CA15-3编码基因、CA15-3蛋白及其制备方法和应用与流程

本申请属于生物
技术领域：
，特别涉及一种ca15-3编码基因、ca15-3蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
：糖链抗原15-3(ca15-3)是由黏蛋白l(mucin1，mucl)基因编码得到的一种高糖基化、高分子量的蛋白，又称为黏蛋白l、多形上皮黏蛋白(polymorphicepithelialmucin，pem)、上皮膜抗原(epithelialmembraneantigen，ema)及cd227等，最先由shimizu于1982年从人的乳汁中分离得到，它是黏蛋白家族中最重要的成员之一。ca15-3由多肽骨架和o-糖苷键连接的糖基侧链构成，其中，糖链约占其重量的50％-90％。ca15-3为穿膜糖蛋白，分为胞外区、跨膜区和胞内区，其中，跨膜区(包括28个氨基酸)和胞内区(包括72个氨基酸)在不同种间的结构是高度保守的，相比较而言，胞外区相对保守程度较低。c15-3胞外区是细胞表面最先与机体免疫系统接触的膜表面分子之一，含30个～90个连续重复序列(variablenumberoftandemrepeats，vntr)，每个vntr由20个氨基酸组成，它们是hgvtsapdtrpapgstappa。muc1基因转录后可形成不同的cdna产物，这些cdna产物可编码产生相应的同种型，例如，muc1/rep、muc1/sec、muc1/x、muc1/y和muc1/z，其中muc1/y表达具有肿瘤组织特异性。ca15-3存在于正常组织腺上皮细胞表面的分泌极，其作用为润滑、保护、调节细胞间黏附等，同时，ca15-3还广泛，并且，存在于腺癌上皮细胞的表面的ca15-3表达异常丰富，目前的研究认为，其异常表达程度与肿瘤恶性程度呈正相关，例如，在乳腺癌、肺腺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌等多种癌组织中均有异常表达，其异常表达程度越高提示肿瘤侵袭性越强，预后越差，且其表达与淋巴结转移、肿瘤进展明显相关，目前ca15-3已被列为乳腺癌的最重要的特异性标志物。目前常采用免疫分析法来检测血浆中ca15-3蛋白含量，因此，需使用大量高质量的校准品作为对照，作为对照的ca15-3蛋白质需要活性高、稳定性好，经过长时间贮存而活性几乎无下降。目前市售的ca15-3蛋白校准品的来源多样，例如，来自为乳腺癌细胞培养物或人体液。一般地，高品质ca15-3蛋白来源于天然提取，但是，由于天然提取的ca15-3来源不稳定，并且，目的蛋白含量低且蛋白结构不均一等原因，严重阻碍ca15-3蛋白校准品等诊断产品的研究开发，因此，科研人员转向利用基因工程研发大量生产ca15-3的方法。技术实现要素：为解决上述问题中的至少一个，本申请提供一种ca15-3编码基因、融合有所述ca15-3编码基因的重组质粒、利用所述重组质粒在人源细胞株hek-293t细胞中分泌表达制备ca15-3蛋白的方法以及利用所述方法制备的ca15-3蛋白。本申请的目的在于提供以下几个方面：第一方面，一种ca15-3蛋白的编码基因，所述编码基因包括如下(1’)至(3’)中的至少一种：(1’)如seqidno.2所示的dna分子；(2’)在严格条件下与(1’)所示dna分子杂交，并且编码ca15-3蛋白的dna分子，其中，所述ca15-3蛋白如下(1)或者(2)所示：(1)如seqidno.1所示的蛋白；(2)将seqidno.1所示的蛋白经过一个或者几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且具有相同功能的蛋白；(3’)与(1’)或者(2’)所述dna分子具有90％以上同一性，并且编码所述ca15-3蛋白的dna分子。在本申请中，本发明提供的编码基为ca15-3(24-1148aa)序列，即，muc1胞外段全长，即保留其全部连续重复序列，发现由该全部连续重复序列所表达的重组蛋白具有较高活性，而本申请人对muc1基因转录后所形成的muc1/y的胞外段蛋白和muc1胞外段40个连续重复序列区进行部分克隆(克隆长度10个～20个vntrs)和表达，发现表达产物经癌抗原15-3检测试剂盒(化学发光免疫分析法)检测无活性或者活性很低。另外，本申请所提供的编码基因为优化的人源ca15-3编码基因，能够在人源细胞分泌系统，特别是hek-293t细胞系统中表达，表达的目的蛋白活性高。稳定好。第二方面，含有第一方面所述编码基因的重组质粒、表达盒、转染细胞或者重组菌。在一种可实现的方式中，所述重组质粒由pcdna3.1z(+)载体与所述ca15-3编码基因融合而得。进一步地，所述pcdna3.1z(+)载体由cmv启动子及6×his分泌信号肽基因构建而成。进一步地，所述转染细胞所用细胞为人源细胞株hek-293t细胞。本申请人发现，利用pcdna3.1z(+)载体与所述ca15-3编码基因融合，并将融合所得重组质粒与人源细胞株hek-293t细胞结合成转染细胞，从而够使所述ca15-3编码基因的在培养条件下分泌表达于胞外，将ca15-3蛋白表达于培养体系的上清液中，便于ca15-3蛋白的收集和利用。第三方面，一种制备ca15-3蛋白的方法，所述方法包括：步骤1，将第一方面所述编码基因克隆至pcdna3.1z(+)载体中构建重组质粒；步骤2，将步骤1获得的重组质粒转染至hek-293t细胞中；步骤3，将步骤2获得的细胞传代培养，传代培养所用培养基中含有博来霉素；步骤4，将步骤3所获得的细胞进行培养，使其分泌表达ca15-3蛋白。在一种可实现的方式中，在步骤1中，所述编码基因无内毒素，浓度大于＞1μg/μl。进一步地，所述pcdna3.1z(+)载体由cmv启动子及6×his分泌信号肽基因构建而成。在一种可实现的方式中，在步骤2中，所述hek-293t细胞可按照如下步骤2-1至步骤2-3准备：步骤2-1，根据细胞状态取3～7代次以内的hek-293t细胞，铺多孔板，使得细胞密度在2×105～5×105cells/孔，其中，所述多孔板可以为六孔板；步骤2-2，以含10％fbs(胎牛血清)的dmem完全培养基上述细胞，培养至细胞汇合度在80％～95％之间，一般地，培养18h～24h即可满足上述细胞汇合度要求，其中，细胞培养条件为：培养温度为37℃，co2浓度可以为5％，湿度可以为80％饱和湿度；步骤2-3，使用invitrogen2000转染试剂进行转染，具体可按试剂盒说明书进行操作。可以理解的是，还可以使用其它能够实现同一目的的其它转染试剂，具体操作可按照所选用的转染试剂盒说明进行。在一种可实现的方式中，步骤3中，传代比可以为1：(8～12)，例如，1:10，其中，所用传代培养基为含有10％fbs以及400μg/ml博来霉素dmem完全培养基；传代培养的条件为：培养温度为37℃，co2浓度为5％，湿度为80％饱和湿度，培养时间为14天，每7天更换1次新鲜上述传代培养基。进一步地，在传代培养完成后，可将传代培养获得的细胞进行冻存，冻存条件可以为-80℃，以便后续使用。可以理解的是，也可以不对所获得的细胞进行冻存而直接使用，是否进行冻存可根据实际需求而自行选择。在一种可实现的方式中，步骤4中所用培养基可以为：含10％fbs以及400μg/ml博来霉素的dmem完全培养基，培养条件可以为：培养温度为37℃，co2浓度为5％，湿度为80％饱和湿度，培养时间为7天。可选地，如果所选用的种子为冻存样本，则在培养前还包括冻存细胞复苏的步骤。进一步地，冻存细胞复苏可采用现有技术中任意一种复苏冻存细胞的方法。在本申请中，在步骤4之后，还可以包括对步骤4所得ca15-3蛋白进行纯化。进一步地，所述纯化采用中空纤维柱进行。第四方面，一种根据第三方面所述方法制备的ca15-3蛋白。第五方面，一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括第四方面所述ca15-3蛋白。第六方面，第四方面所述ca15-3蛋白和/或第一方面所述编码基因用于制备ca15-3蛋白校准品的应用。与现有技术相比，本申请提供的方案在pcdna3.1z(+)载体上改造融入荧光素酶信号肽以及6×his标签，再将编码基因融入改造后的载体中获得重组质粒，即，瞬转高效表达质粒pcdna3.1z(+)，再将所述重组质粒融合表达ca15-3胞外段(24-1148aa)，再转染hek-293t细胞，通过博来霉素抗性筛选获得混合细胞株，从而实现ca15-3蛋白在细胞内的分泌表达，其中，载体上的6×his标签有利于后续亲和层析纯化及蛋白质免疫印迹检测；本申请中，融合细胞选用hek-293t细胞，并且，筛选混合细胞株的试剂使用博来霉素，使得复苏的种子均可稳定地表达ca15-3蛋白；利用本申请所提供方案而获得的ca15-3蛋白活性高、稳定性好，具体地，蛋白活性可达3ku/ml，保存于缓冲液中的ca15-3蛋白，在37℃加速7天及-20℃冻融3次后，对所述ca15-3蛋白的活性无显著影响，该抗原经粗纯可用于ca15-3化学发光测定试剂盒的校准品和质控品制备。附图说明图1示出pcdna3.1(+)质粒图谱；图2示出pcdna3.1z(+)-gluc-his-ca15-3(24-1148aa)质粒构建双酶切验证结果；图3示出ca15-3蛋白表达蛋白质免疫印迹检测；图4示出ca15-3蛋白稳定性结果。具体实施方式这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致方法的例子。下面通过具体的实施例对本申请提供的制备ca15-3蛋白的方法进行详细阐述。在本实例中，所使用的实验方法如无特殊说明，则为常规方法。在本实例中，所使用的主要试剂及仪器如无特别说明，则均可商购。一种制备ca15-3蛋白的方法，所述方法包括以下步骤1至步骤4：步骤1，将编码基因克隆至pcdna3.1z(+)载体中构建重组质粒。在本实例中，所制备的ca15-3蛋白，即，目标蛋白如下(1)或者(2)所示：(1)如seqidno.1所示的蛋白；(2)将seqidno.1所示的蛋白经过一个或者几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且具有相同功能的蛋白。在本实例中，所述编码基因包括如下(1’)至(3’)中的至少一种：(1’)如seqidno.1所示的dna分子；(2’)在严格条件下与(1’)所示dna分子杂交，并且编码前述ca15-3蛋白的dna分子；(3’)与(1’)或者(2’)所述dna分子具有90％以上同一性，并且编码前述ca15-3蛋白的dna分子。本申请所提供的编码基因为优化的人源ca15-3编码基因，能够在人源细胞系统中表达。按上述内容将gluc-his-ca15-3(24-1148aa)蛋白序列合成针对hek-293t细胞表达系统密码子偏好性优化的表达的序列，基因合成于puc57载体。在本实例中，所述ca15-3编码基因无内毒素，为转染级别质粒dna，并且浓度大于1μg/μl，以满足转染要求。本实例所用载体为哺乳动物细胞载体pcdna3.1z(+)，其载体酶切位点及启动子位点如图1所示。在本实例中，可将gluc-his-ca15-3(24-1148aa)以nheⅰ和hindⅲ双酶切装入载体pcdna3.1z(+)中，获得重组质粒。步骤2，将步骤1获得的重组质粒转染至hek-293t细胞中。在本实例中，本步骤可以包括如下步骤1-1至步骤1-3：步骤1-1，根据细胞状态取3～7代次以内的hek-293t细胞，铺多孔板，例如，六孔板，使得细胞密度在2×105～5×105cells/孔；步骤1-2，以含10％fbs的dmem完全培养基上述细胞，培养至细胞汇合度在80％～95％之间，一般地，培养18h～24h即可满足上述细胞汇合度要求。其中，细胞培养条件为：培养温度为37℃，co2浓度可以为5％，湿度可以为80％饱和湿度。步骤1-3，使用invitrogen2000转染试剂将重组质粒转染至hek-293t细胞中，具体地，转染操作可按试剂盒说明书进行操作。步骤3，将步骤2获得的细胞传代培养，传代培养所用培养基中含有博来霉素。在本实例中，本步骤具体可以包括：在步骤2转染24h后，将所得细胞按照1:10进行传代培养，传代培养所得体系移至4支t25方瓶中，其中，传代培养基为含10％fbs的dmem完全培养基培养，并且，含400μg/ml博来霉素；培养条件为：培养温度为37℃，co2浓度为5％，湿度为80％饱和湿度，培养14天，每7天更换1次新鲜上述传代培养基。上述培养14天后，细胞收获冻存于细胞冻存液氮罐，每个方瓶细胞收集至1支冻存管，以便后续使用。可以理解的是，冻存条件可为现有技术中任意能够长期保持细胞活性的条件。进一步地，也可以不对所获得的细胞进行冻存而直接使用，是否进行冻存可根据实际需求而自行选择。步骤4，将步骤3所获得的细胞进行培养，使其分泌表达ca15-3蛋白。在本步骤中，以冻存的细胞为原料进行培养，则，本步骤具体为：取上述冻存细胞，并采用适当方式复苏；对复苏后的细胞进行培养，所用培养基为含10％fbs的dmem完全培养基，并且，包括含400μg/ml博来霉素；培养条件为：培养温度为37℃，co2浓度为5％，湿度为80％饱和湿度，培养7天。在本实例中，对本步骤所收获的蛋白进行表达鉴定，具体地，以蛋白质免疫印迹法检测ca15-3蛋白表达，结果如图3所示，其中，1号电泳谱为步骤3所得上清100μl的电泳结果；2电泳谱为步骤4所得上清100μl的电泳结果。由图3可知，步骤3培养7天后即能检出ca15-3蛋白；相较于步骤3所得的体系，步骤4所得体系的细胞培养上清ca15-3有更高的表达，这表明经步骤3冻存后细胞，通过复苏和博来霉素浓度维持培养(即步骤4)可稳定表达。在本实例中，对本步骤所收获的蛋白进行蛋白活性测定，具体地，以癌抗原15-3检测试剂盒(化学发光免疫分析法)测定ca15-3蛋白活性，结果如下表1所示：表1ca15-3蛋白活性其中，样品浓度是指当前稀释倍数下样品活性浓度，母液浓度是指稀释前样品原液活性浓度。由表1可知，步骤4所得的细胞培养上清中ca15-3表达量较高，约3ku/ml，可达癌抗原15-3检测试剂盒[化学发光免疫分析法]检测上限约10倍(癌抗原15-3检测试剂盒[化学发光免疫分析法]检测上限为300u/ml)。在本实例中，在步骤4之后，还可以包括以下步骤：步骤5，对ca15-3蛋白进行纯化，具体地，本步骤可以包括：对步骤4所得上清液进行浓缩换液，具体地，以仕必纯中空纤维柱(d02-e010-05-n)浓缩换液步骤4所得细胞上清液；其中，浓缩换液缓冲液为20mmpb，0.15mnacl，ph＝7.4；蛋白保存缓冲液为20mmpb，0.15mnacl，ph＝7.4，终浓度10％甘露醇(m/v)。试验例试验例1ca15-3蛋白的活性浓度本试验例所用样本为前述步骤5所得粗纯ca15-3蛋白。试验方法：化学发光免疫分析法，结果如表2所示：表2有效活性浓度由表2可知，采用本申请提供方法制备的ca15-3蛋白有效活性浓度可达25ku/ml。试验例2ca15-3蛋白的线性本试验例所用样本为前述步骤5所得粗纯ca15-3蛋白。试验方法：梯度稀释法，结果如表3所示：表3百分比浓度u/ml10078.0855037.3152518.6712.59.786.255.363.1252.891.56251.545根据上表绘制标准曲线，结果如图4所示，由图4可知，按本申请提供方法所获得的粗纯ca15-3蛋白稀释至试剂盒检测线性范围内，ca15-3蛋白线性优良，r2可达0.9993。试验例3ca15-3蛋白的稳定性本试验例所用样本为前述步骤5所得粗纯ca15-3蛋白。试验方法：将粗纯ca15-3蛋白分装7支，分别在-20℃冻存，-20℃反复冻融3次(每3天复融一次)，4℃保存，37℃加速1天、3天、5天、7天样品，以化学发光免疫分析法检测有效活性浓度变化，结果如下表4所示：表4稳定性试验结果根据表4的结果可知，利用本申请提供方法所制备ca15-3蛋白稳定性较好，相较于4℃保存样品，-20℃保存及冻融3次，3℃加速7天样品中ca15-3蛋白活性浓度均未发生显著变化。本申请所提供的ca15-3编码基因为muc1(uniprotaccession:p15941)，选取其胞外段24-1148aa，n端融入荧光素酶信号肽(gluc)及6×his标签，合成经人源序列优化，有利于在hek-293t细胞中表达的序列。本申请通过基因克隆技术将人ca15-3基因(uniprotaccession:p15941)的胞外段全长(24-1148aa)克隆至哺乳动物细胞载体pcdna3.1z(+)载体中，n端融入可在hek-293t细胞中实现高效分泌表达的荧光素酶信号肽及可实现亲和层析纯化的6×his标签，并将该质粒转染hek-293t细胞，经抗性筛选获得ca15-3蛋白高表达、高活性细胞株，该细胞株能够分泌表达高活性且稳定性优良的ca15-3蛋白。利用本申请方案所提供的重组人源ca15-3蛋白能够满足体外诊断试剂校准品和质控品对于ca15-3蛋白需求量大、质优、活性高以及性质稳定的需求，可用于制备外诊断试剂校准品和质控品。以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。序列表<110>南京基蛋生物医药有限公司<120>ca15-3编码基因、ca15-3蛋白及其制备方法和应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1125<212>prt<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>1serglyhisalaserserthrproglyglyglulysgluthrserala151015thrglnargserservalproserserthrglulysasnalavalser202530metthrserservalleuserserhisserproglyserglyserser354045thrthrglnglyglnaspvalthrleualaproalathrgluproala505560serglyseralaalathrtrpglyglnaspvalthrservalproval65707580thrargproalaleuglyserthrthrproproalahisaspvalthr859095seralaproaspasnlysproalaproglyserthralaproproala100105110hisglyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthr115120125alaproproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproala130135140proglyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproasp145150155160thrargproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthr165170175seralaproaspthrargproalaproglyserthralaproproala180185190hisglyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthr195200205alaproproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproala210215220proglyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproasp225230235240thrargproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthr245250255seralaproaspthrargproalaproglyserthralaproproala260265270hisglyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthr275280285alaproproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproala290295300proglyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproasp305310315320thrargproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthr325330335seralaproaspthrargproalaproglyserthralaproproala340345350hisglyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthr355360365alaproproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproala370375380proglyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproasp385390395400thrargproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthr405410415seralaproaspthrargproalaproglyserthralaproproala420425430hisglyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthr435440445alaproproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproala450455460proglyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproasp465470475480thrargproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthr485490495seralaproaspthrargproalaproglyserthralaproproala500505510hisglyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthr515520525alaproproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproala530535540proglyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproasp545550555560thrargproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthr565570575seralaproaspthrargproalaproglyserthralaproproala580585590hisglyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthr595600605alaproproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproala610615620proglyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproasp625630635640thrargproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthr645650655seralaproaspthrargproalaproglyserthralaproproala660665670hisglyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthr675680685alaproproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproala690695700proglyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproasp705710715720thrargproa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