特基拉芽孢杆菌及其在荒漠化防治中的应用和方法与流程

本发明涉及荒漠化防治技术领域，具体而言，涉及特基拉芽孢杆菌及其在荒漠化防治中的应用和方法。

背景技术：

如何提升防沙治沙技术水平和治理成效是当前人类与沙害斗争的重要技术难题之一。与传统的物理固沙、化学固沙和植被培植固沙技术相比，微生物固沙作为一种新型固沙技术，具有环保性强、适应性强、成本低、见效快、易操作等优势，被国际上公认为是未来最有发展潜力的一种固沙措施。然而，目前关于微生物固沙技术的研发仍处于探索阶段，已有的相关技术研发多是针对藻类微生物在固沙工程中的尝试，初步证实了微生物固沙技术在促进沙丘地表固定、改善土壤理化性状和增强土壤抗风蚀水蚀等方面的积极意义。

特基拉芽孢杆菌作为芽孢杆菌属的新菌株，具有适应性强、易于生产加工等优势特征。目前，关于该菌株的研发主要集中在其抗菌特性上，如专利CN 108998394 A，CN 108285875 A，CN 106282049 A，CN 105733986 A，CN 105695368 A和CN 105274021 A。另外，还有对其产胞外酶(CN 102719379 A)，产表面活性剂(CN 104862252 B)以及促进植物生长(CN 109097302 A)的相关研发。

然而，特基拉芽孢杆菌作为一种具有多种优良特性和广泛应用前景的微生物，目前在防沙固沙中的应用还未有报道。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的特基拉芽孢杆菌株。该菌株具有较高的产胞外多糖能力，该菌株能够固定沙粒区表面，具有优异的固沙能力，可以将其用于到荒漠化地区进行防沙固沙。

本发明的另一目的在于提供上述的特基拉芽孢杆菌在荒漠化防治中的应用。

本发明的另一目的在于提供对荒漠化进行防治的方法。

本发明的另一目的在于提供一种微生物制剂。

本发明的另一目的在于提供鉴定上述特基拉芽孢杆菌的方法。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种特基拉芽孢杆菌，其具有SEQ ID NO.1所示的16S rDNA序列。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述特基拉芽孢杆菌在培养期内产胞外多糖量等于或高于15.61g/L。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述培养期的培养时长不高于12h。

培养期内产胞外多糖量指菌株在培养基上在培养条件下培养12h的胞外多糖产量。

培养基为：工业葡萄糖27.25g/L,工业酵母提取物15.90g/L，MgSO4·7H2O 5.61g/L，蒸馏水1000mL，pH 8.5-8.7；培养条件为：31℃，搅拌速度230rpm，接种量3％，培养时间12h。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述特基拉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC NO.17603。

该菌于2019年4月19日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，分类学命名为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)，保藏编号为CGMCC NO.17603。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述特基拉芽孢杆菌在LB培养基具有如下形态：菌落扁平或隆起，粘稠。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述特基拉芽孢杆菌为革兰氏阳性菌。

第二方面，本发明提供了上述的特基拉芽孢杆菌在荒漠化防治中的应用。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述应用包括：将经所述特基拉芽孢杆菌发酵培养得到的发酵培养液喷洒于目标固沙区域的表面。

第三方面，本发明提供了一种对荒漠化地区进行固沙的方法，其包括：将上述的特基拉芽孢杆菌施用于目标固沙区域。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，将含有所述特基拉芽孢杆菌的液体喷洒于目标固沙区域的表面。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述液体为特基拉芽孢杆菌的培养液。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述特基拉芽孢杆菌施用量为10⁹-10¹¹CFU/m²；

优选的，所述特基拉芽孢杆菌施用量为10¹⁰CFU/m²。

第四方面，本发明提供了一种鉴定上述的特基拉芽孢杆菌的方法，其包括：将待鉴定菌株的16S rDNA序列与参考序列比较，若比较结果显示待鉴定菌株的16S rDNA序列与参考序列一致，则提示待鉴定菌株为所述特基拉芽孢杆菌，所述参考序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，使用引物对扩增待鉴定菌株的16S rDNA序列；该引物对的上游引物(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)如SEQ ID NO.2所示，下游引物(1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)如SEQ ID NO.3所示。

第五方面，本发明提供了一种用于荒漠化地区固沙的微生物制剂，其含有上述的特基拉芽孢杆菌；

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述特基拉芽孢杆菌的活菌为10⁷-10¹⁰CFU/mL。

本发明具有以下有益效果：

本发明从腾格里沙漠沙坡头人工固沙植被区的生物土壤结皮中分离出一种新的菌株，经检测其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，为一种新的特基拉芽孢杆菌株。本发明首次发现，该菌株具有较高的产胞外多糖能力，该菌株能够使沙粒区表面结皮，固定沙粒，具有优异的固沙能力，可以将其用于到沙漠地区进行防沙固沙。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中的特基拉芽孢杆菌B6菌株在培养基上的菌落形态照片图。

图2为本发明实施例1中的采用特基拉芽孢杆菌B6菌株的16S rDNA序列所作的进化树结果。

图3为本发明实施例2中的培养皿中的沙粒在施用特基拉芽孢杆菌B6菌株前后的结构；图中：a为施用前，b为施用后。

图4为本发明实施例2中的将特基拉芽孢杆菌B6菌株施用到腾格里沙漠东南缘沙坡头地区的前后对比图；a为施用前，b为施用后。

图5为B6菌株的胞外多糖产量检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

特基拉芽孢杆菌的分离与鉴定

(1)样品采集：

2018年6月29日采集腾格里沙漠沙坡头人工固沙植被区的生物土壤结皮。

(2)培养基配方：

LB培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2；

LB-苯胺蓝选择性平板的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉18-20g/L，水溶苯胺蓝5g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2；

优化培养基配方为：工业葡萄糖27.25g/L,工业酵母提取物15.90g/L，MgSO4·7H2O 5.61g/L，蒸馏水1000mL，pH 8.5-8.7；

(3)培养条件：

一般培养条件为：28℃，搅拌速度180rpm，接种量1％，培养时间24h；

优化培养条件为：31℃，搅拌速度230rpm，接种量3％，培养时间12h；

(4)菌种初筛：

准确称取1g生物土壤结皮样品添加到9mL无菌生理盐水中，涡旋仪充分混匀；80℃水浴10min除去非芽孢细菌体；按照1％的接种量接种于LB培养基中，一般培养条件下摇床培养48h后于LB-苯胺蓝选择性平板上进行稀释涂布；挑取呈蓝色的菌落进行划线纯化，编号保存。

(5)菌种复筛：

将候选菌株接种到LB培养基中，一般培养条件下摇床培养24h；取3mL发酵液加入到离心管中，10000rpm，4℃离心20min收集上清液；将2mL的上清液中添加6mL 95％的冰乙醇，剧烈震摇至絮状沉淀后放置于4℃冰箱中过夜；10000rpm，4℃离心5min收集沉淀，将沉淀使用75％的乙醇洗涤三次；室温下晾干，加入2mL无菌水制成粗多糖溶液；通过苯酚-硫酸法对以上粗多糖溶液进行测量，其中，结果如图5所示，编号为B6菌株的胞外多糖产量显著的高于其他菌株(P<0.05)。

(6)菌种优化培养：

将B6菌株的种子液按照1％接种量，在一般培养条件下摇床培养24h，其生物量为9.62×10⁷CFU/mL，多糖产量为8.01g/L。将B6菌株的种子液按照3％接种量，在优化培养条件下摇床培养12h，其生物量较优化前提高为2.33×10⁹CFU/mL，多糖产量提高至15.61g/L。尤其需要注意的是，该B6菌株是目前对产胞外多糖菌株记录中产糖量较高的一个新菌株。

(7)菌种鉴定：

a)形态观察：

使用接种环挑取少量B6菌体制作涂片，并进行革兰氏染色和芽孢染色，观察其为革兰氏阳性的芽孢杆菌；其生长在LB培养基上，菌落扁平或隆起，粘稠(参见附图1)。

b)分子生物学鉴定：

使用索莱宝细菌DNA提取试剂盒对B6的DNA进行提取，使用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SEQ ID No.2)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，SEQ ID No.3)。扩增16S rDNA基因片段，其PCR扩增体系(20μL)：5μL 2×Taq PCR Master Mix，1μL模版DNA，1μL上游引物，1μL下游引物，12μL ddH2O；PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min(35cycles)；72℃最终延伸10min。将PCR产物进行测序，其序列如SEQ ID No.1所示。将测得基因序列提交到NCBI数据库进行比对，发现与其亲缘关系最近的是特基拉芽孢杆菌52-LR1-2(MF077125.1)，相似度为99％(参见附图2)。表明B6菌株具有独立的分类学地位，是一种新的菌株。

该B6菌株于2019年4月19日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，分类学命名为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)，保藏编号为CGMCC NO.17603。

实施例2

特基拉芽孢杆菌的固沙效果

(1)将实施例1的特基拉芽孢杆菌B6菌株(即CGMCC NO.17603)接种到LB培养基中，一般培养条件下培养12h作为种子液，备用。

(2)将上述种子液按照3％的接种量接种到优化培养基中，在优化培养条件下培养12h作为发酵液，备用。

(3)通过稀释涂布法准确测得特基拉芽孢杆菌B6发酵液中细胞数量为2.79×10⁹CFU/mL，将发酵液稀释至1.0×10⁷CFU/mL，备用。

(4)将10mL上述稀释液均匀喷洒到装有沙粒的培养皿(内径为10cm，沙粒厚度为6mm)中，经过10天培养，沙粒完全粘连，形成结皮的厚度为6mm左右(参见附图3)。图3-a显示了未施用特基拉芽孢杆菌B6菌株的沙粒流动效果，图3-b显示了施用特基拉芽孢杆菌B6菌株后的沙粒不再流动，被固定。

(5)将上述稀释液按照1.0×10¹⁰CFU/m²(即稀释液1L/m²)均匀喷洒到腾格里沙漠东南缘沙坡头地区，自然状态下培养半年时间，结果显示，该区域行成约5cm厚的结皮，并保持稳定状态(参见附图4)。图4-a显示了野外布置实验的样地图片，图4-b显示了施用特基拉芽孢杆菌B6菌株半年后从中采样得到的结皮图片。由此说明，本发明实施例提供的特基拉芽孢杆菌B6菌株可以用于到荒漠化地区防治该地区的荒漠化程度。

综上，本发明提供的特基拉芽孢杆菌具有如下优点：

1、本发明所提供的特基拉芽孢杆菌B6菌株为沙漠地区筛选而得，当其应用于沙区表面后能够快速适应环境而进行大规模的生长繁殖，且不会破坏沙区的微生物群落结构，有利于实现快速防沙治沙的目的。

2、本发明提供的特基拉芽孢杆菌B6菌株是目前对产胞外多糖菌株记录中产糖量最高的一个新菌株；在12h的培养期内其生物量高达2.79×10⁹CFU/mL，产糖量高达15.61g/L。

3、本发明所提供的特基拉芽孢杆菌B6菌株为芽孢杆菌属新菌株，该微生物属已被证实为陆地生态系统的共有优势属，因此，该菌株具有普遍适用性。

4、本发明的特基拉芽孢杆菌B6菌株可辅助传统固沙技术(草方格治沙、植物培植固沙等)和新型固沙技术(藻类微生物固沙等)的使用，大大缩短实现防沙治沙所需时间，更好的实现防沙治沙的效果。

5、本发明的防沙固沙方法简单易行、操作方便、成本低廉、见效迅速、环保性强，具有大规模推广和应用前景。

6、本发明所提供的特基拉芽孢杆菌B6菌株，不仅可以用于防沙固沙，还可以广泛应用于生态学、生物学、农业科学等相关学科领域的微生物应用或相关科学研究领域。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所、宁夏回族自治区草原工作站（宁夏回族自治区草原监理中心）

<120> 特基拉芽孢杆菌及其在荒漠化防治中的应用和方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1452

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcaaatgcg ggagctataa tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt 60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 120

gaaaccgggg ctaataccgg atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc 180

ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240

accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360

cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa 420

gaacaagtac cgttcgaata gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 540

cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 600

agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 660

cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta 720

actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 840

cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960

gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag 1020

gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080

gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1140

aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200

acgtgctaca atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa 1260

atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt 1320

aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380

caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac ctttaggagc cagccgccga 1440

agtgacagat tt 1452

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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