一种甘蓝型油菜雄性不育基因、蛋白、载体、工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及生物育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜雄性不育基因bnms5^f、蛋白、载体、工程菌及其应用。

背景技术：

目前，我国油菜杂种优势利用的雄性不育系统主要是细胞质雄性不育系统和细胞核雄性不育系统，但是细胞质雄性不育系统在油菜生产应用上存在一些不尽人意的地方。而细胞核雄性不育系统不育性稳定彻底，不存在不育胞质负效应和胞质单一化的潜在风险，一般不受恢保关系的限制，很容易获得强优势组合，在杂种优势利用中具有广阔的前景。近年来，我国在油菜雄性不育研究领域不断取得突破，大量油菜育性相关分子标记的开发、育性相关基因的克隆与功能研究，不仅推动了雄性不育在油菜杂种优势利用中的应用，也为油菜光、温敏雄性不育的研究与应用指明了方向。

yi等在油菜中首次利用图位克隆成功克隆了油菜隐性核不育s45ab的恢复基因bnms1和bnms2(yib,zengfq,leisl,chenyn,yaoxq,zhuy,wenj,shenjx,macz,tujx,futd.twoduplicatecyp704b1-homologousgenesbnms1andbnms2arerequiredforpollenexineformationandtapetaldevelopmentinbrassicanapus.plantj.2010,6:925-938)。油菜隐性上位互作型雄性不育系9012a的不育基因bnms3与拟南芥基因attic40同源，bnms3基因主要参与油菜雄蕊绒毡层发育(dunxl,zhouzf,xiasq,wenj,yib,shenjx,macz,tujx,futd.bnac.tic40,aplastidinnermembranetransloconoriginatingfrombrassicaoleracea,isessentialfortapetalfunctionandmicrosporedevelopmentinbrassicanapus.plantj.2011,68:532-545；lij,hongdf,hejp,mal,wanll,liupw,yanggs.map-basedcloningofarecessivegenicmalesterilitylocusinbrassicanapusl.anddevelopmentofitsfunctionalmarker.theorapplgenet.2012,125(2):223-234；dunxl,shenwh,zhouzf,xiasq,wenj,yib,shenjx,macz,tujx,futd,lagercrantzu.neofunctionalizationofduplicatedtic40genescausedagain-of-functionvariationrelatedtomalefertilityinbrassicaoleracealineages.plantphysiol.2014,166:1403-1419)。进一步研究认为，9012a的育性只受2个位点(bnms3和bnrf)互作控制，bnms4、bnrf和bnrf之间是复等位基因(董发明,洪登峰,刘平武,谢彦周,何庆彪,杨光圣.甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育系9012ab遗传模式新释.华中农业大学学报,2010,29(3):262-267；俎峰,夏胜前,顿小玲,周正富,曾芳琴,易斌,文静,马朝芝,沈金雄,涂金星,傅廷栋.基于分子标记的油菜隐性核不育7-7365ab遗传模式探究.中国农业科学,2010,43(15):3067-3075)。后期在成功克隆bnrf基因基础上，解析了bnrf基因的功能与作用机理，明确了bnms4、bnrf和bnrf之间的关系(dengzh,lix,wangzz,jiangyf,wanll,dongfm,chenfx,hongdf,yanggs.mapbasedcloningrevealsthecomplexorganizationofthebnrflocusandleadstotheidentificationofbnrfb,amalesterilitygene,inbrassicanapus.theorapplgenet.2016,129(1):53-64；xiasq,wangzx,zhanghy,hukn,zhangzq,qinmm,dunxl,yib,wenj,macz,shenjx,futd,tujx.alteredtranscriptionandneofunctionalizationofduplicatedgenesrescuetheharmfuleffectsofachimericgeneinbrassicanapus.plantcell.2016,28(9):2060-2078)。油菜显性细胞核雄性不育系宜3a(或由其转育的不育系)的育性受到同一位点的三个复等位基因控制，bnms5^a(恢复基因)，bnms5^b(不育基因)和bnms5^c(正常可育或临保系基因)，且这3个等位基因之间的显隐性关系为bnms5^a>bnms5^b>bnms5^c(卢卫.甘蓝型油菜细胞核雄性不育恢复基因bnms5a的克隆.[博士学位论文].武汉:华中农业大学,2013)。xin等成功克隆了宜3a的不育基因bnms5^b和恢复基因bnms5^a，不育基因bnms5^b为bnms5^a在内含子区内转座子插入造成的功能缺失突变，bnms5^a基因能恢复不育系(bnms5^b)的育性(xinq,sheny,lix,luw,wangx,hanx,dongfm,wanll,yanggs,hongdf,chengzk.ms5mediatesearlymeioticprogressionanditsnaturalvariantsmayhaveapplicationsforhybridproductioninbrassicanapus.plantcell.2016,28:1263-1278)。同时，zeng等成功克隆了温敏细胞核显性不育系te5a的不育基因bnms5^d(zengxh,yanxh,yuanr,likq,wuyh,liuf,luojl,lij,wug.identificationandanalysisofms5d:agenethataffectsdouble-strandbreak(dsb)repairduringmeiosisiinbrassicanapusmicrosporocytes.front.plantsci.2016,7:e1005396)。但是，不论是bnms5^b还是bnms5^d导致的油菜雄性不育均受温度影响，在低温条件下有花粉产生。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜雄性不育基因bnms5^f、蛋白、载体、工程菌及其应用。本发明所述基因bnms5^f可作为一个油菜雄配子发育调控的功能基因应用于油菜基因工程雄性不育系统的创制，获得的转基因油菜育性不受温度影响，不育彻底，无微粉，但其营养生长完全正常。

本发明提供了一种甘蓝型油菜雄性不育基因bnms5^f，所述基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述基因bnms5^f编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明还提供了含上述技术方案所述基因的表达盒、表达载体或克隆载体。

本发明还提供了含上述技术方案所述基因或上述技术方案所述表达盒、表达载体或克隆载体的工程菌或转基因细胞系。

本发明还提供了上述技术方案所述基因在制备转基因植物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述基因在油菜及其它作物品种改良中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述基因在油菜基因工程雄性不育系统创制中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述基因在调控油菜雄配子发育中的应用。

本发明提供了一种甘蓝型油菜雄性不育基因bnms5^f。本发明所述基因bnms5^f可作为一个油菜雄配子发育调控的功能基因应用于油菜基因工程雄性不育系统的创制，获得的转基因油菜育性不受温度影响，不育彻底，无微粉，但其营养生长完全正常，可用于油菜杂种优势利用过程中的杂交种制种，也可用于油菜轮回选择。

附图说明

图1为本发明提供的甘蓝型油菜e2b和e2a结实情况；

图2是甘蓝型油菜功能互补测验表达载体pc2300-bnms5^f的构建图；

图3是具有tk5遗传背景的t0代遗传转化甘蓝型油菜植株开花后育性表型与tk5表型的比较图。

具体实施方式

本发明提供了一种甘蓝型油菜雄性不育基因bnms5^f，所述基因的核苷酸序列如seqidno.1所示(atgagtaattctgcgcctggagggtcgatgaagaggaaggggggtgggcgtaagcgtaatccagatgagctaattgttgttgattccgagtatcgtgcgccaggacgttcatatcggcgcttgaaaaagaagcgagaggctcgccgtaaggctcagagggaggagatttatcgaagagaagaagagactattcgtaaggccgaggaggttttttggcgtaaagtggatgaaacagatggcttcgatatcgagatcgagggtgctccttgttattttggtggtatgagtgtttataaaggtggagtagattgtccccttgtagtgaagctttatgcaacggtgggacttcatcgttacaatatgctagaggggaccaacttgtatcttcacaaaatagagaaatacgttgtagtttgcaccctcatgcctgtctcgtataacattactttgattgctgaggatccagctacctcctcctttgttgttttcgagactaatgttgaccaaagaagtttaggccagattgatttcacttgttatatctcaagacctaaagggatcaagagtgagatttatccgaaccagttcttcgatgccaaggacttgcctgacaagtggccttcaaaggaggcttttgctgatcaaagtcgatttttgtacaagatgcagaaatcagattgggaagaacatgactggattcgcttgtatatggaaatttcattctttaacagagataggtgtctggatcacaacatgtctgatttaaagattttggacgtagtggtagagactgaggaaaatgtgccacgtgagactgtactcaagagtcttaggaatgtccttgtctacataagatatgatcaagacttgggagcggatggtgtttgcaaacacatagccattgttcgaagaactgtcgagccgacaactcactgcgtttgtctcttgggcgagtctcagcttgtgcccgactctgagtaa)。

本发明通过甲基磺酸乙酯(ems)诱变获得一个bnms5f功能缺失突变体(遗传稳定的雄性不育突变体(甘蓝型油菜雄性不育突变体e2a))，该突变体在大田种植环境中表现出植株营养生长正常，植株雄性不育，花粉100％败育，雌配子发育不正常。减数分裂压片结果表明，由于bnms5^f功能缺失严重影响了减数分裂过程中染色体的行为，最终导致小孢子发育缺陷。基因bnms5^f可作为一个油菜雄配子发育调控的功能基因应用于油菜基因工程雄性不育系统的创制。

本发明所述甘蓝型油菜雄性不育基因bnms5^f的cdna序列如seqidno.1所示，本发明所述基因及其cdna序列可通过人工合成的方式得到。

本发明还提供了上述技术方案所述基因bnms5^f编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示(msnsapggsmkrkgggrkrnpdelivvdseyrapgrsyrrlkkkrearrkaqreeiyrreeetirkaeevfwrkvdetdgfdieiegapcyfggmsvykggvdcplvvklyatvglhrynmlegtnlylhkiekyvvvctlmpvsynitliaedpatssfvvfetnvdqrslgqidftcyisrpkgikseiypnqffdakdlpdkwpskeafadqsrflykmqksdweehdwirlymeisffnrdrcldhnmsdlkildvvveteenvpretvlkslrnvlvyirydqdlgadgvckhiaivrrtveptthcvcllgesqlvpdse)。

本发明还提供了含上述技术方案所述基因的表达盒、表达载体或克隆载体。本发明所述表达载体优选通过使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射或电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(weissbach，1998，methodforplantmolecularbiologyviii，academypress，newyork，第411-463页；geiserson和corey，1998，plantmolecularbiology，2ndedition)。

本发明还提供了含上述技术方案所述基因或上述技术方案所述表达盒、表达载体或克隆载体的工程菌或转基因细胞系。

本发明还提供了上述技术方案所述基因在制备转基因植物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述基因在油菜及其它作物品种改良中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述基因在油菜基因工程雄性不育系统创制中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述基因在调控油菜雄配子发育中的应用。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种甘蓝型油菜雄性不育基因bnms5^f、蛋白、载体、工程菌及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

以下结合附图和实施例详细说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆：实验室指南》(newyork:coldspringharborlaboratory，1989)中所述的条件，或者按照生产厂商提供的操作手册中建议的条件。

实施例1

甘蓝型油菜细胞核显性不育材料遗传规律分析

1、实验材料

不育株称为e2a，可育株称为e2b。对在甘蓝型油菜自交系te5进行ems诱变，获得1株不育单株e2a(不育株称为e2a，可育株称为e2b)，将不育单株与中双11号杂交，并用中双11号作为轮回亲本回交获得近等基因系。与bnms5^b和bnms5^d基因导致的油菜雄性不育受温度影响不同，在油菜花期经过不同温度处理后，不育单株e2a其育性不受温度影响，不育彻底，无微粉，但其营养生长完全正常。不育株e2a在人工辅助授粉或自然授粉条件下其结实较差，基本不结实(图1，甘蓝型油菜e2b和e2a结实情况；其中a为e2b角果，b为e2a角果)，说明其雌配子发育也受影响导致雌性败育。

2、细胞核显性不育材料遗传规律

采用经典遗传学方法，对不育材料e2a与育性正常甘蓝型油菜中双11号的杂交f1和回交分离群体进行分析。测验结果表明(表1)：不育材料e2a的不育性状受一对显性细胞核基因控制。

表1显性细胞核雄性不育系e2a遗传分析

实施例2

甘蓝型油菜显性细胞核不育基因bnms5^f与bnms5^d的等位性分析

zeng等(xinhuazeng,wenpinli,yuhuawu,fangliu,junlingluo,yinglongcao,lizhu,yunjingli,junli,qingboyou,gangwu.finemappingofadominantthermo-sensitivegenicmalesterilitygene(bntsms)inrapeseed(brassicanapus)withaflp-andbrassicarapa-derivedpcrmarkers.theorapplgenet.2014,127:1733–1740)在甘蓝型油菜中发现温敏细胞核雄性不育系te5a，并利用图位克隆技术克隆了不育基因bnms5^d。为验证e2a不育基因是否与bnms5^d基因等位，本发明利用纯合的e2a不育系与低温条件下可育的纯合te5a(基因型为bnms5^dbnms5^d)杂交，获得f1。将f1种植于温室，在花期保持稳定25℃，开花后观察f1植株育性，f1均表现为完全不育。利用f1不育株为母本，甘蓝型油菜保持系中双11号作父本杂交，收获bc1种子。将bc1种植于温室，在花期保持稳定25℃，开花后调查200株bc1群体育性，结果表明bc1群体所有单株均表现为不育，无可育株。结果表明，e2a不育基因与温敏细胞核雄性不育系te5a中不育基因bnms5^d等位或紧密连锁。

甘蓝型油菜显性细胞核不育基因bnms5^f的分离与克隆

利用生物信息学分析，根据甘蓝型油菜bnms5^d基因组序列信息，设计引物sa-1l(正向引物)：ctattaataaattaatgactcagct(seqidno.3)；和sa-1r(反向引物)：ccaagaagagaattgattccaca(seqidno.4)。提取甘蓝型油菜e2a不育系基因组dna，以提取的基因组dna为模板，利用zt-1l和zt-1r引物进行pcr扩增，将扩增产物回收、克隆测序，结果显示克隆到的目标基因编码框序列和基因组序列均与bnms5^d基因序列高度同源。

实施例3

甘蓝型油菜显性细胞核不育基因bnms5^f的功能验证

1、bnms5^f油菜转基因实验

本实施例采用植物表达载体pcambia2300作为甘蓝型油菜转基因载体。该载体编码一个细菌复制起点(ori)、卡那霉素抗性基因(kan’)、camv35s启动子、nos基因的终止子以及限制性内切酶多克隆位点。通过分析携带候选基因的bac克隆序列的酶切位点和候选基因的关系，利用引物zt-1l、zt-1r和高保真pcr技术(phusiontmhigh-fidelitydnapolymerse，来自newenglandbiolads公司)扩增获得一个3.951kb的片段，

zt-1l(正向引物)：ccggaattcctattaataaattaatgactcagct(seqidno.5)；

zt-1r(反向引物)：caactgcagccaagaagagaattgattccaca(seqidno.6)。

该片段包含ecoli和psti酶切位点。片段包括基因上游非翻译区1,417bp的序列、基因区间1,394bp的序列和下游非翻译区的1,124bp的序列。扩增片段用胶回收试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)回收，用ecoli和psti双酶切后回收3.94kb的片段，连接到经ecoli和psti双酶切的表达载体pcambia2300上(图2，甘蓝型油菜功能互补测验表达载体pc2300-bnms5^f的构建图)，连接产物转化大肠杆菌菌株dh5α，在含有50ug/ml卡那霉素的lb培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，并用通过测序检测确定核苷酸序列完全正确，成功构建了转化植株的载体pc2300-bnms5^f(图2)。正确的重组质粒通过冻融法导入农杆菌菌株gv1301。油菜遗传转化采用常规的农杆菌转化法转化油菜te5，种子灭菌用70％浓度的酒精浸泡种子15min，0.1％升汞消毒15min，20％～30％的次氯酸钠消毒15min，无菌水清洗3次，每次间隔5min。将灭菌的种子播于medium0培养基(配方见表2)，于25℃暗培养7d。在超净工作台内将获得的试管幼苗下胚轴切成0.5～0.8cm的小段，接种至含有农杆菌(悬浮过夜至对数生长期)的medium1上(配方见表2)浸染25～30min后，吸干液体，于25℃黑暗条件下共培养3d。将外植体转到medium2上的愈伤组织诱导培养基(配方见表2)上，于25℃光照培养15～18d。在将外植体转入medium3上分化培养基培养，每15～18d继代1次，直至分化出幼苗。当幼苗长至2～3cm高时，将幼苗转入medium4生根培养基上培养。转化植株生根后，假植于混有腐质土的细土纸杯中，保持70％相对湿度，一个月后移入大田。

提取阳性植株提取叶片总dna，用引物npt-f(5’-actgggcacaacagacaatcg-3’，seqidno.7)和npt-r(5’-gcatcagccatgatggatacttt-3’，seqidno.8)通过pcr进一步鉴定转化植株。用转基因t0代观察育性的表现，验证导入的候选基因是否具有雄性不育功能。结果显示在20株转基因t0代植株中，有5株表现为花丝变短，花药干瘪退化，败育(见图3，具有te5遗传背景的t0代遗传转化甘蓝型油菜植株开花后育性表型与te5表型的比较图；te5遗传转化t0代植株携带显性基因bnms5^f的候选基因，表现为花丝退化，育性败育，ki染色无正常花粉；其中a、b分别为转基因雄性不育油菜和正常可育油菜花的形态；c为正常油菜花粉碘化钾染色；d为转基因雄性不育油菜花粉碘化钾染色)。

表2在遗传转化步骤中所用的各种培养基的配方

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>一种甘蓝型油菜雄性不育基因、蛋白、载体、工程菌及其应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>981

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgagtaattctgcgcctggagggtcgatgaagaggaaggggggtgggcgtaagcgtaat60

ccagatgagctaattgttgttgattccgagtatcgtgcgccaggacgttcatatcggcgc120

ttgaaaaagaagcgagaggctcgccgtaaggctcagagggaggagatttatcgaagagaa180

gaagagactattcgtaaggccgaggaggttttttggcgtaaagtggatgaaacagatggc240

ttcgatatcgagatcgagggtgctccttgttattttggtggtatgagtgtttataaaggt300

ggagtagattgtccccttgtagtgaagctttatgcaacggtgggacttcatcgttacaat360

atgctagaggggaccaacttgtatcttcacaaaatagagaaatacgttgtagtttgcacc420

ctcatgcctgtctcgtataacattactttgattgctgaggatccagctacctcctccttt480

gttgttttcgagactaatgttgaccaaagaagtttaggccagattgatttcacttgttat540

atctcaagacctaaagggatcaagagtgagatttatccgaaccagttcttcgatgccaag600

gacttgcctgacaagtggccttcaaaggaggcttttgctgatcaaagtcgatttttgtac660

aagatgcagaaatcagattgggaagaacatgactggattcgcttgtatatggaaatttca720

ttctttaacagagataggtgtctggatcacaacatgtctgatttaaagattttggacgta780

gtggtagagactgaggaaaatgtgccacgtgagactgtactcaagagtcttaggaatgtc840

cttgtctacataagatatgatcaagacttgggagcggatggtgtttgcaaacacatagcc900

attgttcgaagaactgtcgagccgacaactcactgcgtttgtctcttgggcgagtctcag960

cttgtgcccgactctgagtaa981

<210>2

<211>326

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metserasnseralaproglyglysermetlysarglysglyglygly

151015

arglysargasnproaspgluleuilevalvalaspserglutyrarg

202530

alaproglyargsertyrargargleulyslyslysargglualaarg

354045

arglysalaglnargglugluiletyrargarggluglugluthrile

505560

arglysalaglugluvalphetrparglysvalaspgluthraspgly

65707580

pheaspilegluilegluglyalaprocystyrpheglyglymetser

859095

valtyrlysglyglyvalaspcysproleuvalvallysleutyrala

100105110

thrvalglyleuhisargtyrasnmetleugluglythrasnleutyr

115120125

leuhislysileglulystyrvalvalvalcysthrleumetproval

130135140

sertyrasnilethrleuilealagluaspproalathrserserphe

145150155160

valvalphegluthrasnvalaspglnargserleuglyglnileasp

165170175

phethrcystyrileserargprolysglyilelyssergluiletyr

180185190

proasnglnphepheaspalalysaspleuproasplystrpproser

195200205

lysglualaphealaaspglnserargpheleutyrlysmetglnlys

210215220

serasptrpglugluhisasptrpileargleutyrmetgluileser

225230235240

phepheasnargaspargcysleuasphisasnmetseraspleulys

245250255

ileleuaspvalvalvalgluthrglugluasnvalproarggluthr

260265270

valleulysserleuargasnvalleuvaltyrileargtyraspgln

275280285

aspleuglyalaaspglyvalcyslyshisilealailevalargarg

290295300

thrvalgluprothrthrhiscysvalcysleuleuglyglusergln

305310315320

leuvalproaspserglu

325

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ctattaataaattaatgactcagct25

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ccaagaagagaattgattccaca23

<210>5

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ccggaattcctattaataaattaatgactcagct34

<210>6

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

caactgcagccaagaagagaattgattccaca32

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

actgggcacaacagacaatcg21

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gcatcagccatgatggatacttt23