本发明属于公共卫生与预防医学领域，具体涉及一种用于乳腺癌风险评估的试剂盒及其在评估乳腺癌发病风险中的应用。
背景技术：
：：乳腺癌是全球各地女性最常见的恶性肿瘤，也是导致女性死亡的主要原因，严重威胁世界女性的生命健康。最新的癌症统计数据显示，2018年全球女性乳腺癌的新发病例与死亡病例分别约为208.9万和62.7万，占女性所有恶性肿瘤发病的24.2％，死亡的15.0％，均位于首位。乳腺癌的发病率和死亡率在发达国家(北美州、大洋洲、北欧/西欧地区)持续处于高水平，然而近年来在南美、非洲与亚洲一些发展中国家乳腺癌确诊患者大幅增加，死亡人数也处于不断上升趋势。中国的乳腺癌形势同样相当严峻，发病率已跃居女性所有恶性肿瘤的第一位。据权威统计，我国乳腺癌的发病人数已占全世界乳腺癌发病人数的12.2％，死亡人数占全世界死亡人数的9.6％。乳腺癌已成为当前影响全球女性生命健康的重大公共卫生问题。乳腺癌的病因比较复杂，其发生发展是机体内外多种危险因素共同作用的结果。大量的研究表明超重肥胖、体力活动减少、口服避孕药的使用、雌孕激素替代治疗史、生育减少以及癌症家族史等外部环境因素(生活方式)与女性乳腺癌的发病风险紧密相关，增加了患癌的几率。但是，科学界对于乳腺癌发病的遗传学因素仍然不是十分清楚。尽管一些已知高风险的内源性突变基因如brca1和brca2被鉴定能够诱导乳腺癌的发生，然而此类突变基因携带者只能代表其中小于5％的病例，表明与乳腺癌易感性相关的众多内在危险因素仍然尚不明晰，这严重制约了乳腺癌的有效预防。临床上乳腺癌的诊断方式主要为乳腺钼靶x线检查、超声成像检查和磁共振成像检查等，并结合穿刺活检确诊，其中乳腺钼靶x线检查是目前最广泛使用的诊断早期乳腺癌的方法，准确度高，然而该方法在对年轻女性(40岁以下)以及致密型乳腺筛查时效果不理想，敏感性和特异性显著降低。血清肿瘤标志物如癌胚抗原cea和糖类抗原ca153检测在临床上也有一定的应用，但都存在敏感性和特异性低的缺陷，通常只用于乳腺癌的辅助诊断，难以进行早期筛查，目前仍缺乏用于乳腺癌早期诊断的高灵敏性、高特异性的标志物。早期发现和早期合理治疗是提高乳腺癌患者生存期的关键，然而现有诊断技术的局限性以及缺乏对疾病基本知识的了解，相当一部分患者在诊断之时已处于乳腺癌中晚期，延误了病情，错过了治疗最佳时期。鉴于此，开展科学有效的乳腺癌早期预防显得尤为必要。通过对易感基因的检测，可以评估个体乳腺癌的发病风险，携带易感基因的女性比不携带易感基因的女性患乳腺癌的风险更高。进一步针对携带易感基因的乳腺癌高危人群，通过科学的肿瘤预防手段和早期筛查方法，降低疾病发生发展的几率，从而实现乳腺癌的及早知道与及时预防。目前用于乳腺癌风险评估的方法，主要基于brca1和brca2等少数几个易感基因的检测，其更多的适用于家族性乳腺癌人群。由于大部分乳腺癌患者并未发生brca1和brca2突变，所以该方法使用范围有限。以往对乳腺癌易感基因的研究大多根据高加索人的遗传特征，而肿瘤性疾病具有较强的遗传异质性，不同种群的肿瘤易感位点也会存在不同程度的差异。基于亚裔特别是中国人群的遗传特征鉴定新的乳腺癌易感基因，并建立相应的风险评估方法，识别易感人群，进而开展早期肿瘤预防和干预仍是当前我国公共卫生领域面临的难题和挑战。技术实现要素：本发明的目的是提供一种用于乳腺癌风险评估的试剂盒及其在评估乳腺癌发病风险中的应用，该试剂盒可检测基因组中与女性乳腺癌相关的单核苷酸多态性(snp)位点，从而分析和评估受试者乳腺癌的发病风险，筛选出乳腺癌的高危人群，进而采取科学的肿瘤预防措施达到阻止或延缓乳腺癌发生发展的目的。为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种用于乳腺癌风险评估的试剂盒，包括有同时扩增3个snp位点rs17467825、rs2298850、rs3755967的pcr扩增引物seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6和单碱基延伸引物seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9。进一步地，上述试剂盒中还包括pcr反应液。进一步地，上述试剂盒中还包括碱性磷酸酶处理反应液。进一步地，上述试剂盒中还包括单碱基延伸反应液。上述试剂盒在制备乳腺癌风险评估检测试剂中的应用。通过前期的乳腺癌病例对照研究，发明人鉴定了人类4号染色体编码维生素d结合蛋白的gc基因中的3个snp位点rs17467825，rs2298850和rs3755967与乳腺癌的发病风险密切相关，能够用于女性个体乳腺癌易感性的判定。对于rs17467825位点，基因型为aa的女性个体乳腺癌的发病风险高于基因型ag或gg的女性个体；对于rs2298850位点，基因型为gg的女性个体乳腺癌的发病风险高于基因型gc或cc的女性个体；对于rs3755967位点，基因型cc的女性个体乳腺癌的发病风险高于基因型ct或tt的女性个体。将上述3个snp位点联合分析能够进一步评估受试者发生乳腺癌的风险。首先定义各个位点的保护性等位基因，rs17467825为g，rs2298850为c，rs3755967为t，在检测各个位点的基因型后，计算受试者所含有的保护性等位基因数可以判定乳腺癌的易感性，最小值为0，最大值为6，不含有3个snp位点任何保护性等位基因的受试者乳腺癌的发病风险要高于含有1-2个保护性等位基因的受试者，并且显著高于含有3-6个保护性等位基因的受试者。恶性肿瘤的发生发展通常是基因与环境共同作用的结果，将遗传因素与生活方式因素相结合更有利于疾病易感人群的鉴定。gc基因3个snp位点不同基因型与不同腰围大小的女性对乳腺癌的易感性也存在较大差异，带有rs17467825位点aa基因型且腰围(wc)≥80cm的女性个体乳腺癌的发病风险最高，显著高于ag或gg基因型且腰围<80cm的女性个体(发病风险最小)；带有rs2298850位点gg基因型且腰围≥80cm的女性个体乳腺癌的发病风险最高，显著高于gc或cc基因型且腰围<80cm的女性个体(发病风险最小)；带有rs3755967位点cc基因型且腰围≥80cm的女性个体乳腺癌的发病风险最高，显著高于ct或tt基因型且腰围<80cm的女性个体(发病风险最小)。为了依据snp位点基因型实现个体乳腺癌风险评估的目的，发明人提供了一组用于检测rs17467825，rs2298850和rs3755967位点基因型的特异性引物，包括进行相应snp位点pcr扩增反应的正向引物、反向引物，以及进行单碱基延伸反应的延伸引物，具体引物序列如表1所示。表1.snp位点pcr扩增引物和单碱基延伸引物序列本发明还提供了通过检测rs17467825，rs2298850和rs3755967位点基因型评估女性发生乳腺癌风险的应用，以期筛选出乳腺癌的高危人群，主要通过以下步骤实现：(1)受试者生物样本(如血液、唾液等)的采集；(2)基因组dna的分离与纯化；(3)sequenommassarray分子量阵列技术进行基因分型；(4)分型结果判定，评估个体乳腺癌易感性。有益效果：本发明突破了乳腺癌风险评估传统方法依赖于brca1和brca2等基因突变分析的局限性，针对中国人群的遗传特征，鉴定了与乳腺癌易感性相关的snp位点，通过检测基因型的差异，可以有效评估受试者乳腺癌的易感性，识别高危人群。采用该试剂盒进行检测，流程较为快速、相对简便且成本低廉，可对未出现乳腺癌临床症状的人群进行评估，进而针对发病风险高的人群及早地开展乳腺癌早期预防与早期筛查，可降低乳腺癌的发病率，减少疾病负担，具有潜在的社会和经济效益。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。实施例1本发明募集了1753名中国女性，其中乳腺癌患者818例，健康对照组935例。在进行流行病学调查后，采集每名调查对象外周血提取基因组dna，通过sequenommassarray分子量阵列技术对候选snp位点进行基因分型，统计学分析乳腺癌患者与健康对照组基因型的差异，最终鉴定rs17467825，rs2298850和rs3755967位点与乳腺癌的发病风险密切相关，能够用于女性个体乳腺癌发病风险的评估。1.研究对象的募集共募集了1753名中国女性，其中乳腺癌患者818例，健康对照组935例。病例组来源于肿瘤网络登记系统，为新确诊的乳腺癌患者，根据查体、乳腺彩超、乳腺钼靶x线摄片、乳腺磁共振mri及空芯针检查证实为原发性乳腺癌，排除标准：1)既往有乳腺癌病史；2)有其他肿瘤病史；3)怀疑或证实的病灶己接受手术切除；4)全身其他部位有转移。对照组是人口数据库中随机选取的女性，与病例组按照年龄进行频数匹配，年龄相差5岁以内，同时排除有其他癌症史与基础病史的个体。设计科学合理的流行病学调查问卷，由经过培训的调查人员通过面对面的访谈收集流行病学数据，调查内容为乳腺癌已知或潜在的危险或保护因素，主要包括病例和对照的一般情况(年龄、文化程度、婚姻状况、收入等)、生活方式(吸烟和饮酒史、饮茶史、饮食史、体力活动等)、生理因素(女性月经及生育史、身体状况及疾病史等)、精神因素、遗传因素(癌症家族史)、环境因素(居住环境、职业暴露史)。调查结束后采集每个研究对象抗凝血5ml备用。病例和对照的一般人口学特征如表2所示。平均年龄、初潮年龄、初产年龄、绝经年龄、胸围以及口服避孕药使用在两组间没有表现出统计学差异(p>0.05)，然而腰围、绝经状态、体质指数bmi、教育程度、收入水平以及乳腺癌家族史在病例组和对照组间具有统计学差异(p<0.05)。表2.病例组和对照组的一般人口学特征2.全血基因组dna的分离纯化采用qiaampdnabloodminikit(qiagen，德国)提取血液中的基因组dna，按厂商提供的操作步骤进行。纯化的dna用分光光度计定量，od260/od280的比值在1.7-1.9之间，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组dna电泳条带通常不小于20kb。质检合格的dna将浓度调整到50ng/μl，转移至384孔板，-20℃储存备用。3.sequenommassarray分子量阵列技术进行基因分型sequenommassarraysnp检测过程结合多重pcr技术、massarrayiplex单碱基延伸技术，和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术(matrix-assistedlaserdesorption/ionization–timeofflight，maldi-tof)进行分型。其基本原理是：将包含snp位点区域的dna模板通过pcr技术扩增，再使用特异的延伸引物与pcr产物进行单碱基延伸反应。由于多态性位点碱基不同，延伸产物不同的末端碱基将导致延伸后的产物分子量的差异，因此由snp多态性引起的碱基差异通过分子量的差异而体现，通过基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术，检测延伸产物分子量的大小，应用专用的分析软件，通过判断分子量的差异而进行snp分型检测。实验流程包括：3.1引物设计与合成使用sequenom公司genotypingtools及massarrayassaydesign软件设计rs17467825，rs2298850和rs3755967位点的pcr扩增引物及单碱基延伸引物，所设计的引物序列见表1，并交由生物公司合成。3.2pcr扩增反应pcr扩增采用多重pcr技术,在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5μl。(1)在一个新的1.5mlep管中按表3所示配制pcrmastermix溶液。表3.pcrmastermix溶液体系pcrmix对每个反应，μl10×pcrbuffer0.5mgcl2(25mm)0.4dntpmix(25mm)0.1hotstartaq(5u/μl)0.1water1.9pcrprimermix1totalvolume4(2)使用24通道加样器，调节加样体积为4μl，在384孔板的每个加样孔中加入pcrmastermix液。该384孔板即为pcr反应板。(3)取出已经制备好的dna样品384孔板，使用24通道加样器，调节加样体积为1μl，每个5μlpcr反应体系中包含模板dna20-50ng，hotstartaq0.5u，每条扩增引物0.5pmol，0.1μl的25mmdntps。(4)在兼容384孔板的pcr仪上设定pcr反应条件为：94℃4分钟；94℃20秒,56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃保持。将384孔pcr反应板放置于pcr仪上，启动pcr反应。3.3pcr产物碱性磷酸酶处理(1)在pcr反应结束后，将pcr产物用sap(shrimpalkalinephosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dntps。(2)按表4所示配制碱性磷酸酶处理反应液，sapmix。表4.碱性磷酸酶处理反应液体系sapmix对每个反应，μlwater1.53sapbuffer(10x)0.17sapenzyme(1.7u/ul)0.3totalvolume2(3)使用24通道加样器，调节加样体积为2μl，将sapmix加入384孔pcr反应板。对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应体系总体积为7μl，其中pcr产物5μl，sap混合液2μl(sap0.5u,buffer0.17μl)。(4)将384孔板放置在兼容384孔板的pcr仪上，设定pcr反应条件：37℃40分钟；85℃5分钟；4℃维持，启动pcr仪进行碱性磷酸酶处理。3.4单碱基延伸反应(1)在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl。(2)按表5所示配制单碱基延伸反应液，extendmix。表5.单碱基延伸反应液体系extendmix对每个反应，μlwater0.619extendprimermix1or20.94iplexbufferplus0.2iplexterminator0.2iplexenzyme0.041totalvolume2(3)使用24通道加样器，调节加样体积为2μl，将extendmix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含sap处理后pcr产物7μl及extendmix液2μl(其中各延伸反应引物混合物0.94μl，iplex酶0.041μl,延伸混合物0.2μl)。(4)将384孔板放置在兼容384孔板的pcr仪上，设定pcr反应条件：i.94℃for30secondsii.94℃for5secondsiii.52℃for5secondsiv.80℃for5secondsv.gotoiii,4moretimesvi.gotoii,39moretimesvii.72℃for3minutesvii.4℃forever启动pcr仪进行单碱基延伸反应。3.5树脂纯化(1)将cleanresin树脂平铺到6mg的树脂板中；(2)加16μl水到延伸产物的对应孔内；(3)将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟,使树脂与反应物充分接触；(3)离心使树脂沉入孔底部。3.6芯片点样启动massarraynanodispenserrs1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔spectrochip(sequenom)芯片上。3.7质谱检测将点样后的spectrochip芯片使用maldi-tof(matrix-assistedlaserdesorption/ionization–timeoffligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用typer4.0软件(sequenom)分型并输出结果。4.结果分析根据snp分型结果，rs17467825，rs2298850和rs3755967三个位点在所有样本中的检出率均大于95％，且在对照组中均符合哈迪-温伯格平衡(hardy-weinbergequilibrium，hwe)。4.1rs17467825，rs2298850和rs3755967位点与乳腺癌风险的关联病例组和对照组rs17467825，rs2298850和rs3755967位点的基因型频率分布如表6所示。采用非条件logistic回归模型来评估基因多态性与乳腺癌风险的关联，以比值比(oddsratio,or)和95％置信区间(confidenceinterval,ci)表示。分析结果表明(表6)，在调整了年龄、绝经状态、bmi、乳腺癌家族史、收入水平、腰围和教育程度等混杂因素后，rs17467825位点aa基因型的个体乳腺癌的发病风险高于ag或gg基因型的个体；rs2298850位点gg基因型的个体乳腺癌的发病风险高于gc或cc基因型的个体；rs3755967位点cc基因型的个体乳腺癌的发病风险高于ct或tt基因型的个体。表6.rs17467825，rs2298850和rs3755967位点与乳腺癌风险的关联*调整因素包括年龄、绝经状态、bmi、乳腺癌家族史、收入水平、腰围和教育程度4.2三个snp位点的联合效应对乳腺癌发病风险的影响将rs17467825，rs2298850和rs3755967位点联合分析进一步评估与乳腺癌风险的关联。根据表6的分析结果，定义各个位点的保护性等位基因，rs17467825为g，rs2298850为c，rs3755967为t，分析个体所含有的保护性等位基因数量对乳腺癌发病的影响。结果显示(表7)不含有3个snp位点任何保护性等位基因的个体乳腺癌的发病风险要高于含有1-2个保护性等位基因的个体，并且显著高于含有3-6个保护性等位基因的个体。表7.三个snp位点的联合效应对乳腺癌发病风险的影响*保护性等位基因：rs17467825为g，rs2298850为c，rs3755967为t**调整因素包括年龄、绝经状态、bmi、乳腺癌家族史、收入水平、腰围和教育程度4.3rs17467825，rs2298850和rs3755967位点与腰围的交互作用对乳腺癌发病风险的影响采用加法模型来评估3个snp位点与腰围的交互作用对乳腺癌发病风险的影响。加法模型的定量评价指标包括：交互作用超额相对危险度(relativeexcessriskduetointeraction,reri)、交互作用归因比(attributableproportionduetointeraction,ap)和交互作用指数(synergyindex,si)。reri,ap和si的95％ci通过delta法来计算。reri的绝对值越大，说明因素间的交互作用越强，如果没有相加的交互作用，reri＝0。ap的绝对值越大，说明因素间的交互作用越强。si＝1时,说明无相加交互作用，相互独立；si>1，具有正相加交互作用,同时存在时效应增强；si<1，具有负相加交互作用，同时存在时效应减低。交互作用分析结果如表8所示，腰围与3个snp位点之间对乳腺癌的发病风险没有统计学显著的交互作用，然而腰围与各个位点基因型联合能够进一步区分女性乳腺癌易感性的差异，带有rs17467825位点aa基因型且腰围(wc)≥80cm的女性个体乳腺癌的发病风险最高，显著高于ag或gg基因型且腰围<80cm的女性个体(发病风险最小)；带有rs2298850位点gg基因型且腰围≥80cm的女性个体乳腺癌的发病风险最高，显著高于gc或cc基因型且腰围<80cm的女性个体(发病风险最小)；带有rs3755967位点cc基因型且腰围≥80cm的女性个体乳腺癌的发病风险最高，显著高于ct或tt基因型且腰围<80cm的女性个体(发病风险最小)。表8.三个snp位点与腰围对乳腺癌发病风险的交互作用分析*调整因素包括年龄、绝经状态、bmi、乳腺癌家族史、收入水平和教育程度。序列表<110>江苏省疾病预防控制中心（江苏省公共卫生研究院）<120>一种用于乳腺癌风险评估的试剂盒及其应用<130>20190729<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1acgttggatggtcagcgattcttaatata29<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2acgttggatgagtagggttttcatagttcc30<210>3<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3acgttggatgtgctcactagcagtctgttg30<210>4<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4acgttggatgtctaccatcattcaggcagg30<210>5<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5acgttggatgactgcaatgagttggttgtg30<210>6<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6acgttggatgcacaaagttataggtctgag30<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ctctaaacacatttcacca19<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ggatagtaatgagttctcagaaga24<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9aagttataggtctgaggtactt22当前第1页12当前第1页12