用于分子成象和治疗的靶向造影剂或靶向治疗剂的制作方法

专利名称：用于分子成象和治疗的靶向造影剂或靶向治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及靶向造影剂和靶向治疗剂及其制备方法和用途。
在医学诊断中具有极其重要作用的已知成象技术是正电子发射断层扫描(PET)、计算机断层摄影(CT)、磁共振成象(MRI)、单光子计算机断层摄影(SPECT)和超声(US)。尽管当今的成象技术已被很好地开发，但是它们大多依赖于将正常组织和病理组织相区别的非特异的、肉眼可见的、物理的、生理的或代谢的改变。
靶向分子成象(MI)有可能在医疗诊断中达到新的高度。术语“靶向”涉及在体外或体内天然或合成的配体(结合剂)与感兴趣的分子(分子靶)选择性和高特异性结合。
MI是快速兴起的生物医学研究学科，其可被定义为在完整的活生物体内在细胞和亚细胞水平生物过程的可视呈现、特征描述以及定量。这是一个新的多学科领域，其中所产生的图象反映在生理真实环境下所表现出的疾病的细胞和分子途径以及体内机制，但是它们不确定作为疾病原因的分子事件。
目前已知一些不同的造影增强剂，它们的非特异或非靶向形式已用于临床常规中。以下提及的一些实例已在文献中报道。
例如，根据W.Krause的“Contrast Agents I”(Springer Verlag2002，第1页和后续页)，Gd复合物可用作MRI的造影剂。此外，超顺磁颗粒是造影增强剂的另一实例，其也可用作MRI的造影剂(Textbook of Contrast Media，Superparamagnetic Oxides，Dawson，Cosgrove and Grainger Isis Medical Media Ltd，1999，第373页及后续页)。如在W.Krause的“Contrast Agents II”(Springer Verlag 2002，第73页及后续页)所述，可以以类似的方式将充气的微泡用作超声造影剂。此外，W.Krause的“Contrast Agents II”(Springer Verlag，2002，第151页及后续页)报道了碘化脂质体或脂肪酸作为X-射线成象造影剂的用途。
可用于功能成象的造影增强剂主要开发用于PET和SPECT。
这些造影剂的一个实例是18F-标记的分子如脱氧葡萄糖(Beuthien-Baumann B等，(2000)，Carbohydr.Res.，327，107)。这些标记分子作为PET造影剂的用途在W.Krause的“Contrast Agents II”(Springer Verlag，2002，第201页及后续页)中已描述。然而，它们仅在肿瘤组织中累积而没有任何在先的特异性细胞相互作用。此外，99Tc-标记的分子如抗体或肽可用作SPECT的靶向造影剂(VerbruggenA.M.，Nosco D.L.，Van Nerom CG.等，99mTc-L，L-ethylene dicysteinearenal imaging agent，Nucl.Med.1992，33，551-557)，但是这些复杂分子的标记非常困难且费用昂贵。
关于一些其它已存在的用于PET/SPECT的配体，可以说情况相同，所述配体例如L-DOPA(多巴胺受休，帕金森氏症)(Luxen A.，Guillaume M，Melega WP，Pike VW，Solin O，Wagner R，(1992)Int.J.Rad.Appl.Instrum.B 19，149)；5-羟色胺类似物(5-羟色胺受体)(Dyck CH等，2000，J.Nucl.Med.，41，234)；促生长素抑制素类似物(促生长素抑制素，肿瘤学)(Maecke，H.R.等，Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging，2004，Mar.17)，整联蛋白受体的肽(血管发生)(Wicklinde，S.A.等，Cancer Res.，2003Sep.15，63(18)，5838-43；Wicklinde，S.A.等，Circulation 2003Nov.4，108，(18)，2270-4)。
此外，Cu-催化的咪唑和芳基硼酸的反应(例如Collman，Zhong，Organic Letters，2000，vol.2，no.9，1233-1236)也有报道。
然而，对作为疾病原因的特异性分子事件的确定在医学中变得越来越重要。因此，具备分子识别机制以在体内或体外在某些组织中特异性富集造影增强材料并能够洞悉分子病理的靶向剂在诊断以及进一步的治疗中是必不可少的。
因此，本发明的目的是提供允许高灵敏度和特异性的早期诊断以及鉴别诊断的新一代的改进的造影剂，以及提供更便宜且省时的制备所述改进的造影剂的方法。在该方面，这对于提供制备方法和由此制备的靶向剂也将是有益的，其可容易地适于那些必需在短时间内且以低成本和人力解决的实际发生的问题。除了它们用于成象诊断的可能，靶向造影剂在新治疗剂的开发中也将具有重要的作用。这样的靶向造影剂目前还不可获得。
通过以下描述的发明内容以及在权利要求和实施例中进一步定义的内容，本发明的目的被有利地解决。优选地，非限制性变体在附图中描述并用于解释本发明。
本发明涉及靶向造影剂或治疗剂的制备方法，所述方法包括以下步骤a)提供核心；b)任选地向所述核心加壳；c)通过连接至少一分子的结合单元对所述核心或所述壳进行修饰；和d)通过使用适当的催化剂将至少一个配体与修饰的核心或修饰的壳连接，所述配体具有至少一个咪唑官能团。
在所述方法的其它实施方案中，在步骤b)中，向所述核心加多于一个壳。换言之，通过一个至若干个内壳将外壳与核心分开。在本发明的优选实施方案中，可通过1至100个内壳，更优选通过1至50个内壳将所述核心与外壳分开。所述壳或多个壳可具有单层或多层。这些壳(在本发明的优选实施方案中其可含有单层或多层适当的材料)中的每一个的厚度为约0.5nm至100nm。在本发明的优选实施方案中，各壳的厚度为约0.5nm至50nm。另外，各壳或甚至若干个壳可具有相同的材料或不同的材料。
在本发明的另一变体中，所述壳或多个壳可以至少部分地覆盖所述核心。当例如将有机聚合物(例如聚乙二醇/PEG、聚乙烯醇/PVA、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚脲)、具有官能端基的有机聚合物(例如1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)2000]铵盐)、生物聚合物(例如多糖如葡聚糖、木聚糖、糖原、果胶、纤维素，或者多肽如胶原、球蛋白)、半胱氨酸或半胱氨酸含量高的肽或磷脂用作壳或多个壳时，这是优选的例子。在本发明中，向所述核心加壳的步骤是指完全包围所述核心、仅覆盖一些独特的区域，并且优选这些情况之间的所有范围。
对本发明的制备靶向造影剂或靶向治疗剂的方法的有利变体在所附的权利要求中被定义。
具体地，本发明提供一些特定的有利变体，如下所述“核心”适于用作本发明的靶向造影剂的造影增强部分和/或治疗部分的材料。因为用作连接单元的多肽的特定结构，所以所述核心与配体之间具有共价键和离子键。
“壳或多个壳”能够使靶向造影剂具有好的分散性，能够降低其毒性或能够防止副作用的材料，其取决于用作壳的材料。如果纳米微粒被用作所述核心，使用适当的壳(例如ZnS壳)可以降低纳米微粒的表面缺陷的数量。这些缺陷相当大地降低了由纳米微粒所产生的对比。因此，缺陷的数量的减少产生更好的靶向造影增强剂。
在本发明中，“核心”和“修饰的核心”可作为同义词使用，“修饰的核心”是由至少一个连接的结合单元修饰的核心。
在本发明中，“壳或多个壳”和“修饰的壳或多个壳”可作为同义词使用，“修饰的壳”是由至少一个连接的结合单元修饰的壳。
在本发明中，“结合单元”理解为至少一分子的芳基硼酸、超价(hypervalent)芳基硅氧烷或碘苯。在本发明的优选实施方案中，壳、修饰的壳和修饰的核心的组合是结合单元(例如由PEG壳部分覆盖的修饰的核心、由PEG壳部分覆盖以及由与芳基硼酸连接的羧酸修饰的壳部分覆盖的核心)。
在本发明中，“配体”的表述可用作结合剂或优选地用作生物学活性配体的同义词。
在本发明中，“适当的催化剂”是例如Cu系催化剂。所述催化剂使得优选在温和的条件下通过共价地将具有至少一个组氨酸单元(例如聚-HIS标签)的配体与同核心或加于核心的壳或多个壳连接的芳基硼酸、超价芳基硅氧烷或碘苯连接来合成靶向造影剂。
“温和条件”理解为指本领域公知的条件，在该条件下所述配体将分别保持其活性和特异性，所述条件例如为在水溶液或血液或血清样溶液、生理pH值和室温下。
本发明还涉及靶向造影剂和靶向治疗剂及其用途。
所述靶向造影剂具有以下特征，其作为非限制性实例描述本发明。
取决于造影增强材料，所述靶向造影剂可以应用于不同的成象方法例如MRI、US、SPECT、CT、PET、光学成象或多模态方法(multimodalit approach)如PET/CT中。
所述靶向造影剂含有造影增强核心(例如磁纳米微粒)或治疗核心，其可以被一个或多个壳所覆盖以改善稳定性和/或生物相容性和/或降低体内毒性(例如PEG壳)。
如果将纳米微粒用作所述核心，那么这些微粒的大小可以从约1nm至200nm变化。在本发明的优选实施方案中，所述微粒的大小可从1nm至100nm变化。
如果将聚合物用作壳，那么这些聚合物的分子量可从200g/mol至200000g/mol变化。在本发明的优选实施方案中，这些聚合物的分子量可从200g/mol至100000g/mol变化。
所述靶向造影剂含有靶向配体。
在另一个实施方案中，所述靶向造影剂或靶向治疗剂含有与配体连接的修饰的核心或修饰的壳或多个壳。
所述靶向造影剂含有能够在体内或体外特异性地识别靶分子的配体。
本发明的其中通过硼酸、超价芳基硅氧烷或碘苯与组氨酸的催化反应而将所述修饰的核心或所述修饰的壳或多个壳与配体(结合剂)共价地键合的靶向造影剂的合成的一个优点是通过该反应形成的键特别稳定，甚至在体内也特别稳定。因此，配体和修饰的核心在体内保持连接，避免了不期望区域(例如组织)的对比。
所述的在修饰的核心或修饰的壳或多个壳与配体之间的键可以在于水介质中的温和反应条件下产生，所述水介质允许配体保持其完全的生物学活性。这是可能的，因为可以在室温下在水中通过铜催化剂催化该反应，并且因为修饰的核心或修饰的壳或多个壳和所得的靶向造影剂是水或血液或而清溶性的。这些温和的反应条件使得所述配体不变性。
修饰的核心或修饰的壳或多个壳与配体的“连接”可以通过使用合成地与所述配体连接的聚组氨酸标签(“HIS标签”一段6个组氨酸氨基酸序列)来实现。生物分子如肽、蛋白、酶和抗体通常常规地与组氨酸标签一起合成，所述组氨酸标签通过例如亲和层析帮助纯化这些生物分子。本发明可以使用这些聚组氨酸标签将至少一个配体与所述修饰的核心或修饰的壳或多个壳连接。因此，不需要对所述配体加额外的标签。配体的合成因而得以简化。此外，在所述配体合成之后，不必在另外的纯化步骤中将在合成后连接于所述配体的组氨酸标签消化或切掉。
可以位点特异性地，例如在HIS标签位点进行修饰的核心或修饰的壳或多个壳与所述配体的“连接”。因此，所述配体的识别中心将保持其活性。因为可以以受控和选择性的方式将聚组氨酸标签固定在配体上的任意位置(例如选择性地在氨基酸序列的任意给定氨基酸上，作为配体)，所以所述配体保持其活性，从而避免了配体的失活并由此也避免了修饰的核心或修饰的壳或多个壳与配体中不期望的位点的连接。
也可将所述方法转变为靶向治疗剂。本发明中所述的方法具有适用于任何配体和任何核心的可能，因为温和的反应条件，提供了非常多样化且易于适用的用于制备任何类型的靶向造影剂或靶向治疗剂的系统。


图1中示意了本发明的靶向造影剂的最优选的变体。
附图简述图1-核心(1)例如(但不限于)造影增强材料；或治疗材料，用于-MRI例如(但不限于)铁、反铁、亚铁磁或超顺磁材料，例如铁(Fe)、氧化铁γ-Fe2O3或Fe3O4或具有尖晶石结构MFe2O4(M＝Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Cd)的铁氧体或具有石榴石结构M3Fe5O12(M＝Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu)的铁氧体或具有磁铅石结构MFe12O19(M＝Ca、Sr、Ba、Zn)的铁氧体或其它六角晶系铁氧体结构如Ba2M2Fe12O22(M＝Mn、Fe、Co、Ni、Zn、Mg)；在所有情况中所述核心都可以掺杂额外0.01至5.00mol％的Mn、Co、Ni、Cu、Zn或F；-顺磁离子(例如镧系元素、锰、铁、铜)系造影增强单元，例如钆螯合物如Gd(DTPA)、Gd(BMA-DTPA)、Gd(DOTA)、Gd(DO3A)；寡聚结构；大分子结构，例如白蛋白Gd(DTPA)20-35、葡聚糖Gd(DTPA)、Gd(DTPA)-24-级联聚合物、聚赖氨酸-Gd(DTPA)、MPEG聚赖氨酸-Gd(DTPA)；树枝状结构的镧系元素系造影增强单元；锰系造影增强单元，例如Mn(DPDP)、Mn(EDTA-MEA)、聚-Mn(EED-EEA)和聚合物结构；作为顺磁离子载体的脂质体，例如脂质体Gd(DTPA)；非质子显象剂；-发光的(optical)例如(但不限于)发光材料，例如纳米无机发光材料(例如掺杂YPO4或LaPO4的稀土)或半导体纳米晶体(称作量子点；例如CdS、CdSe、ZnS/CdSe、ZnS/CdS)；碳菁染料；四吡咯系染料(卟啉、二氢卟酚、酞菁及相关结构)；δ-氨基乙酰丙酸；荧光镧系元素螯合物；荧光素或5-氨基荧光素或异硫氰酸荧光素(FITC)或其它荧光素相关的荧光体(fluorophor)如Oregon Green、萘并荧光素(naphthofluorescein)；-US例如(但不限于)壳(例如蛋白、脂质、表面活性剂或聚合物)包封气体(例如空气、全氟丙烷、十二氟碳(dodecafluorocarbon)、六氟化硫、全氟化碳)泡(例如来自Amersham的Optison，来自Schering的Levovist)；壳(例如蛋白、脂质、表面活性剂或聚合物)包封微滴；纳米微粒(例如铂、金、钽)；-X-射线例如(但不限于)碘化造影增强单元，例如2，4，6-三碘苯的离子和非离子衍生物；硫酸钡系造影增强单元；金属离子螯合物，例如钆系化合物；具有高比例碘的硼簇；聚合物，例如碘化多糖，聚三碘苯(polymeric triiodobenzene)；来自具有低水溶性的碘化化合物的颗粒；含有碘化化合物的脂质体；碘化脂质(iodinated lipid)如甘油三酯、脂肪酸；-PET例如(但不限于)11C、13N、15O、66/8Ga、60Cu、52Fe、55Co、61/2/4Cu、62/3Zn、70/1/4As、75/6Br、82Rb、86Y、89Zr、110In、120/4I、122Xe和18F系示踪物，例如18F-FDG(葡萄糖代谢)；11C-甲硫氨酸、11C-酪氨酸、18F-FMT、18F-FMT或18F-FET(氨基酸)；18F-FMISO、64Cu-ATSM(低氧)；18F-FLT、11C-胸苷、18F-FMAU(增殖)；-SPECT例如(但不限于)基于放射性核素(radionucleotide)如99mTc、123/5/131I、67Cu、67Ga、111In、201Tl的造影增强单元；-治疗材料例如(但不限于)毒素、放射性同位素和化疗剂；发射UV-C的纳米微粒，例如YPO4:Pr；光动力学治疗(PDT)剂，例如基于扩展(expanded)卟啉结构的化合物；用于放疗的核素，例如157Sm、177Lu、212/3Bi、186/8Re、67Cu、90Y、131I、114mIn、At、Ra、Ho；-智能(Smart)造影增强单元，例如(但不限于)化学交换饱和迁移(chemical exchange saturation transfer，CEST)；热敏MRI造影剂(例如脂质体)；pH敏感的MRI造影剂；氧压或酶反应性MRI造影剂；金属离子浓度依赖性MRI造影剂；-多模态以上的组合-壳或多个壳(2)例如(但不限于)可包括羧酸、酰基卤、胺、酸酐、活性酯、马来酰亚胺、异硫氰酸酯、金、SiO2、聚磷酸盐(例如聚磷酸钙)、氨基酸(例如半胱氨酸)、有机聚合物(例如聚乙二醇/PEG、聚乙烯醇/PVA、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚脲)、有机官能聚合物(例如1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)2000]铵盐)、生物聚合物(例如多糖如葡聚糖、木聚糖、糖原、果胶、纤维素，或者多肽如胶原、球蛋白)、半胱氨酸或半胱氨酸含量高的肽或磷脂。
-向核心加一个至若干个壳，优选为1至100个壳(2)，更优选为1至50个内壳。这些壳(在本发明的优选实施方案中其可具有单层或多层适当的材料)中的每一个的厚度为约0.5nm至100nm。在本发明的优选实施方案中，各壳的厚度为约0.5nm至500nm且可由不同的材料或相同的材料制成。此外，所述壳能够至少部分地覆盖所述核心。
-结合单元或多个结合单元(3)例如(但不限于)芳基硼酸、含有芳基硼酸官能团的壳，所述芳基硼酸官能团介导与生物配体(例如抗体或抗体片段、肽、小分子)的组氨酸单元(例如聚-HIS标签)共价偶联；例如(但不限于)超价芳基硅氧烷、含有超价芳基硅氧烷的壳，所述超价芳基硅氧烷介导与生物配体(例如抗体或抗体片段、肽、小分子)的组氨酸单元(例如聚-HIS标签)共价偶联例如(但不限于)碘苯、含有碘苯的壳或至少一个与壳键合的碘苯，所述碘苯介导与生物配体(例如抗体或抗体片段、肽、小分子)的组氨酸单元(例如聚-HIS标签)共价偶联。
此外，还可以加入其它生物分子例如蛋白(如HIV标签肽等)以使完整的装配通过例如细胞膜，增加生物相容性或降低毒性。
-配体(4)-例如(但不限于)配体，所述配体经其特异性识别机制(例如通过抗原抗体反应)在感兴趣的不同组织或靶区诱导造影剂的富集-例如(但不限于)连接有聚-HIS标签的配体-靶向单元可以是-例如(但不限于)抗体(单克隆、多克隆、鼠、鼠-人嵌合、人、单链、双功能抗体(diabody)等)，例如曲司佐单抗(乳癌)、利妥西单抗(非何杰金淋巴瘤)、阿米佐单抗(慢性淋巴细胞性白血病)；吉姆佐单抗(急性髓性白血病(acute myelogene leukemia))；依决洛单抗(结肠癌)；替依莫单抗(非何杰金淋巴瘤)；塞托西单抗(结肠癌)；托西莫单抗(非何杰金淋巴瘤)；依哌佐单抗(非何杰金淋巴瘤)；贝伐佐单抗(肺癌和结肠癌)；抗-CD33(急性髓性白血病)；Pemtumomab(卵巢癌和胃癌)；米托莫单抗(Mittumomab)(肺癌和皮肤癌)；抗-MUC1(腺癌)；抗-CEA(腺癌)；抗-CD64(斑(plaque))等。
-例如(但不限于)肽、多肽、肽模拟物，例如促生长素抑制素类似物、血管活性肽类似物、神经肽Y、RGD肽等。
-例如(但不限于)蛋白，例如Annexin V、组织纤溶酶原激活物蛋白、转运蛋白等。
-例如(但不限于)大分子，例如透明质酸(hyaluronan)、apcitide、硫酸皮肤素-例如(但不限于)核酸，例如apatamers、反义DNA/RNA/PNA，小干扰RNAs等。
-例如(但不限于)脂质，例如磷脂等。
-例如(但不限于)凝集素，例如白细胞刺激凝集素-例如(但不限于)糖类-催化剂-例如(但不限于)催化芳基硼酸官能团与咪唑官能团反应并使具有反应窗，在该反应窗中生物配体在偶联反应中不被破坏(例如水溶液，pH＝7，室温)，例如[Cu(OH)TMEDA]2Cl2；(TMEDA＝四甲基乙二胺)，参见例如Collman，Zhong，Zeng，Costanza，J.Org.Chem.，2001，66，1528-1531。
-例如(但不限于)催化超价芳基硅氧烷与咪唑官能团反应并使具有反应窗，在该反应窗中生物配体在偶联反应中不被破坏，例如Cu(AcO)2，参见例如Lam，Deudon，Averill，Li，He，DeShong，Clark，J.Am.Chem.Soc，2000，122，7600-7601。
-例如(但不限于)催化碘苯与咪唑官能团反应，例如[Cu(OH)TMEDA]2Cl2，参见例如Lam，Deudon，Averill，Li，He，DeShong，Clark，J.Am.Chem.Soc，2000，122，7600-7601。
-靶向造影剂或治疗剂(5)-例如(但不限于)由造影增强或治疗核心、具有不同官能团的壳、偶联单元(苯基咪唑)和特异性靶向配体组成。
图2用苯基硼酸对造影增强单元(COOH包覆的CdSe/ZnS量子点)进行表面修饰的反应路线，通过羧酸的一锅法反应，将1-乙基-3(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸(EDC)与核心连接，形成o-酰基异脲(o-acylisourea)中间体(室温，pH≈5)。该中间体与N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)反应，得到N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯中间体。通过加入2-巯基乙醇终止过量的EDC反应。最后，与3-氨基苯基硼酸反应，得到所期望的酰胺键(r.t.，pH≈7)。
图3根据Collmann等(J.Org.Chem.，2001，66，1528-1531)进行的对甲苯硼酸与咪唑的偶联反应路线。
图4咪唑、对甲苯硼酸和偶联产物的吸光度作为250-500nm入射辐射波长(纳米)的函数进行测定(以任意单元)。所观察到的两种起始产物(咪唑和对甲苯硼酸)的UV/可见光谱与反应之后所得的偶联产物的光谱的差异证明在所期望的条件下发生了偶联。
图5氯仿、咪唑、对甲苯硼酸以及偶联产物的透射作为0cm-1-4000cm-1和1000cm-1-1500cm-1入射辐射波数(cm-1)的函数进行测定(以任意单元)。所观察到的溶剂(氯仿)、两种起始产物(咪唑和对甲苯硼酸)的FTIR光谱与反应之后所得的偶联产物的光谱的差异证明在所期望的条件下发生了偶联。
图6通过气相色谱分离1-(4-甲苯基)咪唑(由偶联反应获得)之后，通过质谱对咪唑、对甲苯硼酸和偶联产物所记录的信号强度作为质量的函数(m/z单元)进行测定(以任意单元)。对甲苯硼酸与咪唑在期望条件下偶联获得的1-(4-甲苯基)咪唑的GC/MS谱与波谱文库中存在的1-(3-甲苯基)咪唑的GC/MS谱类似，证明获得了所期望的偶联产物。
图7通过NMR对咪唑、对甲苯硼酸和偶联产物的信号强度作为化学位移(ppm)的函数进行测定。所观察到的溶剂(氯仿)、两种起始产物(咪唑和对甲苯硼酸)的NMR谱与反应之后所得的偶联产物的光谱的差异证明在期望的条件下发生了偶联。
图8对甲苯硼酸与(His)6-Ahx-FITC偶联的反应路线，在室温下通过Cu(OH)TMEDA]2Cl2催化过夜，经对甲苯硼酸与(His)6-Ahx-FITC标签的组氨酸单元反应进行。
图9通过MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离飞行时间)质谱对反应后所得产物记录的信号强度作为质量的函数(m/z单元)进行测定(以任意单元)。对甲苯硼酸与(His)6-Ahx-FITC偶联反应之后所得产物的MALDI-TOF谱证明了在期望的条件下发生了偶联。相应于所期望的偶联产物(对甲苯基-His6-Ahx-FITC)的m/z＝1433处的峰证明了该产物的形成。
图10苯硼酸对核心(18F-标记分子)进行修饰的反应路线，通过羧酸的一锅法反应，将1-乙基-3(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸(EDC)与造影增强单元连接，形成o-酰基异脲中间体(r.t.，pH≈5)。该中间体与N-羟基硫代琥珀酰亚胺反应，得到N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯中间体。通过加入2-巯基乙醇终止过量的EDC反应。最后，与3-氨基苯硼酸反应，得到所期望的酰胺键(r.t.，pH≈7)。
实施例实施例1通过使用在一个末端具有羧酸官能团并在另一个末端具有1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺官能团的水溶性聚合物通过酸用羧酸官能团对CdSe/ZnS量子点(核心)进行表面修饰。
COOH-包覆的量子点通过将以下混合(在50℃下，4小时)来获得-100μl CdSe/ZnS(在氯仿中，1w/v％)-100μl氯仿-200μl DPPC(5mM)-DPPC＝1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱-200μl DSPE-PEG2000-COOH(5mM)-DSPE-PEG2000-COOH1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)2000]铵盐，最后通过真空去除氯仿，并通过超声处理来分散于水中的COOH-包覆的量子点。
通过1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺端基经疏水相互作用(或吸附)，1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)2000]铵盐与纳米微粒的表面结合。此外，1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)2000]铵盐还提供羧基官能团，其在酸性pH下质子化，获得羧酸。
DPPC可用作假剂(dummy)(或间隔物(spacer))以在固定于纳米微粒上的COOH官能团之间留有间隔。实际上，仅通过COOH官能团对整个纳米微粒表面进行覆盖由于产生相互作用而可能具有不利的效果，因而在不期望的机体组织或不期望的机体区产生对比。
1)使用苯硼酸对壳进行表面修饰可经羧酸通过偶联用硼酸官能团对造影增强单元进行表面修饰。
其它的实例可以是，例如通过活性酯、通过马来酰亚胺或通过异硫氰酸酯进行偶联。
这通过对水溶性CdSe/ZnS量子点进行修饰而实验地完成-55μl水-40μl 10x PBS溶液(PBS＝磷酸缓冲盐水∶0.01M磷酸缓冲液，0.0027M氯化钾，0.137M氯化钠，pH7.4)-100μl 0.1M EDC溶液(EDC＝1-乙基-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸)-5μl 20mM N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液(N-羟基硫代琥珀酸亚安钠盐)-200μl 2μM CdSe/ZnS(端COOH)溶液-室温温育(30min)-10μl 2-巯基乙醇-混合15分钟-50μl 20mM 3-氨基苯丙酸溶液-室温混合(2小时)-通过离心分离QDs。
反应路线，参见图2。
1)对甲苯硼酸与咪唑的偶联作为起始步骤，成功地重复了文献中所述的甲苯硼酸与咪唑的反应。根据Collmann等(J.Org.Chem.，2001，66，1528-1531)进行进行合成。
反应路线，参见图3。
2)对甲苯硼酸与(His)6-Ahx-FITC的偶联可采用苯硼酸与咪唑的催化反应用于进行苯硼酸与具聚-HIS标签的肽的反应，其可通过实验证明合成-19μl 100μM[Cu(OH)TMEDA]2Cl2溶液-38μl 1mM对甲苯硼酸溶液-31.9μl His6-Ahx-FITC(0.8mg/ml)(His6＝寡聚组氨酸；Ahx＝6-氨基己酸(6-amino hexacarbonic acid)；FITC＝异硫氰酸荧光素(IsomerIK)-1911.1μl水-在氧气氛下温育(室温过夜)反应路线，参见图4。
实施例2通过硼酸修饰的18F-标记的分子这通过实验完成-55μl水-40μl 10x PBS溶液(PBS＝磷酸缓冲盐水∶0.01M磷酸缓冲液，0.0027M氯化钾，0.137M氯化钠，pH 7.4)-100μl 0.1M EDC溶液(EDC＝1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸)-5μl 20mM N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液(N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐)-200μl 2μM F-18-L-DOPA溶液-室温温育(30分钟)-10μl 2-巯基乙醇-混合15分钟
-50μl 20mM m-氨基苯硼酸-室温混合(2小时)-通过离心去除副产物。
权利要求
1.靶向造影剂或治疗剂的制备方法，所述方法包括以下步骤a)提供核心；b)任选地向所述核心加壳；c)通过连接至少一分子的结合单元对所述核心或所述壳进行修饰；和d)通过使用适当的催化剂将至少一个配体与修饰的核心或修饰的壳连接，所述配体具有至少一个咪唑官能团。
2.根据权利要求1的方法，其中在步骤b)中向所述核心加多于一个壳。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述壳或多个壳具有单层或多层。
4.根据权利要求1-3之任一项的方法，其中各壳具有相同的材料或不同的材料。
5.根据权利要求1-4之任一项的方法，其中所述壳或多个壳至少部分地覆盖所述核心。
6.根据权利要求1-5之任一项的方法，其中用作所述核心的材料选自铁、反铁、亚铁磁或超顺磁材料，例如铁(Fe)、氧化铁γ-Fe2O3或Fe3O4或具有尖晶石结构MFe2O4(M＝Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Cd)的铁氧体或具有石榴石结构M3Fe5O12(M＝Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu)的铁氧体或具有磁铅石结构MFe12O19(M＝Ca、Sr、Ba、Zn)的铁氧体或其它六角晶系铁氧体结构如Ba2M2Fe12O22(M＝Mn、Fe、Co、Ni、Zn、Mg)；其中在所有情况中所述核心都可以掺杂额外0.01至5.00mol％的Mn、Co、Ni、Cu、Zn或F；顺磁离子(例如镧系元素、锰、铁、铜)系造影增强单元，例如钆螯合物如Gd(DTPA)、Gd(BMA-DTPA)、Gd(DOTA)、Gd(DO3A)；寡聚结构；大分子结构，例如白蛋白Gd(DTPA)20-35、葡聚糖Gd(DTPA)、Gd(DTPA)-24-级联聚合物、聚赖氨酸-Gd(DTPA)、MPEG聚赖氨酸-Gd(DTPA)；树枝状结构的镧系元素系造影增强单元；锰系造影增强单元，例如Mn(DPDP)、Mn(EDTA-MEA)、聚-Mn(EED-EEA)和聚合物结构；作为顺磁离子载体的脂质体，例如脂质体Gd(DTPA)；非质子显象剂。
7.根据权利要求1-5之任一项的方法，其中用作所述核心的材料选自发光材料，例如纳米无机发光材料(例如掺杂YPO4或LaPO4的稀土)或半导体纳米晶体(称作量子点；例如CdS、CdSe、ZnS/CdSe、ZnS/CdS)；碳菁染料；四吡咯系染料(卟啉、二氢卟酚、酞菁及相关结构)；δ-氨基乙酰丙酸；荧光镧系元素螯合物；荧光素或5-氨基荧光素或异硫氰酸荧光素(FITC)或其它荧光素相关的荧光体如OregonGreen、萘并荧光素。
8.根据权利要求1-5之任一项的方法，其中用作所述核心的材料选自包封气体(例如空气、全氟丙烷、十二氟碳、六氟化硫、全氟化碳)泡(例如来自Amersham的Optison、来自Schering的Levovist)；包封微滴；纳米微粒(例如铂、金、钽)。
9.根据权利要求1-5之任一项的方法，其中用作所述核心的材料选自碘化造影增强单元，例如2，4，6-三碘苯的离子和非离子衍生物；硫酸钡系造影增强单元；金属离子螯合物，例如钆系化合物；具有高比例碘的硼簇；聚合物，例如碘化多糖、聚三碘苯；来自具有低水溶性的碘化化合物的颗粒；含有碘化化合物的脂质体；碘化脂质如甘油三酯、脂肪酸。
10.根据权利要求1-5之任一项的方法，其中用作所述核心的材料选自11C、13N、15O、66/8Ga、60Cu、52Fe、55Co、61/2/4Cu、62/3Zn、70/1/4As、75/6Br、82Rb、86Y、89Zr、110In、120/4I、122Xe和18F系示踪物，例如18F-FDG(葡萄糖代谢)；11C-甲硫氨酸、11C-酪氨酸、18F-FMT、18F-FMT或18F-FET(氨基酸)；18F-FMISO、64Cu-ATSM(低氧)；18F-FLT、11C-胸苷、18F-FMAU(增殖)。
11.根据权利要求1-5之任一项的方法，其中用作所述核心的材料选自基于放射性核素如99mTc、123/5/131I、67Cu、67Ga、111In、201Tl的造影增强单元。
12.根据权利要求1-5之任一项的方法，其中用作所述核心的材料选自毒素、放射性同位素和化疗剂；发射UV-C的纳米微粒，例如YPO4:Pr；光动力学治疗(PDT)剂，例如基于扩展卟啉结构的化合物；用于放疗的核素，例如157Sm、177Lu、212/3Bi、186/8Re、67Cu、90Y、131I、114mIn、At、Ra、Ho。
13.根据权利要求1-5之任一项的方法，其中用作所述核心的材料选自化学交换饱和迁移(CEST)；热敏MRI造影剂(例如脂质体)；pH敏感的MRI造影剂；氧压或酶反应性MRI造影剂；金属离子浓度依赖性MRI造影剂。
14.根据权利要求1-13之任一项的方法，其中用作所述核心的材料是两种或多种材料的组合。
15.根据权利要求1-14之任一项的方法，其中用作所述壳或多个壳的材料选自羧酸、酰基卤、胺、酸酐、活性酯、马来酰亚胺、异硫氰酸酯、金、SiO2、脂质、表面活性剂、聚磷酸盐(例如聚磷酸钙)、氨基酸(例如半胱氨酸)、有机聚合物(例如聚乙二醇/PEG、聚乙烯醇/PVA、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚脲)、具有官能端基的有机聚合物(例如1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)2000]铵盐)、生物聚合物(例如多糖如葡聚糖、木聚糖、糖原、果胶、纤维素，或者多肽如胶原、球蛋白)、半胱氨酸或半胱氨酸含量高的肽或磷脂。
16.根据权利要求1-15之任一项的方法，其中可将其它成分加入所述壳或多个壳中。
17.根据权利要求1-16之任一项的方法，其中所述结合单元是芳基硼酸、含有芳基硼酸官能团的壳或至少一个键合于壳的、与配体的组氨酸单元共价偶联的芳基硼酸。
18.根据权利要求1-16之任一项的方法，其中所述结合单元是超价芳基硅氧烷、含有超价芳基硅氧烷酸官能团的壳或至少一个键合于壳的、与配体的组氨酸单元共价偶联的超价芳基硅氧烷。
19.根据权利要求1-16之任一项的方法，其中所述结合单元是碘苯、含有碘苯官能团的壳或至少一个键合于壳的、与配体的组氨酸单元共价偶联的碘苯。
20.根据权利要求1-17之任一项的方法，其中所述核心或所述壳或多个壳和至少一个配体通过芳基硼酸和组氨酸单元之间的共价偶联相连接。
21.根据权利要求1-16和18之任一项的方法，其中所述核心或所述壳或多个壳和至少一个配体通过超价芳基硅氧烷和组氨酸单元之间的共价偶联相连接。
22.根据权利要求1-16和19之任一项的方法，其中所述核心或所述壳或多个壳和至少一个配体通过碘苯和组氨酸单元之间的共价偶联相连接。
23.根据权利要求1-22之任一项的方法，其中用作配体的材料选自抗体(单克隆、多克隆、鼠、鼠-人嵌合、人、单链、双功能抗体等)，例如曲司佐单抗(乳癌)、利妥西单抗(非何杰金淋巴瘤)、阿米佐单抗(慢性淋巴细胞性白血病)；吉姆佐单抗(急性髓性白血病)；依决洛单抗(结肠癌)；替依莫单抗(非何杰金淋巴瘤)；塞托西单抗(结肠癌)；托西莫单抗(非何杰金淋巴瘤)；依哌佐单抗(非何杰金淋巴瘤)；贝伐佐单抗(肺癌和结肠癌)；抗-CD33(急性髓性白血病)；Pemtumomab(卵巢癌和胃癌)；米托莫单抗(肺癌和皮肤癌)；抗-MUC 1(腺癌)；抗-CEA(腺癌)；抗-CD64(斑)；肽、多肽、肽模拟物，例如促生长素抑制素类似物、血管活性肽类似物、神经肽Y、RGD肽；蛋白，例如Annexin V、组织纤溶酶原激活物蛋白、转运蛋白；大分子，例如透明质酸、apcitide、硫酸皮肤素；核酸，例如apatamers、反义DNA/RNA/PNA、小干扰RNAs；脂质，例如磷脂；凝集素，例如白细胞刺激凝集素以及糖类。
24.根据权利要求1-23之任一项的方法，其中用于连接至少一个配体与所述修饰的核心或所述修饰的壳的催化剂是[Cu(OH)TMEDA]2Cl2或Cu(AcO)2。
25.根据权利要求1-17、19、20、22-24之任一项的方法，其中用于催化芳基硼酸官能团或碘苯官能团与咪唑官能团反应的催化剂是[Cu(OH)TMEDA]2Cl2。
26.根据权利要求1-16、18、21、23和24之任一项的方法，其中用于催化超价芳基硅氧烷和咪唑官能团反应的催化剂是Cu(AcO)2。
27.靶向造影剂，其包含核心、至少一个壳和至少一个配体。
28.靶向造影剂或靶向治疗剂，其通过权利要求1-26之任一项的方法制备。
29.权利要求27和28的靶向造影剂或靶向治疗剂，其用于诊断或治疗。
30.权利要求27和28的靶向造影剂或靶向治疗剂，其用于靶向分子成象。
31.权利要求27和28的靶向造影剂，其用于CT、MRI、PET、SPECT或US。
32.权利要求27和28的靶向造影剂或靶向治疗剂用于制备适于诊断或治疗的化合物的用途。
33.权利要求27和28的靶向造影剂或靶向治疗剂用于制备适于靶向分子成象的化合物的用途。
34.权利要求27和28的靶向造影剂用于制备适于CT、MRI、PET、SPECT或US的化合物的用途。
全文摘要
本发明公开了用于分子成象以及靶向诊断和治疗的靶向造影剂的合成方法，本发明还公开了靶向造影剂和靶向治疗剂及它们的用途。
文档编号A61K51/00GK101080240SQ200580043039
公开日2007年11月28日 申请日期2005年12月12日 优先权日2004年12月17日
发明者H·胡梅尔, V·U·魏勒, R·霍夫曼 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司