分子靶标在肺腺癌联合诊断中的应用的制作方法

本发明属于疾病诊断领域，涉及分子靶标在肺腺癌联合诊断中的应用，具体涉及col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1在肺腺癌诊断中的应用。

背景技术：

肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌占肺癌的85％，而肺腺癌又是非小细胞肺癌最常见的病理亚型。70％的肺腺癌患者在诊断时已经发生局部或远处转移[sangodkarj,katzs,melvilleh,etal.lungadenocarcinoma:lessonsintranslationfrombenchtobedside[j].mtsinaijmed,2010,77(6):597-605]。

肺组织密度低，可以和周围组织可以形成较好的密度比较，所以胸部x线是肺腺癌首选的最基本影像学检测方法。早期肺癌x线片主要表现为形态不规则的浸润样炎性改变、边缘模糊的斑片状改变及结节样改变。随着肿块体积的增加，可以看到肺癌的典型征象，比如：椭圆形亦或圆形的肿块样影像改变，可伴有分叶、毛刺及中央空洞等[蔡云国,韩传贵.早期肺癌的影像学诊断[j].中国伤残医学,2013.21(10)：265-266]。但是胸部x线的空间分辨率相对较差，诊断比较局限，因为显示的是重叠图像，容易受到组织密度及骨骼的影响，组织显像不够清晰，对比度较差，容易引起漏诊，特别是在病灶较小或病灶部位比较隐蔽的情况下[翁姗姗,李龙芸,宋伟等.低剂量螺旋ct对肺内结节的诊断价值[j].癌症进展,2011,09(1):7-12]。而且x线并不能对病灶的良恶性进行区分，因此，x线检查经常适用于初期筛查。

由此可见，x线诊断对肺腺癌的诊断是远远不够，本发明旨在寻找与肺癌诊断相关的分子生物学指标，为进一步研究肺癌的发生和发展提供依据，提高诊断准确率。

技术实现要素：

第一方面，本发明提供肺腺癌组织中高表达的分子靶标，分子靶标包括col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1，为肺腺癌的诊断提供了新的评价指标。

第二方面，本发明前面所述的分子靶标在制备诊断肺腺癌的产品中的用途。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测基因的试剂在制备诊断肺腺癌的产品中的应用，所述基因包括col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1中的至少两种。

进一步，所述试剂包括检测所述基因的表达量的试剂。

进一步，所述试剂包括利用sybygreen、taqman探针、分子信标、双杂交探针或复合探针检测所述基因表达量时使用的pcr扩增引物。

优选的，所述引物序列如seqidno.1-10所示。

在本发明的具体实施方案中，所述制备诊断肺腺癌的产品包括芯片、试剂盒或试纸。

本发明提供了一种用于肺腺癌诊断的产品，所述产品包括检测col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1中的至少两种基因表达的试剂。

进一步，所述试剂包括利用sybygreen、taqman探针、分子信标、双杂交探针或复合探针检测col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1中至少两种基因的表达量时使用的pcr扩增引物。

进一步，所述引物序列如seqidno.1-10所示。

本发明提供了一种用于诊断肺腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1基因中至少两种基因的引物、特异性识别col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1基因中的至少两种基因的探针和/或特异性结合col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1蛋白中至少两种蛋白的抗体。

进一步，所述试剂盒还包括逆转录体系、聚合酶链式反应体系以及使用说明书。

本发明还提供了一种诊断肺腺癌的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样品；

(2)检测受试者样品中col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1的表达水平；

(3)将测得的col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1的表达水平与受试者的患病与否关联起来；

(4)与正常对照相比，col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1的表达水平显著升高，则该受试者被判断患有肺腺癌、判断该受试者患有肺腺癌的风险高、肺腺癌患者被判断为复发或者肺腺癌患者被判断为预后不良。

本发明中，基因：

col17a1基因(geneid:1308)可在genebank数据库中查询到。

igf2bp3基因(geneid:10643)可在genebank数据库中查询到。

aoc1基因(geneid:26)可在genebank数据库中查询到。

onecut2基因(geneid:9480)可在genebank数据库中查询到。

fgl1基因(geneid:2267)可在genebank数据库中查询到。

本发明的优点和有益效果：

本发明发现了用于联合诊断肺腺癌的分子靶标，使用该分子靶标可以为肺腺癌发生发展机制研究、肺腺癌诊断、预后及靶向治疗等研究提供有力基础。

定义：

术语“引物”或“探针”指具有下述序列的寡核苷酸或多核苷酸分子，所述序列与待检测或定量的靶分子或靶序列的区域相同、互补、作为该区域的同源物或同源，从而引物或探针可特异性地与靶分子结合，所述靶分子，例如待检测或待定量的靶核酸、rna、dna、cdna、基因、转录物、肽、多肽或蛋白。“引物”或“探针”应具有分子生物学领域技术人员已知的这些术语的常规含义。引物容易由本领域的技术人员根据本发明的实施例的序列设计。在本发明的具体实施方案中，靶分子为待定量的col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1靶核酸。如本发明所理解的，“探针”可包含例如引物对和内部标记探针的组合，其是许多商品化qpcr方法中所常见的。

术语“诊断”意为检测疾病或病症，或者确定疾病或病症的阶段或程度。通常，对疾病或病症的诊断基于对指示疾病的一种或多种因子和/或症状的评估。亦即，诊断可基于指示疾病或状况的存在或缺乏的因子的存在、缺乏或量来进行。被视为指示用于特定疾病诊断的每个因子或症状不需要唯一地与该特定疾病相关；即可从某诊断因子或症状推断出不同的诊断。类似地，有可能指示特定疾病的因子或症状存在于不具有该特定疾病的个体中。诊断方法可以独立地使用，或与医学领域已知用于特定疾病或病症(例如肺腺癌)的其他诊断和/或分期方法组合使用。

“诊断试剂盒”，可用于检测、诊断、监测或预测肺腺癌或向肺腺癌的进展或向肺腺癌的倾向，在本发明中，所述诊断试剂盒包含：对col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1表达产物特异性的寡核苷酸集合、对col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1表达产物特异性的探针和/或对col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1表达产物或蛋白特异性的适体和/或对col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1蛋白特异性的抗体和对col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1蛋白特异性的抗体变体。

具体来说，诊断试剂盒包含一种或多种探针或抗体，本发明中所述探针或抗体能够实现对col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1的特异性检测。诊断试剂盒的探针或抗体可以包含在一个或多个容器或单独的实体中，所述探针或抗体的性质由试剂盒的目标检测方法决定。对于检测col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1基因的mrna表达水平来说，诊断试剂盒包含上文定义的对col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1表达产物特异性的寡核苷酸集合和/或对col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1表达产物特异性的探针，它们可以任选地根据本领域已知的方法进行标记。额外地或替换地，可以包含对col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1表达特异性的适体。对于检测col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1蛋白水平来说，诊断试剂盒包含的是一种或多种抗体，其含有与col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1蛋白特异性结合的抗体或抗体变体的抗原结合片段。额外地或替换地，可以包含对col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1蛋白特异性的适体。当然，诊断试剂盒也可以包含造影剂，或与col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1特异性地相互作用的其它化合物，如特异性的底物或配体。

在本发明的具体实施方案中，诊断试剂盒还含有col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1的mrna或col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1蛋白的检测剂。这样的检测剂包括：例如，缓冲液、标记液或洗涤液等。此外，所述诊断试剂盒可以包含一定量的已知的核酸分子或蛋白，其可以用于试剂盒的校准，或用作内部对照。优选的，用于检测col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1的mrna的诊断试剂盒可以包含：助剂如pcr缓冲剂、dntps、聚合酶、离子(如二价阳离子或单价阳离子)、杂交溶液等。用于检测col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1蛋白的诊断试剂盒还可以包含助剂如第二亲和配体(例如第二抗体)、检测染料和基于上文定义的任意亲和配体或造影剂进行蛋白检测必需的任意其它合适的化合物或液体，这是本领域技术人员已知的。这样的成分是本领域技术人员已知的，且可以随进行的检测方法而变化。另外，所述试剂盒可以包含说明书活页，和/或可以提供关于得到的结果的关联性的信息。

术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述单克隆抗体是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。所述多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(nature,256:495,1975)，也可采用重组dna技术获得(参见u.s.p4,816,567)。

附图说明

图1是利用qpcr检测col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2、fgl1或csf3分子靶标在肺腺癌组织与癌旁组织中的表达情况图，其中图a为col17a1，图b为igf2bp3，图c为aoc1，图d为onecut2，图e为fgl1，图f为csf3。

具体实施方式

实施例1qpcr验证相关差异表达基因

1、样本的收集

收集肺腺癌组织和癌旁组织各59例，所有样本离体后立即放入装有rna保护液的冻存管中，并在30分钟内置于-80℃冰箱中冷冻保存，整个操作及保存过程遵循无酶原则。

2、rna样品的制备

利用trizolrna提取方法提取肺腺癌组织和癌旁组织中的总rna。

(1)用液氮预冷研钵，组织样品放入加有液氮的研钵中，在液氮下把组织样品充分研磨成粉末；

(2)把样品粉末转入到装有trizol裂解液的2.0mlep管中，(每ml裂解液可加50mg组织样品)剧烈震荡，充分混匀，平放室温静置5-10min；

(3)10000rpm，4℃离心5min；

(4)吸取上清液至新的2.0mlep管中，每毫升裂解液加入200μl氯仿/异戊醇，剧烈颠倒混匀；

(5)10000rpm，4℃离心10min；

(6)吸取上清液至新的1.5ml离心管，注意不要吸到中间蛋白层，加入等上清液体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀；

(7)放入-20℃冰箱沉淀1h；

(8)13600rpm，4℃离心20min；

(9)吸弃上清，加入1ml75％乙醇，用移液器吹洗沉淀；

(10)10000rpm，4℃离心3min，吸弃上清，短暂离心，吸去残留液体，晾干3-5min；

(11)用30-100μldepc水或者rnasefree水溶解沉淀；

(12)置于-80℃冰箱保存。

3、总rna逆转录

利用tiangen公司的逆转录试剂盒(货号kr106)进行rna的逆转录(方法按照试剂盒推荐标准流程操作)

(1)去除基因组dna

将1.0μg的总rna模板与2.0μl的5×gdnabuffer和rnasefree水混合，终体积为10μl，42℃孵育3min。

(2)逆转录pcr反应体系

将2.0μl的10×fastrtbuffer、1.0μl的primerscriptrtenzymemixi与2.0μl的fq-rtprimermix混合，加入10μl的去除基因组dna的反应体系和5.0μl的rnasefree水，共20μl，42℃反应15min，之后95℃反应3min。

4、qpcr反应

(1)引物设计

根据基因序列，设计qpcr扩增引物，管家基因选择β-actin。具体引物序列如下：

col17a1基因：

上游引物：5’-aacgagatggaactgaagtc-3’(seqidno.1)；下游引物：5’-ttggtggtaaggatgtaagtc-3’(seqidno.2)。

igf2bp3基因：

上游引物：5’-gcggcttgtaagtctatt-3’(seqidno.3)；下游引物：5’-gtctgtgtcttgctcaat-3’(seqidno.4)。

aoc1基因：

上游引物为5’-cactttaattccaacttt-3’(seqidno.5)；下游引物为5’-atgtaatcataattgtagac-3’(seqidno.6)。

onecut2基因：

上游引物：5’-aacgcaaagagcaagaac-3’(seqidno.7)；下游引物：5’-ttggaggtcagtgaacac-3’(seqidno.8)。

fgl1基因：

上游引物：5’-aggaggatggactgtaat-3’(seqidno.9)；下游引物：5’-tggtcaagaagtgaagatt-3’(seqidno.10)。

csf3基因：

上游引物为5’-cctgctcaagtgcttaga-3’(seqidno.11)；下游引物为5’-ctcactcaccagcttctc-3’(seqidno.12)。

(2)配制20μlpcr反应体系：

利用tiangen公司的superrealpremixplus试剂盒。2×superrealpremixplus10μl，上游(下游)引物0.6μl，cdna模板2μl，50×roxreferencedye2μl，ddh2o4.8μl。

(3)pcr反应条件：95℃15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)进行40个循环，之后95℃15s，60℃60s，95℃15s。以sybrgreen作为荧光标志物，在abi7300型荧光定量pcr仪上进行pcr反应，通过熔解曲线分析和电泳确定目的条带，2-^δδct法进行相对定量。

5、结果

如图1所示，与癌旁组织相比，肺腺癌组织中col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1的基因表达量均显著升高，分别为癌旁组织的27.9倍、15倍、32倍、26倍、147倍，而csf3的基因表达量显著降低，差异均具有统计学意义(p<0.05)，表明col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1对肺腺癌的诊断具有指导意义，有望成为临床或健康筛查肺腺癌的分子靶标。

实施例2候选基因roc曲线分析

1、roc曲线分析

使用r语言的proc包分析col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2、fgl1和csf3的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，绘制roc曲线，计算曲线下面积。

2、结果

结果如表1所示，col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1进行不同组合联用时，auc值均比单个基因的auc值高，其中将这五种基因联合应用时，auc值最高，为0.982764，表明候选基因联合诊断时，准确率高，提示可将col17a1、igf2bp3、aoc1、onecut2或fgl1联合用于肺腺癌的诊断。

表1候选基因联合应用的auc值

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110>北京泱深生物信息技术有限公司

<120>分子靶标在肺腺癌联合诊断中的应用

<160>12

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