能产生几丁质酶，不具备分解几丁质的能力。

2bpc6耐盐碱性分析

采用比浊法测定生防菌bpc6在盐碱环境下的生长规律。将lb液体培养基分装于6个50ml锥形瓶，每瓶10ml，加nacl配制成5个盐梯度1％、4％、7％、10％、13％，以1％nacl为对照。利用1mol/lnaoh调至4个ph梯度ph7.0、8.0、9.0、10.0，以ph7.0为对照。每个锥形瓶接入10μlbpc6种子液，于180r/min、28℃恒温振荡培养，首先每隔4h测量od600，12h后每隔12h测量一次。以测得的od600数值为纵坐标，培养时间(h)为横坐标，绘制bpc6耐盐碱生长曲线。

通过耐盐生长曲线(图8)发现，在盐浓度为1％和4％时，生长曲线相似，延滞时间最短为4h，说明bpc6属中度嗜盐菌(王国影，刘长莉，卢丽霞，杨敬杰，李春玲.生物合成聚羟基脂肪酸酯(phas)的研究进展[j].安徽农业科学，41(27):10960-10962.)。其它盐浓度延滞时间依次延长，最长为24h，说明菌株生长的延滞期随盐浓度的升高而逐渐增加。在72h后，各盐浓度下bpc6的生长陆续进入平稳期；在10％盐浓度下bpc6最早(84h时)进入衰亡期。此外，bpc6对10％盐环境有一定的抗性，可正常生长；而在13％盐环境下不能正常生长，菌落聚成团，od600值变化不大。

耐碱生长曲线显示(图9)，bpc6在不同碱性环境中，生长速率不同。ph7.0延滞时间最短，60h最先进入平稳期；但其它梯度下，菌株在180h后，陆续进入平稳期，说明该菌株在中性状态下更容易生长。ph8.0和ph9.0的碱性环境没有改变最终od600，而ph10.0的碱环境下菌株不能生长，这些结果说明bpc6菌株能适应一定的碱性环境。

3安全性评价

将10μlbpc6种子液接种到10mllb液体培养基中，180r/min振荡培养24h，5000r/min离心6min收集细菌，再用灭菌水配制成1×10⁸cfu/ml的菌悬液。选用白菜、洋葱、牛油果、辣椒和大葱用于安全性分析。在同等条件下，设无菌水为对照。接种24h后观察并记录发病情况。

将bpc6种子液在血琼脂平板培养基上划线，28℃恒温培养48h，观察菌落周围有无溶血环。

生防菌的血平板和处理植物试验结果如图10所示，血平板上菌落周围无透明溶血环出现，暗示bpc6对动物无害。bpc6处理白菜、洋葱、牛油果、辣椒和大葱均无发病现象，证明其对植物是安全的。

<110>北京农业生物技术研究中心

<120>一株广谱抗病的贝莱斯芽孢杆菌及其应用

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