SmbHLH92基因克隆引物、表达载体、调控丹酚酸生物合成的功能及应用的制作方法

本发明属于植物分子生物学及基因工程领域，具体涉及一种调控丹酚酸生物合成的smbhlh92转录因子的基因克隆和功能研究。

背景技术：

丹参(salviamiltiorrhizabunge)是唇形科鼠尾草属的多年生直立草本植物，其根和根茎入药，《神农本草经》将其列为上品；丹参性微寒，味微苦，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功效。丹参主要活性成分包括脂溶性丹参酮类化合物和水溶性丹酚酸类化合物。丹酚酸类化合物主要包括迷迭香酸(rosmarinicacid，ra)、丹酚酸b(salvianolicacidb，salb)、丹酚酸a(salvianolicacida，sala)和紫草酸(lithospermicacid，la)等，它们在抗氧化、清除自由基等方面发挥重要作用，可以有效治疗心脑血管疾病、肝纤维化以及某些癌症。目前，丹酚酸类化合物的生物合成途径解析已较为深入，但关于调控这些化合物生物合成的分子机制研究却鲜有报道。

bhlh转录因子是植物中最大的转录因子基因家族之一，其蛋白结构域能与目的基因启动子区的顺式作用元件这一特定序列进行专一性结合，从而启动基因转录。bhlh转录因子在调控植物的生长发育、次生代谢、逆境响应和信号转导等方面发挥重要作用。目前已验证到bhlh转录因子在拟南芥、烟草和红豆杉等植物中具有调控花青素、生物碱和萜类化合物生物合成的功能；而bhlh转录因子调控丹参中丹酚酸类化合物的生物合成报道较少。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种调控丹酚酸生物合成的bhlh转录因子基因及其编码的蛋白质。

本发明的另一个目的在于验证bhlh转录因子家族成员的功能。

本发明提供的smbhlh92基因，其核苷酸序列为seqidno.1所示。

本发明提供的smbhlh92基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明设计出了扩增smbhlh92基因特异性片段的引物，其碱基序列如seqidno.3和seqidno.4所示。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：基于丹参全基因组及不同丹参器官/组织转录组差异表达分析筛选出可能调控丹参活性成分合成的bhlh基因家族成员smbhlh92编码基因。

构建重组质粒pcambia1302-gfp-smbhlh92，转化根癌农杆菌gv3101，瞬时侵染烟草叶片，荧光共聚焦显微镜观察gfp荧光，发现smbhlh92定位于细胞核中。

构建一种含有smbhlh92基因特异性片段的正向和反向序列的植物rnai双元表达载体。

本发明通过发根农杆菌(accc10060)侵染丹参叶片，获得smbhlh92-rnai阳性毛状根株系。

本发明采用uplc技术检测到smbhlh92-rnai转基因毛状根中丹酚酸类化合物的含量显著升高。

本发明采用实时荧光定量pcr技术检测丹酚酸合成相关的关键酶基因的表达量在smbhlh92-rnai阳性株系中显著升高。

本发明提供的smbhlh92具有负调控丹参活性成分——丹酚酸生物合成的功能，为解析调控丹酚酸生物合成的分子机制奠定基础。

附图说明

图1所示为亚细胞定位实验中smbhlh92定位于细胞核中。

图2所示为smbhlh92在发根农杆菌accc10060介导的smbhlh92-rnai遗传转化获得的毛状根中基因表达量与对照株系相比显著降低。

图3所示为丹参smbhlh92-rnai转基因毛状根在液体培养基中经摇床培养5个月后的形态。

图4所示为uplc检测分析smbhlh92-rnai转基因毛状根与对照株系(pki)中丹酚酸类化合物的含量。

图5所示为四种丹酚酸类化合物的含量在smbhlh92-rnai转基因毛状根中均显著提高。

图6所示为丹酚酸合成途径关键酶基因的表达量在smbhlh92-rnai转基因毛状根中均显著提高。

具体实施方式

以下结合实例详细说明本发明。实施是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。

实施例1丹参smbhlh92基因的克隆

根据smbhlh92序列的开放阅读框设计基因全长扩增引物，以丹参的cdna为模板，pcr扩增得到smbhlh92基因的核苷酸序列如seqidno.1，基因全长为666bp。将核苷酸序列翻译后推导出smbhlh92的氨基酸序列，包含221个氨基酸残基，如seqidno.2。

实施例2丹参smbhlh92亚细胞定位实验

1)构建重组质粒pcambia1302-gfp-smbhlh92。设计带酶切位点的全长扩增引物(r引物去掉终止密码子)，f：5′-catgccatggatgcttcctatttcgagcgatg-3′r：5′-actagtgctgtcgtcagctgccg-3′。

2)重组质粒pcambia1302-gfp-smbhlh92转化根癌农杆菌gv3101。将重组质粒pcambia1302-gfp-smbhlh92及空载体pcambia1302-gfp转化根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)gv3101的感受态细胞，步骤如下：取10μl构建好的重组质粒pcambia1302-gfp-smbhlh92及空载体pcambia1302-gfp质粒，加入到100μlgv3101农杆菌感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰浴30min；液氮中速冻3min，37℃水浴3min后转入冰上放置3min；加入1ml不含抗生素的yeb液体培养基，28℃150rpm震荡培养4-6h，4000rpm离心4min；保留100-200μl上清液，用枪头轻轻重悬菌体，均匀涂布于含50mg/l利福平(rif)+15mg/l庆大霉素(gm)+50mg/l卡那霉素(kan)的yeb平板上，28℃倒置培养48h至出现单菌落。

3)根癌农杆菌瞬时侵染烟草叶片。挑选鉴定正确的含重组质粒pcambia1302-gfp-smbhlh92的gv3101阳性克隆以及只含空载体pcambia1302-gfp质粒的gv3101克隆及p19的单克隆(p19的作用为防止基因沉默，促进基因表达)，分别接种于含有50mg/lrif+15mg/lgm+50mg/lkan的yeb液体培养基中，28℃，180rpm震荡培养24h；取500μl菌液加入到50ml含50mg/lrif+15mg/lgm+50mg/lkan的yeb液体培养基中，28℃过夜培养至od600至0.4-0.6，冰上放置30min，8000g离心10min，集菌，用1ml烟草注射液重悬菌体。烟草注射液配方为：1ml1mmgcl2，1ml1mmes，100μl0.2m乙酰丁香酮和98mlddh2o。按smbhlh92∶p19体积比＝1∶0.6的比例混合后，28℃避光放置2-4h。挑选长势较好的烟草叶片(一般选取生长3-4周烟草叶片)，用1ml注射器于烟草叶片下表皮注射菌液与烟草注射液的混合液。

4)激光共聚焦显微镜观察叶片荧光。注射完毕的烟草植株于培养室继续培养2-4天后取出，剪下注射器针眼四周约0.5cm²大小的叶片，置于dapi染液中，室温染色5-10min，吸除dapi染液，用pbs洗涤2-3次，每次3-5分钟，利用共聚焦显微镜观察叶片荧光，如图1所示。

实施例3丹参smbhlh92-rnai转基因毛状根阳性株系的获得和扩大培养

1)rnai引物设计及pcr扩增。挑选smbhlh92基因中一段长为123bp的特异性片段作为rnai目标区域(位于基因的529-651bp)，对目标区域设计两端引物，根据gateway操作原理，在引物5′端添加attb序列，其中f引物添加attb1序列：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct，r引物添加attb2序列：ggggaccactttgtacaagaaagctgggt。smbhlh92rnai的引物序列如下：

smbhlh92rnaif：

5′-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctaccaccacagcaccctcaac-3′

smbhlh92rnair：

5′-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctagctgtcgtcagctgccg-3′

2)构建smbhlh92-rnai载体。bp反应：在pcr反应管中加入25ngattb-pcr回收产物，75ngpdonr221入门载体，1μlbpclonaseiienzyme，补充ddh2o至反应体系为5μl；轻轻混匀后，于25℃孵育1小时以上；再加入0.5μl的蛋白激酶k，混匀后37℃孵育10min；转入dh5α感受态细胞，用含50mg/lkan抗性的lb固体培养基筛选培养，对获得的克隆进行pcr检测。lr反应：在pcr反应管中加入75ngpdonr221-rnai回收产物，75ngpk7gwiwg2d(ii)受体载体，1μllrclonaseiienzyme，补充ddh2o至反应体系为5μl；轻轻混匀后于25℃孵育1小时以上；再加入0.5μl的蛋白激酶k，混匀后37℃孵育10min；转入dh5α感受态细胞，用含50mg/lspec(壮观霉素)抗性的lb固体培养基筛选培养，经pcr检测后将阳性克隆进行序列测定；测序正确的克隆提取重组质粒pk7gwiwg2d(ii)-smbhlh92，转入发根农杆菌accc10060中。

3)发根农杆菌accc10060侵染丹参叶片。用转入pk7gwiwg2d(ii)载体的发根农杆菌作为对照菌株，同时侵染丹参叶片。选取生长旺盛的丹参组培苗，取其幼嫩叶片，剪成0.5cm²的叶盘，置于ms培养基平板上25℃预培养2-3天；用50mg/lspec+50mg/lrif的液体yeb培养基分别培养含重组质粒(pk7gwiwg2d(ii)-smbhlh92)和空载体(pk7gwiwg2d(ii))的发根农杆菌accc10060菌株，28℃摇培至od600达到0.4-0.6；将菌液离心，富集菌体后用等体积的ms液体培养基重悬菌体(ms-plasmid)，将预培养的叶盘置于ms-plasmid中，浸泡10min后用无菌滤纸吸去多余菌液，置于ms平板上，25℃黑暗条件下共培养48-72h；将共培养的叶盘分别用无菌水和含500mg/lcar(羧苄青霉素)的无菌水浸泡10min，用滤纸吸去多余水分后置于含500mg/lcar+50mg/lkan的ms平板上，25℃黑暗条件下筛选培养，每10天更换一次培养基。选择长势良好的毛状根，待其长至2.0-3.0cm后切下，置于含200mg/lcar+15mg/lkan+0.1mg/liaa的6，7-v平板上刺激一周后转入不含iaa的平板上，长出较多侧根后，利用荧光显微镜检测gfp的表达情况判断转基因的毛状根是否为阳性株系。将阳性株系移至6，7-v液体培养基中，120rpm，25℃黑暗条件下扩大培养。

4)毛状根在液体培养基中摇床培养1个月后，提取其rna，利用实时荧光定量pcr方法检测smbhlh92-rnai转基因阳性株系(92i-4、92i-5、92i-10)中的该基因的表达受抑制程度，如图2所示。与对照株系(pki)相比(设定基因的相对表达量为100％)，株系92i-4、92i-5、92i-10中基因的相对表达量分别为30％、55％、54％。

实施例4转基因毛状根中丹酚酸类化合物含量检测

本发明采用uplc技术对丹参转基因毛状根进行化学成分检测，步骤如下：

1)样品处理：毛状根在摇床培养5个月后取出拍照，如图3所示。将毛状根置于烘箱中40℃烘干后称重，使用球磨仪打粉，每100mg毛状根用2ml75％甲醇提取，提取物超声处理30min，8000g离心10min，用0.22μm过滤器将上清过滤至棕色液相小瓶中，待进样；

2)uplc条件：采用acquityuplcbehc18column(2.1×100mm，1.7μm；waters)色谱柱；检测波长为280nm；柱温25℃；流速0.3ml/min；进样量1μl；流动相：乙腈(a)-0.5％甲酸溶液(b)，采用梯度洗脱方式：5-25％a(0-10min)，25-40％a(10-20min)，40-90％a(20-25min)，90％a(25-30min)；不同转基因株系及对照株系均设三个生物学重复样品，丹酚酸类化合物的含量测定结果如图4、5所示。

实施例5转基因毛状根中丹酚酸生物合成途径关键酶基因的表达量检测

设计丹酚酸生物合成途径中的关键酶基因pal1、c4h1、4cl2、tat1、hppr1、ras1和cyp98a14的特异性片段扩增引物，利用实时荧光定量pcr方法，检测这些基因在转基因毛状根株系和对照株系中的相对表达量，以丹参看家基因actin作为内参基因，采用2^-δδct方法计算基因的相对表达量。丹酚酸生物合成途径中的关键酶基因的引物如下：

本发明首次克隆到丹参中smbhlh92基因，验证发现smbhlh92具有负调控丹酚酸类化合物生物合成的功能，为开展丹酚酸合成生物学研究及优良种质培育研究奠定基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于技术领域普通人员来说在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些也应视为在本发明的保护范围。