具有酵母菌抑制作用的发酵乳杆菌CQPC08及其在制备泡菜中的应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，涉及一种乳酸菌及其在制备食品中的应用。

背景技术：

在泡菜发酵过程中除了优势的乳酸菌外，还可能存在霉菌、酵母菌等其它微生物，其中酵母菌大量生长繁殖会造成泡菜发酵过程中或储存过程中泡菜水表面出现白色团状菌斑，俗称“生花”。如果不处理或处理不及时，就会导致泡菜品质变差，甚至变质不能食用。传统的解决方法是在泡菜发酵过程中和储存过程中人工去除或添加少量物质如酒、大蒜等去除，不仅耗费大量人力且不易控制产品质量，在杀灭杂菌的同时，对泡菜乳酸菌也有一定的抑制和伤害。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有酵母菌抑制作用的乳酸菌，以及其在制备发酵过程中不生花的泡菜中的应用及方法，可以为泡菜的工业化生产和质量控制提供优良的发酵菌种，可以提高泡菜生产效率，减少生产成本，同时提升泡菜品质。

经研究，本发明提供如下技术方案：

发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）CQPC08，保藏编号为CGMCC No. 14957。

发酵乳杆菌CQPC08在抑制酵母菌方面的应用。

发酵乳杆菌CQPC08在制备发酵过程中不生花的泡菜中的应用。

运用发酵乳杆菌CQPC08制备发酵过程中不生花的泡菜的方法，包括以下步骤：将待发酵的新鲜蔬菜进行清洁和切分，加入食盐水溶液使其腌没待发酵蔬菜，接入发酵乳杆菌CQPC08，5-40℃发酵5-90h，即制得泡菜。

进一步，运用发酵乳杆菌CQPC08制备发酵过程中不生花的泡菜的方法，包括以下步骤：将待发酵的新鲜蔬菜进行清洁和切分，按料液比为1:1加入质量百分浓度为7%的食盐水溶液，按1.0%或2.0%的接种量接入发酵乳杆菌CQPC08，25℃发酵72h，即制得泡菜。

进一步，所述泡菜为泡萝卜。

本发明的发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）CQPC08分离自农家自然发酵泡菜水，于2017年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No. 14957。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种具有酵母菌抑制作用的发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）CQPC08，还提供了发酵乳杆菌CQPC08在制备发酵过程中不生花的泡菜中的应用及方法，可以为泡菜的工业化生产和质量控制提供优良的发酵菌种，可以提高泡菜生产效率，减少生产成本，同时提升泡菜品质。

附图说明

图1为酵母菌计数平板图，其中(a) 表示与发酵乳杆菌CQPC08共培养的毕赤酵母Z-5菌落数，(b) 表示毕赤酵母Z-5单独培养的菌落数。

图2为不同食盐浓度与不同乳酸菌接种量组合的泡萝卜图。

图3为不同食盐浓度与不同乳酸菌接种量组合发酵泡萝卜的感官评分结果。

图4为不同食盐浓度对泡萝卜水pH的影响，其中(a) 表示0.5%乳酸菌接种量下，不同食盐浓度对泡萝卜水pH的影响；(b) 表示1.0%乳酸菌接种量下，不同食盐浓度对泡萝卜水pH的影响；(c) 表示1.5%乳酸菌接种量下，不同食盐浓度对泡萝卜水pH的影响；(d) 表示2.0%乳酸菌接种量下，不同食盐浓度对泡萝卜水pH的影响。

图5为不同乳酸菌接种量对泡萝卜水pH的影响，其中(a) 表示4%食盐浓度下，不同乳酸菌接种量对泡萝卜水pH的影响；(b) 表示5%食盐浓度下，不同乳酸菌接种量对泡萝卜水pH的影响；(c) 表示6%食盐浓度下，不同乳酸菌接种量对泡萝卜水pH的影响；(d) 表示7%食盐浓度下，不同乳酸菌接种量对泡萝卜水pH的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、发酵乳杆菌CQPC08的分离与鉴定

1、实验材料

采自重庆市南岸区农家自然发酵泡菜水6份，分别吸取40mL泡菜水放入无菌离心管中，置于食品采样箱内，放于实验室4℃ 冰箱保存备用。

2、实验方法

1）乳酸菌的分离纯化

分别取1 mL泡菜水样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释至10^-6，再分别取10^-4、10^-5、10^-6 3个梯度的稀释液100 μL进行平板涂布，37℃培养24-48 h，观察并记录菌落形态。挑取平板上不同形态的菌落进行划线分离，经37℃培养48 h后，再次挑取平板上不同形态的单菌落进行划线分离，如此重复2至3次，直至得到形态一致的纯的单菌落。

2）乳酸菌的初步鉴定

挑取平板上的纯菌落接种于5 mL MRS液体培养基中，37℃培养24 h。取上述含菌培养基1 mL于无菌离心管中，4000 r/min离心10 min后弃去上层培养基，菌体沉淀重悬于无菌生理盐水并进行革兰氏染色镜检，革兰氏染色镜检为阳性的初步鉴定为乳酸菌。

3）乳酸菌DNA提取

将已纯化的疑似目标菌株接种于MRS肉汤中，37℃培养18-24 h后，采用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。提取的DNA放于-20℃冰柜保藏备用。

4）基因组DNA PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测

取提取的DNA，PCR扩增16S rDNA，其中上游引物27F（5'－AGAGTTTGATCCTG GCTCAG－3'，SEQ ID No.1）1 μL、下游引物1495R（5'－CTACGGCTACCTTGTTACGA－3'，SEQ ID No.2）1 μL、2 ×Taq plus Buffer 12.5 μL、模板DNA 1 μL，用无菌dd H2O 将体系补足至25 μL。以无菌超纯水替代模板DNA作为阴性对照。扩增条件为：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共29个循环；最后72℃延伸5 min。然后取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖浓度为1.5%，电泳条件为110 V，45 min。

3、实验结果

从6份自然发酵泡菜水样品中分离纯化出1株乳酸菌，命名为CQPC08。形态学观察结果显示，菌株CQPC08的菌落多为白色或乳白色，形状为圆形，边缘整齐，表面湿润光滑；其革兰氏染色呈现阳性，在100倍油镜下，菌株细胞形态有长杆、短杆，且不存在出芽生殖。将菌株CQPC08的16S rDNA 扩增产物委托北京擎科生物技术有限公司进行测序，所得序列使用NCBI中的BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）程序进行同源性比对分析，结果显示，菌株CQPC08为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）。

二、发酵乳杆菌CQPC08对酵母菌的抑制作用及其在制备泡菜中的应用

1、实验材料

发酵乳杆菌CQPC08，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.14957。

毕赤酵母Z-5，分离自市售泡萝卜商品，保存于重庆市功能性食品协同创新中心。

中秋红萝卜，购自农贸市场。

2、实验方法

1）发酵乳杆菌CQPC08对酵母菌的抑制作用研究

将活化好的乳酸菌即发酵乳杆菌CQPC08和酵母菌即毕赤酵母Z-5分别按照1%的接种量共同接种于无菌脱脂乳（12%）中，32℃培养12-24 h，同时以不接种乳酸菌只接种酵母菌作为对照。

将上述含菌脱脂乳进行10倍梯度稀释，分别取稀释度为10^-4、10^-5、10^-6的稀释液0.1 mL均匀涂布于PDA固体培养基表面，同时以不接种乳酸菌只接种酵母菌的含菌脱脂乳作为对照。每个稀释度做2个平行，然后于28℃培养2d后观察记录结果，按下述公式计算酵母菌抑制率。

酵母菌抑制率（%）= (C2-C1)/C2×100

其中：C2为酵母菌单独培养的酵母菌总数；C1为乳酸菌和酵母菌共培养的酵母菌总数。

2）乳酸菌菌种制备

取保存于-80℃的发酵乳杆菌CQPC08按2%的接种量接种于MRS肉汤中，37℃培养24 h，共活化两次。取第二次活化的含菌培养基于10 mL离心管，4000 r/min离心10 min，弃去上层培养基，加入无菌生理盐水将菌体清洗两次后备用。

3）泡萝卜的制备

以中秋红萝卜为原料，将新鲜萝卜洗净、晾干后切成约1 cm厚的片状，将萝卜片和不同食盐浓度（4%、5%、6%、7%）的冷开水按料液比1:1放入1 L玻璃坛中，按照不同接种量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）接入发酵乳杆菌CQPC08，于室温（25℃）条件下泡制3天。食盐浓度与乳酸菌接种量组合情况见表1。

表1 不同食盐浓度与不同乳酸菌接种量组合发酵

4）食盐浓度和乳酸菌接种量对泡萝卜感官品质的影响

第3天发酵完成后，由10名感官评定人员按照表2从色泽、气味、滋味和质地共4个指标对泡萝卜进行感官评定。

表2 泡萝卜感官指标评分标准

5）泡萝卜发酵终点pH的测定

第3天发酵完成后，采用pH计测定各坛泡萝卜水的pH值。

3、实验结果

1）发酵乳杆菌CQPC08对毕赤酵母Z-5的抑制率

如图1所示，在10^-5稀释度下，未与发酵乳杆菌CQPC08共培养的毕赤酵母Z-5在平板上的菌落数较多，而与发酵乳杆菌CQPC08共培养的毕赤酵母Z-5在平板上的菌落数明显减少。结果分析发现，发酵乳杆菌CQPC08对毕赤酵母Z-5的抑制率达到了98.1%。

2）发酵泡萝卜图片

不同食盐浓度和不同乳酸菌接种量组合发酵的泡萝卜图片如图2所示，不同组合发酵的泡萝卜色泽均呈现红色，色泽深浅存在一定差异，有些汤汁呈现浅红色，有些汤汁澄清、红色较诱人。在3天发酵过程中，不同组合发酵泡萝卜均未出现生花现象。

3）感官评定结果

如图3所示，随着食盐浓度的增加，不同乳酸菌接种量发酵泡萝卜的感官评分基本呈上升趋势。在食盐浓度为4%时，不同乳酸菌接种量发酵泡萝卜的感官评分差异较大，接种量为1.0%时泡萝卜感官品质最好，而接种量为2.0%时泡萝卜感官品质最差；当食盐浓度增加至5%时，不同乳酸菌发酵泡萝卜的感官品质均得到了提高，其中接种量为0.5%、1.0%和1.5%的泡萝卜感官评分较为接近，而接种量为2.0%的泡萝卜感官评分依旧最低；当食盐浓度继续增加至6%时，乳酸菌接种量为2.0%的发酵泡萝卜的感官评分最高，而其他3种接种量发酵泡萝卜的感官评分具有不同程度的下降；当食盐浓度继续增加至7%时，乳酸菌接种量为0.5%的发酵泡萝卜的感官评分最低，而接种量1.0%和2.0%的发酵泡萝卜的感官评分均较高，接种量1.5%的发酵泡萝卜的感官评分则处于居中位置。综合以上结果可知，发酵乳杆菌CQPC08发酵泡萝卜的最佳食盐浓度和乳酸菌接种量组合为：7%食盐浓度+1.0%或2.0%乳酸菌接种量。

4）食盐浓度对泡萝卜水pH的影响

如图4所示，当乳酸菌接种量为0.5%时，随着食盐浓度的增加，泡萝卜水的pH呈现增加、减少、再增加的趋势，最终食盐浓度为7%时pH值最大，这可能是食盐浓度较高，抑制了乳酸菌的生长繁殖，导致乳酸分泌减少，pH值增大；当乳酸菌接种量为1.0%和1.5%时，食盐浓度对泡萝卜水pH值的影响没有明显差异；当乳酸菌接种量达到2.0%时，4%食盐浓度下的泡萝卜水pH值最高，而7%食盐浓度下的泡萝卜水pH值最低，这可能是高浓度食盐使得萝卜中的可溶性物质溶出较快，给乳酸菌提供了较多的营养物质，最终促进了乳酸菌的生长繁殖，致使乳酸分泌增多，pH值减小。

5）乳酸菌接种量对泡萝卜水pH的影响

如图5所示，当食盐浓度为4%、5%和6%时，随着乳酸菌接种量的增加，泡萝卜水的pH值呈现增加的趋势，这可能是由于食盐浓度较低，导致萝卜中的营养物质溶出不够，而乳酸菌接种量增多，乳酸菌生长繁殖不好，导致乳酸分泌减少，pH值增大；当食盐浓度增加至7%时，随着乳酸菌接种量的增加，泡萝卜水的pH值呈现先减少、再增加、最后又减少的趋势，这可能还是与萝卜中营养物质溶出和乳酸菌生长繁殖速度相关。

4、结论

通过评价接种发酵乳杆菌CQPC08对泡萝卜品质的影响，得到如下结论：

1）发酵乳杆菌CQPC08对分离自泡萝卜的毕赤酵母Z-5的抑制率较高。一些研究表明泡菜的“生花”现象与酵母菌的生长繁殖密切相关，所以本发明的发酵乳杆菌CQPC08可用于制备发酵过程中不生花的泡菜，提高泡菜生产效率，减少生产成本，同时提升泡菜品质。

2）感官评价结果发现，接种发酵乳杆菌CQPC08发酵泡萝卜的最佳食盐浓度和乳酸菌接种量为：7%食盐浓度+1.0%或2.0%乳酸菌接种量。

3）不同食盐浓度和不同乳酸菌接种量均会影响泡萝卜水的pH值，其原因可能与萝卜中营养物质溶出和乳酸菌的生长繁殖速度密切相关。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。