一株分离的用于促进口腔健康的副干酪乳杆菌PC-01及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株分离的用于促进口腔健康的副干酪乳杆菌PC-01及其应用。

背景技术：

口腔是一个多菌群共生的动态平衡微生物环境，在口腔定植的微生物种类复杂，包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等，这些微生物在口腔不同部位共栖竞争和拮抗，构成口腔微生态系。目前研究证实，口腔内已知细菌种类多达700余种，口腔中微生物之间、微生物与宿主口腔组织之间，只有保持良好的生态平衡，口腔才能保持健康状态。如果外来微生物或由于其他因素影响，导致口腔微生态中固有的个别或几种微生物比例明显增高成为定植部位的优势菌，特别是致病菌的比例增高，那么，原有的口腔微生态平衡被打破，将会出现菌群失调，导致口腔疾病，反之，口腔疾病也可以导致菌群失调。因此，宿主口腔的微生态状况与口腔的健康和疾病有着密切关系。正是因为这些不同种类的细菌保持一定比例存在，才使得外界细菌一旦入侵就被消灭，口腔以及全身才得以保持健康。

口腔疾病包括龋齿、牙周病、口腔粘膜病以及老年和孕妇口腔健康疾病，其中，龋齿、牙周疾病和口腔粘膜病都与口腔内微环境有关。牙周的炎性病症有牙龈炎和牙周炎，其发病机理与微生物有密切关系，主要由牙菌斑的形成诱发，具体地，定植细菌借助于食物残渣以及唾液组分的存在而在牙齿表面上形成生物膜，如果在早期阶段没有将所述生物膜及时充分清除的话，则在牙齿表面形成上的生物膜会导致沉积牙石，其非常难以去除。如果龈缘处存在数目升高的细菌导致牙龈发炎，称之为牙龈炎。在易感性个体中，牙龈炎可能发展为牙周炎，甚至导致失牙，特别地，存在于革兰氏阴性细菌中的脂多糖(LPS)可以通过LPS刺激的巨噬细胞而引起非特异性免疫应答，其在受影响组织中释放前列腺素E2(prostaglandin E2，PEG2)以及例如白介素和TNF-α的促炎介质。其中，促炎介质诱导从驻留的成纤维细胞释放更多PGE2和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，其破坏周围组织的细胞外基质。这允许细菌更深地渗透到组织中并且促进炎性过程，而不依赖于上皮和牙根的外层，从而促使形成牙周袋，支撑牙齿的牙槽骨在进展的细菌前面收缩，导致牙齿变得不稳定，并且，如果不进行治疗的话，则会失牙。

现有技术存在一些用于改善上述问题的方法，例如，用机械去除斑块和牙石，使用具有强抗菌性能的口腔护理产品。但是，上述传统方法对于口腔环境的破坏很严重，不能在短时间内恢复其原有的平衡。而且，如果盲目消灭口腔内细菌，会打破正常口腔微环境菌群的平衡，对口腔以及全身健康都是有损害的。这就要求在预防或者治疗口腔内常见炎症性疾病时，需要保护口腔内的固有菌群平衡，也就是要保护口腔内的原生态。

技术实现要素：

本申请的目的之一在于提供一株从西藏拉萨地区当雄县龙仁乡的酸牦牛乳中分离得到的副干酪乳杆菌菌株。

本申请的目的之二在于将所述副干酪乳杆菌菌株制备成菌剂用于改善口腔微生态平衡。

为达到上述目的，本申请是通过以下技术方案实现的：

本申请将采集到的酸牦牛乳通过消毒、接种、分离、纯化以及鉴定，最终分离得到了一株能够调整口腔微生态平衡的副干酪乳杆菌PC-01(Lactobacillus paracasei PC-01)，本申请将该菌株提交专利认可的机构进行保藏，保藏时间为2019年3月18日，其微生物保藏编号为CGMCC No.17537，分类命名为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本申请所分离的副干酪乳杆菌菌株Lactobacillus paracasei PC-01能够改善口腔健康菌群失衡，并且具有较好酸耐受性和胆盐耐受性的益生菌，具备益生特点。

在本申请中，所述副干酪乳杆菌菌株可以直接用作改善口腔微生态环境制剂，或者以所述副干酪乳杆菌菌株为原料制备用作口腔中病理状态微生物拮抗剂，其中，所述病理状态微生物包括变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、栖牙普雷沃氏菌和具核梭杆菌中的至少一种。

在一种可实现的方式中，所述拮抗剂为固体、液体或气体剂型。

可选地，所述拮抗剂包括散剂、片剂、薄膜制剂、溶液剂、气雾剂、颗粒剂、锭剂、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂、液体剂、酏剂、浸膏、酊剂或流浸膏形式或者呈特别适于口服给予的剂型。

本申请的另一目的在于提供一种利用前述副干酪乳杆菌菌株PC-01制备口腔微生态环境改善剂的方法，所述方法包括：将所述活性或者已灭活副干酪乳杆菌菌株PC-01直接与其余填充物混合。

在本申请中，对所述副干酪乳杆菌菌株PC-01灭活的方法可以为在70℃至100℃的温度下，对步骤步骤2所得的材料孵育使其热灭活，例如，可以在所述温度下孵育2至8分钟。

与现有技术相比，本申请提供的副干酪乳杆菌PC-01，不论是活性菌株还是其灭活菌株均表现出多种有利于口腔健康的特征，特别的，所述菌株不仅对口腔病原菌有良好的拮抗作用，而且还在口腔环境下具有良好的增殖能力，从而具有调整口腔微生态环境的作用，表现为调整口腔内菌群平衡、清洁口腔以及改善口气等。

附图说明

图1示出Lactobacillus paracasei PC-01活菌在MRS琼脂培养基37℃，厌氧环境下培养72h，菌落生长情况；

图2示出Lactobacillus paracasei PC-01的电镜照片；

图3示出活性益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、活性Streptococcus salivarius K12菌以及活性Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌S.mutans的抑制率；

图4示出活性益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、活性Streptococcus salivarius K12菌以及活性Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌P.gingivalis的抑制率；

图5示出活性益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、活性Streptococcus salivarius K12菌以及活性Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌F.nucleatum的抑制率；

图6示出活性益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、活性Streptococcus salivarius K12菌以及活性Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌A.actinomycetemcomitans的抑制率；

图7示出灭活益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、灭活Streptococcus salivarius K12菌以及灭活Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌S.mutans的抑制率；

图8示出灭活益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、灭活Streptococcus salivarius K12菌以及灭活Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌P.gingivalis的抑制率；

图9示出灭活益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、灭活Streptococcus salivarius K12菌以及灭活Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌F.nucleatum的抑制率；

图10示出灭活益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、灭活Streptococcus salivarius K12菌以及灭活Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌A.actinomycetemcomitans的抑制率；

图11示出益生菌Lactobacillus paracasei PC-01针对口腔条件的存活能力的结果；

图12示出摄入Lactobacillus paracasei PC-01活菌三天后志愿者口腔口气变化情况；

图13示出摄入Streptococcus salivarius K12活菌三天后志愿者口腔口气变化情况；

图14示出摄入Lactobacillus reuteri ATCC55730活菌三天后志愿者口腔口气变化情况。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本申请作进一步说明，以下实施例仅为说明性的，本申请并不受这些实例的限制。

首先对本申请涉及的益生菌做以简单的介绍：益生菌(Probiotics)是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能够产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥对肠道有益作用的活性有益微生物的总称。大量研究证明，适量摄入益生菌还具有提高机体免疫力、促进机体营养成分产生和代谢、保护心血管、抗肿瘤和抗衰老和抗肿瘤等作用。

副干酪乳杆菌是常见的益生菌，可定植于人体肠道，能够改善肠道菌群结构，调节肠道内微生态环境。副干酪乳杆菌进入人体肠道后会产生对致病菌和腐败菌等有害微生物有抑制作用的代谢产物：有机酸、过氧化氢、细菌素等，起到调节肠道菌群平衡，从而促进人体消化和吸收的作用。目前，尚未有副干酪乳杆菌对口腔微生态环境作用的研究。

实施例

实施例1菌体生长形态及电镜照片

(一)菌株活化

1.副干酪乳杆菌PC-01活菌的培养

将于-80℃保存的保存有副干酪乳杆菌PC-01的冻存管在MRS液体培养基(121℃下15min灭菌)中于37℃中富集生长18h后(对数生长期)，按照2％V/V重新转至灭菌MRS培养基中，最后采用MRS琼脂平板计数法统计其活菌数，并离心收集微生物菌体待用(对数生长期)。

2.副干酪乳杆菌PC-01灭活菌的制备

在85℃温度下孵育由前述1培养而得的活菌3min，获得灭活的副干酪乳杆菌PC-01。

(二)菌体生长形态及电镜照片

将(一)制得的Lactobacillus paracasei PC-01活菌在MRS琼脂培养基37℃，厌氧环境下培养72h，菌落生长情况如图1所示，电镜照片如图2所示。

实验例2 Lactobacillus paracasei PC-01的抑菌实验

(一)病原菌活化

变形链球菌(S.mutans)：先于5mL Tryptic soy Broth培养液中37℃好氧培养，以150rpm震荡培养20小时；

牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)：先于5mL Tryptic soy Broth培养液中37℃厌氧培养，以150rpm震荡培养4天；

具核酸杆菌(F.nucleatum)：先于5mL Brain-heart infusion medium Broth培养液中37℃厌氧培养，以150rpm震荡培养4天；

伴放线杆菌组(A.actinomycetemcomitans)组：先于5mL Brain-heart infusion medium Broth培养液中37℃厌氧培养，以150rpm震荡培养20小时。

(二)共培养实验

以Lactobacillus paracasei PC-01的活菌以及灭活菌为实验组，以商业口腔益生菌菌株Streptococcus salivarius K12活菌和灭活菌以及Lactobacillus reuteri ATCC55730的活菌和灭活菌为对照组，分别与本实验例(一)中活化的病原菌共培养，进行对比实验。

1.实验方法：

(1)制备有效浓度的病原菌菌液

将本实验例(一)活化后的病原菌用培养液配制成病原菌菌液，用于培养各病原菌的培养液如表1所示，各病原菌菌液中病原菌的浓度如表2所示。

各病原菌菌液的制备方法为：将试验菌株在洁净环境下接入经121℃、5min环境下灭菌的对应培养基中，在本实施例中，每种病原菌菌液制备5mL×3份。

表1各病原菌所用培养液

表2各病原菌菌液的浓度

(2)共培养方法：

1)灭活菌组：向各病原菌菌液中分别加入1.00×10⁹CFU含量的Lactobacillus paracasei PC-01、Streptococcus salivarius K12和Lactobacillus reuteri ATCC55730，均在85℃温度下孵育相应活菌3min，形成12份培养样品。

2)活菌组：向各病原菌培养基中分别加入3.00×10⁹CFU的Lactobacillus paracasei PC-01、、Streptococcus salivarius K12和Lactobacillus reuteri ATCC55730活菌，形成另外12份培养样品。

共培养的具体条件为：37℃厌氧环境中并以150rpm震荡培养。

(三)抑菌试验

1.在预设时间点对共培养的样品取样检测活菌数

(1)对于S.mutans病原菌菌液采样时间：2h、4h、6h、8h和48h；

(2)对于A.actinomycetemcomitans病原菌菌液采样时间：2h、4h、6h、8h和48h；

(3)对于P.gingivalis病原菌菌液采样时间：2h、4h、6h、8h、24h、48h、72h和96h；

(4)对于F.nucleatum病原菌菌液采样时间：2h、4h、6h、8h、24h、48h、72h和96h。

2.存活菌数计算

病原菌采样后，进行序列稀释涂盘，选择3种稀释浓度，分别为：10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍稀释。

(1)S.mutans组：共培养结束后取样并以Tryptic soy Agar(TS Agar)涂盘计数菌数，分别在放置37℃培养箱继续好氧培养(48±0.5)h，统计菌落数；

(2)P.gingivalis组：共培养结束后取样并以Tryptic soy+5％sheep blood Agar(TS Agar)涂平板，分别在放置37℃培养箱继续好氧培养(96±1)h，统计菌落数；

(3)F.nucleatum组：共培养结束后取样并以Tryptic soy+5％sheep blood Agar(TS Agar)涂盘计数菌数，分别在放置37℃培养箱继续好氧培养(96±1)h，统计菌落数；

(4)A.actinomycetemcomitans组：共培养结束后取样并以Tryptic soy+5％sheep blood Agar(TS Agar)涂盘计数菌数；分别在放置37℃培养箱继续好氧培养(48±0.5)h，统计菌落数；

(5)空白对照组(不添加待测样品，添加无菌水0.05g替代为空白对照)。

以空白对照组作为基准计算抑菌率，抑菌率可以根据下式I进行计算：

抑菌率＝(对照组菌数－实验组菌数)/对照组菌数×100％ 式I

3.实验结果：

如图3至图10所示：

图3示出活性益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、活性Streptococcus salivarius K12菌以及活性Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌S.mutans的抑制率；

图4示出活性益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、活性Streptococcus salivarius K12菌以及活性Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌P.gingivalis的抑制率；

图5示出活性益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、活性Streptococcus salivarius K12菌以及活性Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌F.nucleatum的抑制率；

图6示出活性益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、活性Streptococcus salivarius K12菌以及活性Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌A.actinomycetemcomitans的抑制率；

图7示出灭活益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、灭活Streptococcus salivarius K12菌以及灭活Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌S.mutans的抑制率；

图8示出灭活益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、灭活Streptococcus salivarius K12菌以及灭活Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌P.gingivalis的抑制率；

图9示出灭活益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、灭活Streptococcus salivarius K12菌以及灭活Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌F.nucleatum的抑制率；

图10示出灭活益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、灭活Streptococcus salivarius K12菌以及灭活Lactobacillus reuteri ATCC55730菌对口腔病原菌A.actinomycetemcomitans的抑制率。

由图3-6可知，三种活性益生菌与病原菌共培养的培养液在一定时间内口腔病原菌均有显著下降，其中，Lactobacillus paracasei PC-01组在48h内对四种病原菌S.mutans、P.gingivalis、F.nucleatum和A.actinomycetemcomitans的抑制作用相比其他两组商业对照菌最为显著，48h时病原菌存活率分别是10％、12％、47％和18％，显著低于对照组。

由图7-10可知，三种灭活益生菌与病原菌共培养的的培养液在一定时间内口腔病原菌均有显著下降，48h存活率分别是15％、11％、42％和12％，显著低于对照组。

综合图3-10可知，活性益生菌Lactobacillus paracasei PC-01、灭活益生菌Lactobacillus paracasei PC-01在口腔致病菌的抑制率与两种商用对照组相比均表现出更好的抑制能力。

综上所述，无论活性Lactobacillus paracasei PC-01或灭活Lactobacillus paracasei PC-01都对口腔病原菌具有较好的抑制作用，且效果明显好于两种商业对照组。

实验例3 Lactobacillus paracasei PC-01对口腔微生态环境的作用

(一)凝聚能力测定

本实施例中，以Lactobacillus paracasei PC-01为实验组，以商业口腔益生菌菌株Streptococcus salivarius K12和Lactobacillus reuteri ATCC55730为对照组进行对比实验。

1.实验方法：

通过监测过夜的共培养液体在620nm处光密度的减少来评价，所述在620nm处光密度的减少因聚集物和沉淀的形成所致，光密度减少表明所选专利益生菌对口腔致病菌减少积极作用。

利用以下公式II获得聚集能力百分比(％AC)值：

％AC＝{1-(ODtf/ODt0)}100 式II

其中，ODtf和ODt0分别表示最终时刻的光密度和初始时刻的光密度。

调整初始时刻的OD值，以使所有培养物含有等量的CFU/ml，即含有相等浓度的活菌数。

本实施例表明益生菌Lactobacillus paracasei PC-01具有良好的凝聚性，本发明人认为所述益生菌Lactobacillus paracasei PC-01具有良好的凝聚性的机理是所述菌株通过干扰口腔病原体生物膜的形成，去抑制或减少牙菌斑，最终达到促进口腔持久健康的目的。反映到实际中，本申请提供的益生菌Lactobacillus paracasei PC-01对口腔健康的作用之一就是它对引起口腔异味问题的主要有害菌具有包裹凝聚的作用。在刷牙过程或经口腔接触菌体后，有害菌会被包裹凝聚，被清除出口腔，从而维促进口腔菌群平衡，维护口气清新。

优选的，选择对应培养液，在37℃含有5％CO2的环境中对所述益生菌Lactobacillus paracasei PC-01进行培养48h，结果如表3和表4所示：

表3.在含有口腔病原菌的培养液中添加活性微生物的能聚能力对比

表4.在培养液中添加灭活微生物的能聚能力对比

由表3和表4可知：无论是活性微生物或灭活微生物都有显著的形成凝聚物的能力，其中Lactobacillus paracasei PC-01组在活性微生物和灭活微生物添加上均显著高于商业对照组。

(二)调整口腔菌群平衡效果的测定

1.产生恶臭挥发性化合物的评价方法：通过感官评价的方法，评价当生长在类似于人饮食的模拟培养基中时所产生的恶臭挥发性化合物。一般的，在48h期间，于37℃和5％CO2下使菌株生长在含有大豆分离蛋白(0.5％w/v)葡萄糖(0.5％w/v)、果糖(0.5％w/v)、酵母提取物(1％w/v)、肉浸膏(1％w/v)、真核细胞(200个细胞/ml)和果胶(0.5％w/v)的培养基中。

2.评价方法：通过经过有过专业培训的、对气味敏感的人员进行评价，所述菌株得到介于1-5之间的恶臭值评价分数，其中1-5的分值代表为较好到较差气味。

3.实验结果：

一般的，口腔益生菌在常规培养液中是没有让人不愉快的气味产生的。经口摄入后，当所述益生菌Lactobacillus paracasei PC-01与食物等接触时，也不产生让人不愉快的气味是其理想状态。本实验模拟在类似于人饮食的培养基中时，结果如表5所示:本申请的菌株未产生不良气味。

表5.不同菌株在同等条件下恶臭值产生情况

(三)针对口腔条件的存活测定

现代医学和病理学研究，越来越多的通过拮抗涉及口腔中病理状态的微生物，例如变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、栖牙普雷沃氏菌和具核梭杆菌，从微生物改变口腔微环境的思路上出发，进行口腔疾病的治疗，从而促进口腔健康。

1.针对口腔条件的存活评价方法：

通过使其经受模拟口腔溶液条件来研究菌株在口腔中的存活。

将模拟的口腔溶液于37℃和5％CO2下孵育0、2、6、8和24小时，此时间设计来源于正常人体摄入食物间隔。

通过测定620nm处的光密度来定量细菌生长情况获得细菌生长值。所选口腔健康病原菌是占有80％以上的病原菌集合培养液，所述测试菌种准备工作：将变形链球菌(S.mutans)、牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)、具核梭杆菌(F.nucleatum)、中间普雷沃菌(P.intermedia)、牙周蜈蚣菌(C.periodontii)、齿垢密螺旋体(T.denticola)、放线共生放线杆菌(A.actinomycetemcomitans)和栖牙普雷沃氏菌(P.disiens)8种口腔健康问题指示菌的标准菌株溶于装有10mL BHI液体培养基的离心管中，挣松管盖，使细菌与箱内厌氧环境充分接触，在37℃下厌氧培养12-24h，获得8种标准菌株的增菌液，活菌数约为5×10⁷CFU/mL。每种细菌分别取10mL加入90ML的改良人工唾液中备用。

人工唾液配方为改良生物膜培养基BM-5，具体地，所述培养基可以包括：猪胃黏蛋白2.5g/L；肽胨2g/L；胰酶分解酪蛋白胳1g/L；酵母提取物1g/L；氯化钾(KCL)2.5g/L；葡萄糖0.5g/L；胱氨酸盐酸盐0.1g/L；氯化血红素1mg/L；磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)0.114g/L；磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g/L。

向上述组分中加入10g/L庶糖，用1mol/L NaOH溶液调整其pH值7.50±0.01，121℃高压灭菌15min消毒备用。

本实验设计分组为Lactobacillus paracasei PC-01组(实验组)、商业对照组Streptococcus salivarius K12(对照组1)和Lactobacillus reuteri ATCC55730(对照组2)，三个实验组益生菌一次给量为3×10⁸CFU/mL。三种益生菌的活菌数计数采用琼脂平板计数法进行，37℃厌氧环境下72h。

2.实验结果：

针对口腔条件的存活能力反映所述益生菌Lactobacillus paracasei PC-01的另外一个主要特征。

针对口腔条件的存活能力的结果如图9可知，由图9所示，在口腔环境下三种益生菌均表现出了很好的生长性能。在24h结束后，本申请涉及的益生菌Lactobacillus paracasei PC-01具有更高的活菌数，表明相比其他两种商业口腔益生菌，益生菌Lactobacillus paracasei PC-01更适合在口腔环境下存活。

(四)改善口气效果的测定

1.祛除口臭人体测试

(1)测试对象：在评价恶臭挥发性化合物的产生的基础上，进行祛除口臭人体测试。其中志愿者：82名，20-45岁，均有自觉或他觉的口臭症状。

(2)组别：

1)空白对照组：0.85％生理盐水，志愿者人数为20人，；

2)实验组：Lactobacillus paracasei PC-01组；

3)对照组1：Streptococcus salivarius K12；

4)对照组2：Lactobacillus reuteri ATCC55730，

其中，实验组、对照组1和对照组2每组的志愿者人数为22人；添加3×10⁸CFU的益生菌溶解于生理盐水。

2.测试方法：测试周期为3d，每次漱口时间为3min，每日一次(每日早晨7：30)，分别在漱口前、后检测、8h和12h进行检测；采用便携式气相色谱仪OralChroma检测志愿者口腔中致口腔异味的主要挥发性硫化合物VSC浓度(主要成分是是硫化氢，甲基硫醇和二甲基硫)。

3.实验结果如图12-14所示：

图12示出摄入Lactobacillus paracasei PC-01活菌三天后志愿者口腔口气变化情况；

图13示出摄入Streptococcus salivarius K12活菌三天后志愿者口腔口气变化情况；

图14示出摄入Lactobacillus reuteri ATCC55730活菌三天后志愿者口腔口气变化情况。

由图12至图14可知，与对照组1和对照组2相比，使用Lactobacillus paracasei PC-01漱口后的三天，对三种硫化物的祛除作用显著高于对照组1和对照组2，这表明Lactobacillus paracasei PC-01可去除引起口臭的主要成分挥发性硫化合物，规律使用用一定时间可达到驱除口臭的目的。

实验例4抗生素敏感性实验

抗生素是应用于人类生活中的各个方面，在保障人体健康，延长人类寿命方面发挥着重要的作用。但是抗生素耐药性是随之引发的问题之一，本实验就Lactobacillus paracasei PC-01进行耐药性分析。

1.实验方法：

本申请所述的抗生素敏感性实验方法依据欧洲食品安全局(EFSA)给出的技术指导，证明涉及的申请专利菌株Lactobacillus paracasei PC-01的抗生素敏感性，用于所述菌株的培养条件如下：于37℃厌氧培养下，在含有EFSA推荐的抗生素浓度的MRS琼脂平板中生长(72±2)h，记录菌落数量。

2.实验结果如表6所示：

表6.Lactobacillus paracasei PC-01对常见抗生素耐药性生长情况

由表6可知，益生菌Lactobacillus paracasei PC-01没有抗生素耐药性。

通过上述实验可知，本申请提供的副干酪乳杆菌PC-01，无论是活菌还是灭活菌均具有促进口腔健康，调整口腔菌群平衡的作用。而且，所述副干酪乳杆菌PC-01的活菌或灭活菌体具有多种相同或者相似的生理功能，而且，灭活的副干酪乳杆菌PC-01不受抗生素影响，在口腔中含活菌量不会发生变化，品质稳定性更高。

进一步地，本申请人认为，灭活的副干酪乳杆菌PC-01对抗病原微生物的能力主要源于两方面：一是有效增强机体的免疫力；二是靠灭活后细胞表面暴露更多的吸附位点，可以吸附在机体粘膜表面实现对病原菌的竞争性排斥。本申请人还发现，灭活的副干酪乳杆菌PC-01，其细胞提取物具有还原能力及SOD酶活性，能够清除活性氧自由基从而起到抗氧化的作用，与活性副干酪乳杆菌PC-01可达到同样的作用效果，本申请也进行了大量的活性和灭活益生菌对比试验，结果显示两者效果均可。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。