调控甘蓝型油菜菌核病抗性的BnTLP1基因及其应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及调控甘蓝型油菜菌核病抗性的bntlp1基因及其应用。

背景技术：

油菜是我国种植面积最大的油料作物，提供了我国近50％的民用食用油。油菜菌核病是由子囊菌亚门盘菌纲柔膜菌目核盘菌科核盘菌属的核盘菌(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)所引起的一种真菌性病害，也是我国油菜生产的第一大病害(bolandgj,hallr.indexofplanthostsofsclerotiniasclerotiorum,1994,canadianjournalofplantpathology,16(2):93-108)。如何有效防控菌核病发生是当前油菜产业亟需解决的问题，目前油菜菌核病的防治措施主要是化学防治，但是化学防治不仅成本高，而且易造成二次污染，而物理防治与生物防治也各有局限。综合评估目前对菌核病防治的措施，培育抗病品种是最为经济有效的途径。但由于菌核病的数量遗传特性、尚无完全免疫品种且未鉴定到主效的抗病基因，这些都极大地限制了菌核病抗病育种进程。

病程相关蛋白(pathogenesis-relatedprotein,pr)是一类广泛存在于植物、动物以及真菌中的重要防御蛋白，共包括17个亚家族。pr5作为病程相关蛋白第5家族，主要包括类甜蛋白、渗透蛋白和zeamatin。类甜蛋白(thaumatin-likeproteins,tlps)因其氨基酸序列与非洲植物西非竹竽(thaumatococcusdanielli)甜蛋白(thaumatin)高度相似而得名，但tlp蛋白无甜味且具有抗真菌的活性(vanloonlcetal,significanceofinducibledefense-relatedproteinsininfectedplants,2006,annurevphytopathol,44(1):135-62)。tlp蛋白分为l(large)型和s(small)型，它们的区别在于蛋白的大小，l型蛋白分子大小为21-26kd，s型约16kd。l型有16个保守的半胱氨酸残基，比s型多6个，但它们都能被病原菌诱导表达抗真菌活性(reimmanncetal,cdnacloningandsequenceanalysisofapathogen-inducedthaumatin-likeproteinfromrice(oryzasativa),1993,plantphysiology,101(3):1113-1114)。典型的tlp蛋白由16个半胱氨酸形成稳定的二硫结构，可以保证蛋白的正确折叠，具有抵抗热变性、酸、碱和蛋白酶降解作用(smoleuetal,mald2,thethaumatin-likeallergenfromapple,ishighlyresistanttogastrointestinaldigestionandthermalprocessing,2008,internationalarchivesofallergyandimmunology,147(4):289-298)。

植物tlp基因以基因家族形式存在，水稻、模式植物拟南芥、杨树基因组中分别有31个、26个、55个基因。就目前的研究，其生物学功能主要集中在抗真菌性、β-1,3-葡聚糖酶活性、抗冻活性、酶抑制剂活性、植物过敏原活性等。datta等人通过组成型表达tlps基因的水稻对水稻纹枯病致病菌rhizictoniasolani和叶鞘腐败病菌sarocladiumoryzae有抗性(dattaketal,over-expressionoftheclonedricethaumatin-likeprotein(pr-5)geneintransgenicriceplantsenhancesenvironmentalfriendlyresistancetorhizoctoniasolanicausingsheathblightdisease,1999,theoretical&appliedgenetics,98(6-7):1138-1145)。kuwabara等克隆冬小麦tatlps基因，其表达的蛋白在低温环境抑制小麦雪霉叶枯病菌microdochiumnivale的生长，增强冬小麦的雪霉病抗性(kuwabaracetal,abscisicacid-andcold-inducedthaumatin-likeproteininwinterwheathasanantifungalactivityagainstsnowmould,microdochiumnivale,2002,physiologiaplantarum,115(1):101-110)。

由核盘菌引起的真菌病害是我国油菜生产上的重要病害，目前生产上菌核病造成的油菜产量和品质损失巨大，使得选育抗病品种显得尤其重要，但是目前对于油菜中参与菌核病防御的基因及基因调控网络认知还不清楚。tlp作为一类拥有相当数量的防御蛋白家族，其在油菜菌核病防御中的生物学功能并没有得到全面深入地解析。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种甘蓝型油菜防御相关基因bntlp1及其对菌核病抗性方面的应用。本发明主要针对甘蓝型油菜bntlp1基因，通过分子调控该基因的表达，借助拟南芥转化系统来研究bntlp1基因对菌核病抗性的功能。

甘蓝型油菜菌核病抗性相关基因bntlp1，所述基因bntlp1的核苷酸序列如seqidno.1所示：

atgatttatcaaaaaacacttctcacagtctttttctttgcatttatcaccatatactttgtaatcttagcagatgcgactacgttcacagtaaggaacaattgtccatatgttgtgtgggctgccacatctgctccgggaaagcctggcggtgggaagcgactcaatcaaggcgaaacgtggatcgttactggtgatccaggtaccacccaggctcggatttggggtcgtaccaactgcaacttcgatgtctctggaagaggtggatgccaaactggagattgtaatggtgtacttgagtgcaaatcttatggacgagcaccaaatacattggcagaatattctcttaaacaatatgcagaccaagatttcatcgatatttctgtgatcgatggattcaatattccaatggaattcagttctgcatctggacaatgcacccgcaaaattaggtgtacgggagatattatagctcaatgtccagcccaactaagaatggacggcgcttgcaacggaccgtgtccggtgttgaagacggaggaacattgttgcaactctggtaattgtggaccgaccccactctctatgtttttcaagcaacgttgtccagatgcctatagttatcctaaggatgatcccaccagccttttcacttgccctagcggaaccaactacaatgtcattttctgtccgtga。

甘蓝型油菜菌核病抗性相关蛋白bntlp1，所述蛋白bntlp1由所述的核苷酸序列编码。

进一步的，所述蛋白bntlp1的氨基酸序列如seqidno.2所示：

miyqktlltvfffafitiyfviladattftvrnncpyvvwaatsapgkpgggkrlnqgetwivtgdpgttqariwgrtncnfdvsgrggcqtgdcngvlecksygrapntlaeyslkqyadqdfidisvidgfnipmefssasgqctrkirctgdiiaqcpaqlrmdgacngpcpvlkteehccnsgncgptplsmffkqrcpdaysypkddptslftcpsgtnynvifcp。

本发明还提供甘蓝型油菜菌核病抗性相关基因bntlp1的应用，其中，所述基因bntlp1的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供甘蓝型油菜菌核病抗性相关基因bntlp1在油菜抗病改良方面的应用，其中，所述基因bntlp1的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供甘蓝型油菜菌核病抗性相关基因bntlp1在油菜分子育种方面的应用，其中，所述基因bntlp1的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供一种重组表达载体，其包含权利要求1所述的甘蓝型油菜菌核病抗性相关基因bntlp1。

本发明还提供一种重组菌株，其包含权利要求1所述的甘蓝型油菜菌核病抗性相关基因bntlp1。

进一步的，本发明还提供所述的重组表达载体在油菜抗菌核病中的应用，将所述重组表达载体转化微生物培养表达，以浸花法转化目标植物，获得抗性转基因株系。

本发明还提供一种提高油菜对菌核病抗性的方法，所述方法包括在油菜中过表达油菜菌核病抗性相关基因bntlp1的步骤，其中，所述基因bntlp1的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供甘蓝型油菜防御相关基因bntlp1的细胞定位和可能参与的防御信号通路方面的应用。

所述甘蓝型油菜菌核病高抗品种“中双11”中防御相关基因bntlp1的克隆、基于同源重组法构建过表达载体35s::bntlp1；采用农杆菌gv3101介导的遗传转化方法，将过表达载体转入野生型拟南芥col-0，通过潮霉素抗性筛选，获得抗性再生植株，再通过pcr分析最终确定阳性转基因植株；通过三引物法鉴定得到bntlp1的拟南芥直向同源基因t-dna纯合突变体tlp1-1；菌核病抗性鉴定结果显示过量表达bntlp1病斑扩展显著小于野生型，突变体tlp1-1病斑大于野生型；亚细胞定位表明bntlp1同时定位在细胞核和细胞膜，而不同防御信号通路标志基因表达分析显示茉莉酸/乙烯途径可能在核盘菌入侵植物早期介导了bntlp1的菌核病抗性功能。

综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

1.虽然水稻和拟南芥等模式植物中已经克隆了多个tlp家族的基因，研究者对其进行了一些抗病功能验证，但目前为止tlp基因的功能在油菜菌核病抗性方面还缺乏足够的深入研究，本发明克隆的bntlp1基因丰富了油菜中对这类基因的研究。

2.本发明中克隆得到的bntlp1基因，为其它作物抗病育种提供了新的遗传资源，为提高其它作物对菌核病抗性具有指导和借鉴作用。

3.本发明构建的植物重组表达载体转化油菜后获得的bntlp1过表达株系，从bntlp1的功能获得方面进行研究，为tlp的抗病功能研究提供了原材料，具有重要意义。

4.本发明通过对bntlp1过表达株系在抗菌核病方面的一系列研究，证明其能够正调控植物菌核病抗性，证明了bntlp1参与到了植物对菌核病的抗性响应中，并扮演着重要的角色。通过调控bntlp1基因的表达能够调节植物体内抗性相关基因的表达，提高植物对菌核病的抗性。对阐述bntlp1基因的生物学功能有重要意义。

5.bntlp1这一油菜菌核病抗性基因的发现，为发掘和鉴定作物抗菌核病基因，并探讨抗菌核病基因的分子作用机理，具有重要的理论指导意义。

6.选育抗菌核病的油菜材料一直为油菜育种家所重视，bntlp1的开发和利用将有助于解决生产上油菜抗菌核病问题。由于目前生产上菌核病造成的油菜产量和品质损失巨大，使得选育抗病品种显得尤其重要，bntlp1基因的克隆将有助于培育高抗油菜品种，也为tlp在主要油料作物(油菜)抗菌核病方面的应用提供了理论与实践依据；为进一步培育具有菌核病抗性的油菜品种提供了新的育种材料；在作物抗菌核病的育种实践、品种改良及品种推广均具有重要的实践指导价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为甘蓝型油菜bntlp1基因的克隆；m:dl2000dnamarker；1:bntlp1基因片段大小；

图2为bntlp1转基因植株的pcr鉴定；m:dl2000dnamarker；1:col-0野生型拟南芥；2:35s::bntlp1重组质粒阳性对照；3-7:35s::bntlp1转基因阳性苗；35s::bntlp1-1,-2,-3,-4和-5为5个bntlp1过表达转基因株系。拟南芥actin基因(at1g13180)作为定量的内参基因；

图3为bntlp1转基因植株的qrt-pcr分析。col-0为野生型拟南芥；35s::bntlp1为重组质粒阳性对照；35s::bntlp1-1,-2,-3,-4和-5分别为5个bntlp1过表达转基因株系。拟南芥actin基因(at1g13180)作为定量的内参基因；

图4为拟南芥纯合突变体tlp1-1的筛选。m：dl2000dnamarker；编号1-24:突变体株系；

图5为甘蓝型油菜bntlp1过表达和拟南芥突变体tlp1-1的菌核病抗性分析；左图为不同时间病斑情况(35s::bntlp1是3个转基因株系的平均值)；右图为拟南芥活体接菌36hpi后病斑情况；35s::bntlp1：过表达株系；col-0:野生型拟南芥；tlp1-1：拟南芥bntlp1的t-dna纯合突变体；

图6为bntlp1-gfp蛋白亚细胞定位；a:荧光通道；b:白光通道；c:复合通道；

图7为bntlp1不同防御信号通路标志基因定量分析。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

下面以bntlp1的菌核病抗性为实施例对本发明的原理和特征进行描述，下述实施例中所用的材料、试剂、载体和农杆菌等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购买。

实施例1：bntlp1基因ta克隆与序列测定

取甘蓝型油菜“中双11”嫩叶部位，用trizolreagent(invitrogen公司，货号15596026)提取总rna，使用nanodrop检测总rna的含量和纯度，取2.0μg总rna做逆转录反应，所采用的逆转录酶为m-mlv(promega公司，货号m1701)，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录反应合成的第一链cdna为模板，使用引物：

5’-atgatttatcaaaaaacacttctc-3’；

5’-tcacggacagaaaatgacat-3’；

进行常规pcr扩增；pcr反应体系为(20μl)：1μlcdna，2μl10×buffer，1.6μldntp(2.5mm)，正/反向引物(10μm)各1μl，0.4μltaq酶(5u/μl)和13μlddh2o(设置8管体系，大量扩增目的基因)。在冰上加样后混匀。pcr反应条件为：94℃5min；94℃30sec，52℃30sec；72℃30sec，30个循环；72℃10min。pcr扩增获得长度为696bp的片段。1％琼脂糖凝胶电泳回收该片段，nanodrop仪器检测dna质量，于simplecloningvector进行ta克隆(全式金公司，目录号ct111-01)，反应体系为：4μl回收产物，1μlsimplecloningvector，25℃恒温孵育器反应5min。连接产物，用热激法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，加400μl新鲜的液体lb培养基，复苏20min，涂于氨苄抗生素的lb平板上，37℃倒置过夜培养。挑选白色单克隆菌落，在含氨苄抗生素的液体lb培养基中扩增培养，测序。经测序分析表明，该序列含有一个完整的开放阅读框，全长696个碱基，序列如seqidno.1所示，其编码蛋白含有231个氨基酸残基，序列如seqidno.2所示。

实施例2：bntlp1基因过表达载体的构建

以实施例1的bntlp1基因ta克隆质粒为模板，采用引物bntlp1-f/r克隆bntlp1基因。引物如下：

bntlp1-f:

5’-ccatcgatagtactgtcgacatgatttatcaaaaaacacttctc-3’；

bntlp1-r:

5’-tccatcccgggagcggtacccggacagaaaatgacat-3’；

经同源重组法将bntlp1基因与实验室改造载体pgtvii-3flag连接，连接体系(20μl)：pgtvii-3flag线性载体12μl，bntlp1纯化产物1μl，酶(exnaseii)2μl，5×ceiibuffer5μl。本实施例中使用pgtvii-3flag载体，其他载体亦可用于构建bntlp1的重组表达载体。pcr验证重组载体中目的基因片段大小，如图1所示，图中泳道“m”为dl2000dnamarker，泳道“1”为bntlp1基因片段，bntlp1基因片段大小为696bp，符合预期。重组质粒通过热激法转入大肠杆菌dh5α，并经过卡那霉素抗性筛选获得单克隆，测序。大肠杆菌dh5α为实验室常用的用于转化的菌株，本实施例以dh5α为例，其他可以用来转化的菌株都可用来制备包含bntlp1的重组菌株。经测序分析表明，bntlp1基因序列含有一个完整的开放阅读框，全长696个碱基，序列如seqidno.1所示，其编码蛋白含有231个氨基酸残基，序列如seqidno.2所示。

实施例3：bntlp1基因的遗传转化

通过碱裂解法，提取bntlp1基因的dh5α重组菌株质粒，命名35s::bntlp1。转农杆菌gv3101感受态细胞：感受态细胞冻融后加入10μl重组质粒，混匀，冰浴5min；液氮中冷冻5min；37℃恒温水浴锅水浴5min；加入新鲜的无抗生素的液体lb培养基，混匀后，28℃，220rpm/min活化2h。涂布于含卡那霉素和利福平的lb平板上，28℃，倒置暗培养2天，使用实施例2中的bntlp1-f/r引物检测阳性单克隆，在卡那霉素和利福平抗性的液体lb培养基中扩增培养，用于野生型拟南芥col-0的遗传转化。

农杆菌介导的野生型拟南芥col-0遗传转化方法：扩增培养的农杆菌，4000rpm/min，室温离心15min，弃上清，加蔗糖悬浮液混匀(300mlddh2o加入15g蔗糖和70μlsilwetl-77)。通过花序侵染法，将野生型col-0的花序浸泡在农杆菌悬浮液45sec，黑暗条件保湿培养24h。经pcr鉴定扩增bntlp1基因，结果如图2所示，泳道m为dl2000dnamarker；泳道1为col-0野生型拟南芥；泳道2为35s::bntlp1重组质粒阳性对照；泳道3-7为35s::bntlp1转基因阳性苗；35s::bntlp1-1,-2,-3,-4和-5为5个bntlp1过表达转基因株系。

实施例4：转基因植株分子鉴定

取上述鉴定转基因阳性植株嫩叶组织，使用trizol(invitrogen公司，货号15596026)法提取总rna，逆转录酶(promega公司，货号m1701)合成第一链cdna，以拟南芥actin基因作为内参基因，采用引物bntlp1-qf/qr检测转bntlp1基因的阳性转基因植株表达量情况，引物序列如下：

bntlp1-qf：5’-atgatttatcaaaaaacacttctcac-3’；

bntlp1-qr：5’-ctttcccggagcagatgt-3’；

atactin-qf：5’-cccgctatgtatgtcgcca-3’；

atactin-qr：5’-aaccctcgtagattggcaca-3’；

如图3所示，col-0为野生型拟南芥；35s::bntlp1为重组质粒阳性对照；35s::bntlp1-1,-2,-3,-4和-5分别为5个bntlp1过表达转基因株系。转基因植株35s::bntlp1-1,-2,-3,-4和-5中bntlp1基因的表达量明显高于野生型，说明目的基因bntlp1成功转入野生型拟南芥。

实施例5：纯合突变体tlp1-1的筛选

bntlp1在拟南芥中的直向同源基因为attlp1(at4g11650)，在tair网站购买到该基因的突变体(wiscdsloxhs168_05c，插入位点为cds序列3’端)。根据http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html网站信息，获得lp、rp以及通用引物lbb1的引物信息，引物如下：

lp:5’-tcatattttccgcacttttgc-3’；

rp:5’-cgtacaccctcacacacacac-3’；

lbb1：5’-gcgtggaccgcttgctgcaact-3’；

通过三引物法(李敏等，拟南芥t-dna插入突变体atsuc3的pcr鉴定，2006，植物生理学通讯，(1):91-94)筛选到24株纯合突变体，如图4所示，泳道m为dl2000dnamarker；1-24泳道分别为1-24号突变体株系，选取其中1株用于抗病鉴定。

实施例6：甘蓝型油菜bntlp1的菌核病抗病分析

分别选择实施例4中的3个高表达bntlp1基因的转基因阳性株系和实施例5中的纯合突变体tlp1-1作为菌核病鉴定材料。实验材料于生长间(16h/光照、8h/黑暗)培养5周，活体接种核盘菌。如图5所示，左图为不同时间病斑情况(35s::bntlp1是3个转基因株系的平均值)；右图为拟南芥活体接菌36hpi后病斑情况；35s::bntlp1为过表达株系；col-0为野生型拟南芥；tlp1-1为拟南芥bntlp1的t-dna纯合突变体；由图5左图结果可以看出接种24小时后(hourspostinoculation,hpi)的转基因拟南芥开始发病，野生型col-0发病已较明显；接种48hpi后转基因拟南芥病斑变大，野生型col-0病斑已扩大到叶片边缘。病斑大小统计的结果显示bntlp1过表达材料的病斑扩展显著小于野生型col-0，而tlp1-1突变体的病斑扩展大于野生型col-0。对bntlp1过表达材料、tlp1-1突变体、野生型col-0接种后24hpi、36hpi、48hpi病斑大小进行单因素方差分析，发现以野生型col-0为对照，bntlp1过表达材料对核盘菌抗性具有极显著性，而突变体tlp1-1无显著差异。以上结果表明上调bntlp1基因的表达能够增强菌核病抗性。

实施例7：bntlp1的亚细胞定位

为了明确bntlp1行使功能的可能细胞位置，本发明借助烟草瞬时转化系统表达了bntlp1-gfp的融合蛋白。参照实施例2中的同源重组法连接bntlp1基因和亚细胞定位载体p2300-gfp，测序正确后转农杆菌gv3101。转烟草实验2天后，在激光共聚焦显微镜观察下发现，如图6所示，a为绿色荧光通道，b为白光通道，c为复合通道，绿色荧光通道下的bntlp1-gfp在细胞核和细胞膜有荧光，结合白光与复合光更能清楚的看到细胞核和细胞膜表达bntlp1-gfp，说明bntlp1基因能够定位在细胞核和细胞膜上。

实施例8：bntlp1各遗传材料信号通路标志基因定量分析

实施例7中亚细胞定位的结果显示bntlp1基因不仅定位在细胞膜上，还定位在细胞核里，因此，本发明进一步研究了该基因在细胞核内调控菌核病抗性可能的信号通路，在bntlp1过表达株系、tlp1-1以及野生型col-0接菌后不同时间点取样检测ja(茉莉酸)/et(乙烯)、sa(水杨酸)以及ros(活性氧)途径的标志基因pdf1.2，pr1以及rbohb的表达变化。结果如图7所示，ja途径的防御基因pdf1.2的表达量在各材料中随着接种时间都呈上升趋势，说明ja/et能够正面响应核盘菌的入侵；在24hpi时间点，pdf1.2表达量在过表达材料中高于野生型，而tlp1-1表达量低于野生型，暗示着在核盘菌侵染早期ja/et途径可能参与了bntlp1调控的菌核病抗性；但是24hpi之后，pdf1.2的表达在各材料中并无规律性变化，推测在侵染后期bntlp1介导的抗性与ja/et途径无明显联系。pr1的表达在所有材料中都受到明显的抑制，表明sa途径在核盘菌诱导的植物信号防御途径中起负调控作用，同时tlp1各遗传材料与野生型col-0相比无明显变化，表明tlp1对菌核病的功能并不通过sa途径。rbohb的表达在bntlp1过表达转基因株系和突变体tlp1-1中与野生型col-0相比表现出类似的规律，同样说明ros信号途径没有参与介导bntlp1的功能。

综上，通过基因工程技术，在拟南芥中过量表达bntlp1能够显著提高拟南芥菌核病抗性，初步揭示了bntlp1在菌核病抗性中的具有正面作用，烟草亚细胞定位和不同激素途径标志基因表达分析说明bntlp1不仅在细胞膜上抵御病菌入侵，在细胞核中同样存在可能的信号转导功能。本发明的甘蓝型油菜防御相关基因bntlp1正调控菌核病，为油菜菌核病功能基因的挖掘和菌核病抗病育种提供了新的靶基因源分子，也为油菜菌核病抗性调控网络研究提供方向指导和可行性基础，对增强甘蓝型油菜对菌核病抗性具有重要的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>调控甘蓝型油菜菌核病抗性的bntlp1基因及其应用

<130>2020

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>696

<212>dna

<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

<400>1

atgatttatcaaaaaacacttctcacagtctttttctttgcatttatcaccatatacttt60

gtaatcttagcagatgcgactacgttcacagtaaggaacaattgtccatatgttgtgtgg120

gctgccacatctgctccgggaaagcctggcggtgggaagcgactcaatcaaggcgaaacg180

tggatcgttactggtgatccaggtaccacccaggctcggatttggggtcgtaccaactgc240

aacttcgatgtctctggaagaggtggatgccaaactggagattgtaatggtgtacttgag300

tgcaaatcttatggacgagcaccaaatacattggcagaatattctcttaaacaatatgca360

gaccaagatttcatcgatatttctgtgatcgatggattcaatattccaatggaattcagt420

tctgcatctggacaatgcacccgcaaaattaggtgtacgggagatattatagctcaatgt480

ccagcccaactaagaatggacggcgcttgcaacggaccgtgtccggtgttgaagacggag540

gaacattgttgcaactctggtaattgtggaccgaccccactctctatgtttttcaagcaa600

cgttgtccagatgcctatagttatcctaaggatgatcccaccagccttttcacttgccct660

agcggaaccaactacaatgtcattttctgtccgtga696

<210>2

<211>231

<212>prt

<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

<400>2

metiletyrglnlysthrleuleuthrvalphephephealapheile

151015

thriletyrphevalileleualaaspalathrthrphethrvalarg

202530

asnasncysprotyrvalvaltrpalaalathrseralaproglylys

354045

proglyglyglylysargleuasnglnglygluthrtrpilevalthr

505560

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65707580

asnpheaspvalserglyargglyglycysglnthrglyaspcysasn

859095

glyvalleuglucyslyssertyrglyargalaproasnthrleuala

100105110

glutyrserleulysglntyralaaspglnasppheileaspileser

115120125

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130135140

glncysthrarglysileargcysthrglyaspileilealaglncys

145150155160

proalaglnleuargmetaspglyalacysasnglyprocysproval

165170175

leulysthrglugluhiscyscysasnserglyasncysglyprothr

180185190

proleusermetphephelysglnargcysproaspalatyrsertyr

195200205

prolysaspaspprothrserleuphethrcysproserglythrasn

210215220

tyrasnvalilephecyspro

225230