一种利用D-loop区突变位点鉴定确山黑猪的方法与流程

本申请属于动物品种鉴定技术领域，具体涉及一种利用d-loop区突变位点鉴定确山黑猪的方法。

背景技术：

确山黑猪是一种地方性猪种，其主产区在河南省确山县，因产区交通不便，形成了自然隔离，后经当地劳动人民长期选育逐步形成适应当地饲养环境条件而形成了一个地方优良品种。因其具有肉质细嫩、颜色暗红、富含大理石纹，繁殖力强、适应能力强、性情温顺、易于调教等优良特点，因此是我国优良的畜禽遗传资源之一。

优良猪种选育、培育的前提条件之一在于猪种的准确鉴定，常规猪种鉴定方式主要是结合原始产区、形态特征、肉质等方面进行鉴定，但是这种鉴定方式由于受生长特性影响，因此容易出现错误鉴定结果。而采用基因组分析鉴定虽然可以准确鉴定，但现有鉴定成本及技术复杂度，因此应用较为有限。

线粒体dna属于一种核外母系遗传体系，其具有完整传递与表达遗传信息的能力，且具有进化速度快、结构简单、保守性强等特点，因此常被用作动物鉴定的dna条形码。已有研究认为，线粒体d-loop区是线粒体基因组上上进化速度最快的一个区域，因此常作为遗传分子标记区域用于亲缘关系较近的畜禽品种遗传多样性及群体遗传结构等方面的研究。

已有研究表明，猪线粒体d-loop区基因全长1175bp（ncbireferencesequence：nc_000845.1），该段基因序列内无内含子，位于猪线粒体参考基因组（sscrofa11.1）的1bp和1175bp之间。该d-loop区基因的二级结构在功能上分为三个功能区，分别为ⅰ区、ⅱ区和ⅲ区，即高变区、串联重复区和保守区，每个功能区是一个单独的标准区域。现有技术虽然对于该d-loop区进行了较多研究，但由于确山黑猪研究较少，因此尚未见到利用该d-loop区来对确山黑猪进行鉴定的报道。

技术实现要素：

本申请目的在于提供一种利用线粒体d-loop区突变位点鉴定确山黑猪的方法，从而较好解决不同地方黑猪品种在形态特征之间过于相似，而无法直接从外观判断品种归属的难题，进而为确山黑猪品种的准确鉴定及相关品种培育奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种利用d-loop区突变位点鉴定确山黑猪的方法，该方法包括如下步骤：

（1）提取待鉴定品种基因组dna

具体例如采用酚氯仿法进行提取；

（2）设计引物

基于第474位碱基序列进行判定时：

在d-loop区基因第474位碱基的上游和下游设计pcr扩增用引物序列（如seqidno.1~2所示）如下：

上游引物474-f：5'-ggcaaggcgttatagggt-3'，

下游引物474-r：5'-tacggcacgacaatccaa-3'；

基于第640位碱基序列进行判定时：

在d-loop区基因第640位碱基上、下游分别设计一条pcr引物（如seqidno.3~4所示），具体如下：

上游引物640-f：5'-gactgaatagcaccttgtt-3'，

下游引物640-r：5'-caggcatctggttcttac-3'；

（3）pcr扩增

以步骤（1）中所提取基因组dna为模板，利用步骤（2）所设计引物进行pcr扩增；对pcr扩增产物进行电泳检测，并回收目标产物进行测序；

pcr扩增时，25μl扩增体系可参考设计如下：

步骤（1）中所提取模板基因组dna，40ng；

2×estaqmastermix（例如采用康为世纪cw2214m产品），12.5μl；

上游引物，10pmol；

下游引物，10pmol；

ddh2o，加至25μl；

扩增条件为：预变性94℃、5min；变性94℃、30s，退火51.3℃、30s，延伸72℃、50s，25个循环；最后延伸72℃、10min；

扩增目标长度为1175bp；

对扩增产物可采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测合格后再进一步进行测序分析；

（4）比对鉴定

将步骤（3）测序结果与现有ncbi中1175bp的猪d-loop区基因（ncbi登录号：nc_000845.1）进行比对，如果第474位或者第640位碱基为t则为与确山黑猪有遗传关系的确山黑猪品种（即，可以确定为纯种确山黑猪，或者为确山黑猪的杂交品种）。

所述利用d-loop区突变位点鉴定确山黑猪的方法，可将确山黑猪与河南省其他地方品种（豫西黑猪、南阳黑猪、淮南猪）、中国地方猪种（槐猪、桃源猪、莱芜猪、金华猪、梅山猪、五指山猪、陆川猪、民猪、二花脸）、西方商业猪种（约克夏、杜洛克、长白）、东南亚地方猪种（moncai、jnp）等进行准确区分。

在对多个猪品种的线粒体基因组比对基础上，发明人确定了一种较为简便的鉴定确山黑猪品种的鉴定方法。利用该鉴定方法，对于确山黑猪品种保护、品种培育以及市场开发都具有较好的实用价值。同时鉴于本申请的鉴定方法，与大规模的测序方法相比，具有操作简单、快速高效、成本低廉等优点，因此也可为其他地方性猪品种的保护鉴定、品种培育和市场开发提供较好的技术借鉴，因此具有较好的推广应用意义。

附图说明

图1为实施例1中474位碱基所设计引物回收的pcr产物的测序结果图；

图2为实施例1中640位碱基所设计引物回收的pcr产物的测序结果图；

图3为确山黑猪和其他猪种d-loop区基因474位附近的对比图；

图4为确山黑猪和其他猪种d-loop区基因640位附近的对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验材料、实验仪器等情况简要介绍说明如下。

实验材料：

确山黑猪：河南省确山黑猪保种场；

河南省其他地方品种（豫西黑猪、南阳黑猪、淮南猪）、中国地方猪种（槐猪、桃源猪、莱芜猪、金华猪、梅山猪、五指山猪、陆川猪、民猪、二花脸）、西方商业猪种（约克夏、杜洛克、长白）、东南亚地方猪种（moncai、jnp），均为可公开获得品种资源；部分样本具体来源为：南阳黑猪，河南省南阳黑猪保种场；豫西黑猪，河南省豫西黑猪保种场；淮南猪，河南省淮南猪原种场；

引物由上海生工生物有限公司合成，测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成；

主要试剂：

组织基因组dna提取试剂盒（dp304），天根生化科技有限公司产品；

主要仪器

所使用pcr仪型号tca0096，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

实施例1

现有研究中，哺乳动物的线粒体dna结构简单、稳定、遵循母系遗传，常作为一种遗传标记来研究家畜的起源进化、亲缘关系、群体遗传结构等。基于这一特点，发明人通过扩增四个河南省地方猪（豫西黑猪、南阳黑猪、淮南猪）的线粒体基因组并进行比对，发现在d-loop区基因的474位上，确山黑猪存在一个特有突变g.474c突变为t，另一方面，在640位处，同样由c突变为t。基于此发现，发明人首先就部分地方猪品种之间的碱基序列差异进行了进一步实验验证。具体过程简要介绍如下。

（一）引物设计

发明人在ncbi中选取猪d-loop区基因（登录号：nc_000845.1），在d-loop区基因第474位碱基上下游分别设计一条pcr引物，

上游引物474-f序列为：5'-ggcaaggcgttatagggt-3'，

下游引物474-r序列为：5'-tacggcacgacaatccaa-3'；

在d-loop区基因第640位碱基上、下游分别设计一条pcr引物：

上游引物序列为：5'-gactgaatagcaccttgtt-3'，

下游引物序列为：5'-caggcatctggttcttac-3'。

（二）pcr扩增验证

利用酚氯仿法分别提取部分猪品种（确山黑猪、豫西黑猪、南阳黑猪、淮南猪）猪耳组织样本的dna；以所提取dna为模板，利用上述pcr引物为引物分别进行pcr扩增。

pcr扩增时，25μl的聚合酶链式反应（pcr）体系，设计如下：

模板dna，2μl（40ng）；

2×estaqmastermix（康为世纪cw2214m），12.5μl；

正反向引物各10pmol，0.5μl；

ddh2o，加至25μl；

扩增条件为：预变性94℃、5min；变性94℃、30s，退火51.3℃、30s，延伸72℃、50s，25个循环；最后延伸72℃、10min；

对扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后回收目标产物，将pcr产物送往测序公司，进行sanger双向比对测序。

其中，确山黑猪的测序结果如seqidno.5所示，具体如下：

确山黑猪的d-loop区：

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进一步比对结果如图1、图2所示。可以明显看出，确山黑猪在d-loop区基因第474位和640位的碱基均由c突变为t。

实施例2

在实施例1基础上，为验证该突变位点的特异性和可靠性，发明人进一步从ncbi上下载九个具有地域代表性的其他中国地方猪种（槐猪、桃源猪、莱芜猪、金华猪、梅山猪、五指山猪、陆川猪、民猪、二花脸）、三个西方主要商品猪种（杜洛克猪、约克夏猪、长白猪）、两个东南亚地方猪种（moncai猪、jnp猪）进行序列逐一比对，具体比对结果如图3、图4所示。从图中可以看出，确山黑猪d-loop区g.474c>t确实具有品种特异性，可用于鉴定确山黑猪。

需要说明的是，ncbi中，各猪品种d-loop区的具体登录号：槐猪mg250536.1，桃源猪am040653.1，莱芜猪ef590174.1，金华猪ab041477.1，梅山猪am040647.1，五指山猪mg250560.1，陆川猪mg250548.1，二花脸af486861.1，杜洛克猪mf183225.1，约克夏猪kf752550.1，长白猪nc_000845.1，moncai猪ab041480.1，jnp猪ay334492.2。

综上结果可以看出，利用本发明不仅可以区分确山黑猪和西方猪种，而且可以快速、准确鉴别同属一个地域的黑猪品种，而通常情况下，由于黑猪肉质优于西方商业猪种，价格也偏高，市场上会出现肉类掺假的情况；因此本申请所提供的鉴定方法对于规范市场具有十分重要的应用意义。另一方面，对于一些在外观上容易混淆的同属于一个地域内的地方黑猪之间，准确的物种鉴定，对于地方品种的保种和开发也具有十分重要的科研价值。

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<110>河南农业大学

河南枫华种业股份有限公司

<120>一种利用d-loop区突变位点鉴定确山黑猪的方法

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