一种降解多环芳烃污染物的混合菌系及应用方法与流程

本发明涉及微生物应用领域，尤其涉及可修复多环芳烃污染土壤或水体的混合菌系及用途。

背景技术：

多环芳烃（polycyclicaromatichydrocarbons，pahs）是指由两个或两个以上苯环以稠环形式相连的化合物，是一类广泛存在于环境中的具有致癌、致畸、致突变性的持久性有机污染物。pahs的主要特征是疏水性高、性质稳定，易吸附到土壤固体颗粒上形成难以降解的持久性污染物，造成高分子量pahs在土壤环境中的大量累积，严重危害着土壤的生产和生态功能，进而影响农产品质量和人类健康。近年来，土壤中pahs的积累已经越来越严重地威胁着人类的健康，因此受到人们的广泛关注，目前已被国内外列位有机污染的研究重点。

土壤pahs的修复主要有物理修复、化学修复和生物修复。生物修复相对于物理和化学修复具有费用低、效果好、不产生二次污染等优点，越来越受到国内外研究者的关注。微生物修复是研究得最早、最深入、应用最为广泛的一种生物修复方法，它利用自然环境中的土著微生物或特效外源微生物的代谢活动，在人为优化的环境条件下加速对环境中污染物的转化、降解与去除。微生物的降解也是污染土壤原位修复的主要途径。如何筛选高效的降解菌，有效发挥微生物的活性是微生物修复技术的关键。

近年来，国内外对降解pahs的微生物进行了广泛的研究，但是单菌株的降解能力有限，构建菌群可以扩大底物利用范围，并且可通过菌株间的协同作用，提高对pahs的降解率。同时合理应用强化措施可以显著提高菌群对土壤pahs的降解效果。这些措施通常包括添加营养物质增强降解菌活性，添加表面活性剂性提高污染物生物有效性，优化降解环境增加降解菌数量，以及固定化技术的应用等等。因此筛选能同时降解多种高低环pahs的菌株，构建可降解高环和低环多种pahs的降解菌群，并探究科学高效的强化措施具有十分重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述现有的降解多环芳烃存在的难题，提供一种高效的降解菌系及其应用方法，主要是在土壤或废水环境污染修复中用于降解多环芳烃。

本发明所提供的降解菌株从受多环芳烃污染的土壤中经过人工富集培养、分离纯化得到，来源于北京焦化厂厂区内受多环芳烃污染的土壤。

该混合菌系包括三株不同种属的纯菌rhodococcusrhodochrou、mycobacteriummonacense和mycobacteriumgilvum。

其中，mi(mycobacteriumgilvum)为浅黄分枝杆菌，在lb平板上菌落呈金黄色，圆形，表面凸起，干燥，不透明，边缘整齐。该菌株最适生长ph值为7，最适生长温度在30-37℃之间，最适生长盐度为0.1%-1%之间，对菲、芘、苯并[b]荧蒽等pah具有降解能力。该菌株于2015年6月1日保藏于北京朝阳区北辰西路1号院3号，即中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.10941，见zl201510390223.8。

zl7(mycobacteriummonacense)为分支杆菌属，在lb平板上菌落呈肉粉色，圆形，表面凸起，干燥，不透明，边缘整齐。该菌株最适生长ph值为7，最适生长温度在30-37℃之间，最适生长盐度为0.1%-1%之间，对菲、芘、苯并[b]荧蒽等pah具有降解能力。该菌株于2018年9月10日保藏于北京朝阳区北辰西路1号院3号，即中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.16445。

q3(rhodococcusrhodochrous)为玫瑰色红球菌，在lb平板上菌落呈淡红色，圆形，表面凸起，干燥，不透明，边缘整齐。该菌株最适生长ph值为7，最适生长温度在30-37℃之间，最适生长盐度为0.1%-1%之间，对菲、芘、苯并[b]荧蒽和苯并[a]芘等pah具有降解能力。该菌株于2018年9月10日保藏于北京朝阳区北辰西路1号院3号，即中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.16446。

包括该三株单菌的混合菌系对复合pahs有更好的降解效果，其中rhodococcusrhodochrou、mycobacteriummonacense和mycobacteriumgilvum三株纯菌的混合比例可优选0～2∶0～2∶0～2，更优选1∶2∶2。

该混合菌系的制备方法包括：将rhodococcusrhodochrou、mycobacteriummonacense和mycobacteriumgilvum分别接种至lb液体培养基至对数期，离心后弃去上清液，加入无机盐培养液洗涤，再次离心后弃上清液，收获菌体，然后将三种菌悬液混合制得菌系。

混合菌系固定化材料制备方法包括：将1g灭菌水稻杆生物炭/10ml降解菌系（m/v1:10）接种于灭菌玻璃容器后，置于37℃，80rmin^-1摇床中震荡培养48h完成浸泡固定化。容器中混合物的分离采用75µm筛网过滤实现。

固定化材料的微生物负载量为2.19×10¹⁰个/g-6.48×10¹⁰个/g；菌系投加量以固定化材料计算占污染土壤质量的为9%-11%；表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠（sdbs），所添加的sdbs与污染土壤的质量比为80mg/kg-120mg/kg；营养物质为葡萄糖，所添加的葡萄糖与污染土壤的质量比为180mg/kg-220mg/kg。

本发明菌株模拟降解实验所用无机盐培养基中菲、芘、苯并[b]荧蒽和苯并[a]芘浓度分别为50mgl^-1、50mgl^-1、10mgl^-1、50mgl^-1；pahs总量为160mgl^-1。优选混合菌系h6(q3:zl7:mi=1:2:2)培养8天后，对pahs总量的降解率可达59%。培养24天后，对土壤中pahs总量（255.47mgkg^-1）的降解率可达46%。三种强化措施同时施加培养24天后，对土壤中pahs总量（255.47mgkg^-1）的降解率可达75%。

该混合菌系还有较强的环境适应能力，可用于修复受高分子量pahs污染的土壤或水体。

附图说明

图1是三株单菌对四种典型多环芳烃单体的降解效果图。

图2是三株单菌拮抗实验结果图。

图3是混合菌系对四种典型多环芳烃总量的降解效果图。

图4是混合菌系对四种典型多环芳烃单体的降解效果图。

图5是固定化混合菌系复合材料扫描电镜图。

图6是混合菌系协同不同强化措施应用对土壤中多环芳烃的降解效果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1pahs降解菌rhodococcusrhodochrou、mycobacteriummonacense和mycobacteriumgilvum的降解性能分析与拮抗实验

拮抗实验步骤如下所述：将待试菌按所有可能组合两两接种于同一lb固体培养基，观察二者在生长过程中有无抑制圈存在。拮抗实验结果见图2。

将rhodococcusrhodochrou、mycobacteriummonacense和mycobacteriumgilvum分别接种至lb液体培养基培养至对数期，离心后弃去上清液，加入20ml无机盐培养液洗涤2次，再次离心后弃去上清液，收获菌体，将其菌悬液在600纳米的吸光度下(od600)均调整成为1-1.2之间的数值，以使菌悬液中的菌浓度达到几乎相同的数量级。此处的浓度并没有限制，将菌悬液调整成近似浓度，仅仅是为了方便菌系的配制。将所得纯菌种的菌悬液分别接种于含菲、芘、苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘的无机盐液体培养基中，接种量为10％，每个测定设五个重复，同时设置只加pahs不加菌液的对照组。培养基中苯并[b]荧蒽的初始浓度为10mgl^-1，菲、芘、苯并[a]芘的初始浓度均为50mgl^-1。于37℃，180rpm摇床中避光培养8天后测试残余pahs的浓度，计算降解率。降解率结果见图1。

无机盐培养基(msm)成分：kh2po45.5g、k2hpo46.0g、kcl2.0g、mgso4·7h2o0.2g、na2so42.0g、微量金属盐1.0ml(mnso439.9mg，znso4·h2o42.8mg，(nh4)moo2·4h2o34.7mg，蒸馏水1000ml)、蒸馏水1000ml、ph7.0。固体培养基再加15g琼脂粉。lb培养基成分为蛋白胨10g、酵母粉5g、nacl10g，蒸馏水1000ml。固体培养基再加15g琼脂粉。

pahs浓度测定步骤如下所述：将摇瓶中的整瓶样品进行残留多环芳烃的提取，加入丙酮和二氯甲烷混合溶液(体积比为1∶1)，用超声波清洗器超声萃取20min，静置分层后用分液漏斗进行水相和有机相的分离，共萃取两次后，合并萃取液并用旋转蒸发仪浓缩，用甲醇定容至1ml，过滤后待hplc测定。分析仪器为日立l-2000高效液相色谱仪，采用多环芳烃专用液相色谱分析柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇/水(90∶10)，流速为1mlmin^-1，检测波长为254nm，柱温为30℃，进样体积为20μl。

拮抗实验结果表明三株菌两两之间并无明显抑制作用。因此，可将这三株菌作为构建混合菌系的基础菌株。本实施例说明分离所得的三株高效pahs降解菌rhodococcusrhodochrou、mycobacteriummonacense和mycobacteriumgilvum可以利用三种多环芳烃菲、芘和苯并[b]荧蒽为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并且rhodococcusrhodochrou同时具有降解苯并[a]芘的能力。

实施例2混合菌系的构建和降解pahs的性能分析

试验1

将rhodococcusrhodochrou、mycobacteriummonacense和mycobacteriumgilvum按照实施例1的方法制备菌悬液，并按照体积比1∶2∶2的比例将rhodococcusrhodochrou、mycobacteriummonacense和mycobacteriumgilvum菌悬液混合，组合构建混合菌系h6，以10%（m/m）的接种量将混合菌系h6的菌悬液接种至含四种pahs的无机盐培养基中，菲、芘和苯并[a]芘的初始浓度设为50mgl^-1；苯并[b]荧蒽的初始浓度设为10mgl^-1，于37℃，180rpm摇床中避光振荡培养8天后测定其降解率，降解率测试结果表明，混合菌系h6对四种pahs（菲、芘、苯并[b]荧蒽和苯并[a]芘）的8天降解率分别可达68%、61%、56%、43%，相对于单菌的降解率均有显著提高。

试验2

用同样的方法构建混合菌系h1，并用同样的方法测试其降解率，不同的是混合菌系包括两株纯菌，mycobacteriummonacense和mycobacteriumgilvum菌悬液的混合体积比为1∶1。

试验3

用同样的方法构建混合菌系h2，并用同样的方法测试其降解率，不同的是混合菌系包括两株纯菌，rhodococcusrhodochrou和mycobacteriummonacense菌悬液的混合体积比为1∶1。

试验4

用同样的方法构建混合菌系h3，并用同样的方法测试其降解率，不同的是混合菌系包括两株纯菌，rhodococcusrhodochrou和mycobacteriumgilvum菌悬液的混合体积比为1∶1。

试验5

用同样的方法构建混合菌系h4，并用同样的方法测试其降解率，不同的是rhodococcusrhodochrou、mycobacteriummonacense和mycobacteriumgilvum菌悬液的混合体积比为1∶1∶1。

试验6

用同样的方法构建混合菌系h5，并用同样的方法测试其降解率，不同的是rhodococcusrhodochrou、mycobacteriummonacense和mycobacteriumgilvum菌悬液的混合体积比为2∶2∶1。

试验7

用同样的方法构建混合菌系h7，并用同样的方法测试其降解率，不同的是rhodococcusrhodochrou、mycobacteriummonacense和mycobacteriumgilvum菌悬液的混合体积比为2∶1∶2。

七种混合菌系对四种pahs的降解率如图3、图4所示。以上试验和数据说明，构建所得的混合菌系可同时降解四种pahs，具有更高的降解效率，并且降解菌之间产生了协同作用，比单独使用单个降解菌的效果要好。

实施例3混合菌系h6对污染土壤中16epapahs的降解

实验土样取自北京某焦化厂的污染原状土，将土样过筛后风干并混合均匀，经测试，该土壤样品中均有检出，美国环保署（epa）在1979年公布的优先监测16种pahs（16epapahs，表1）。本实验按实施例2的方法制备混合菌系h6并接种于该土壤中，接种比例为10%（m/m），土壤含水率保持为10%，于37℃，180rpm摇床中培养24天后，测定pahs降解率。

土壤中pahs含量测定方法如下所述：称取土样0.5g，无水硫酸钠2.0g，将土样与无水硫酸钠置于100ml烧杯中混和均匀后倒入ase萃取池中，加入25μl(40mgl^-1)的5种氘代物混合液作为替代物，再向萃取池中加入2.0g无水硫酸钠，然后盖紧萃取池盖子置于ase350中萃取，萃取溶剂采用二氯甲烷：丙酮=1:1的混合溶剂。萃取液在39℃水浴锅中完成浓缩与溶剂替换，溶剂替换为正己烷，过硅胶-氧化铝净化柱净化后，氮吹至1ml装入至色谱瓶，用gc-ms测定。于37℃，180rpm摇床中培养24天后，混合菌系h6对pahs总量降解率为46%，对低环pahs（萘到芘的含量之和）降解率为7%，对高环pahs（苯并蒽到苯并[g,h,i]苝）降解率为39%。

本实施例说明混合菌系h6对土壤中的pahs具有较高的降解效率，降解底物范围广，不仅可降解低环的pahs(如萘、菲、蒽、荧蒽、苊、芴等)，对高环的pahs(如苯并蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、二苯并[a,n]蒽、茚并[1,2,3-cd]芘等)也具有较高的降解率。

表1土壤样品中16epapahs的浓度统计表

实施例4混合菌系辅加强化措施去除污染土壤中16epapahs

将多环芳烃污染土壤（10g干土）、表面活性剂（sdbs）、葡萄糖和炭基固定化菌系材料按照下述实验设计置于250ml锥形瓶中构建小型生物反应器，通过称重法添加无机盐培养基使水土比保持为（1:10m/m）。不同处理组实验设计如下所述，对照组ck：仅添加土样；处理组t1：混合菌系h6；处理组t2：炭基材料固定化混合菌系h6；处理组t3：葡萄糖和混合菌系h6；处理组t4：十二烷基苯磺酸钠（sdbs）和混合菌系h6；处理组t5：炭基材料固定化混合菌系h6和葡萄糖；处理组t6：炭基材料固定化混合菌系h6和sdbs；处理组t7：sdbs、葡萄糖和混合菌系h6；处理组t8：sdbs、葡萄糖和炭基材料固定化混合菌系h6。

炭基材料固定化混合菌系h6制备方法为：将1g灭菌水稻杆生物炭/10ml降解菌系（m/v1:10）接种于灭菌玻璃容器后，置于37℃，80rmin^-1摇床中震荡培养48h完成浸泡固定化。容器中混合物的分离采用75µm筛网过滤实现。固定化材料扫描电镜图见图5。

上述混合菌系h6的接种比例占污染土壤质量的10%；固定化菌系投加量以固定化材料计算占污染土壤重量的10%；所添加的sdbs与污染土壤的重量比为100mg/kg；所添加的葡萄糖与污染土壤的重量比为200mg/kg。每种处理均于37℃,180rpm摇床中培养24天后，测定土壤pahs降解率。不同处理组pahs降解率结果见图6。

研究结果表明，培养24天后，三种强化措施的应用均较对照显著提高了土壤pahs降解率，三种强化措施联合使用降解效果最好，降解率高达75%，其中高环pahs降解率为60%，低环pahs降解率为15%。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110>中国科学院城市环境研究所

中国科学院大学

<120>一种降解多环芳烃污染物的混合菌系及应用方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1401

<212>dna

<213>玫瑰色红球菌(rhodococcusrhodochrous)

<400>1

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<213>玫瑰色红球菌(rhodococcusrhodochrous)

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<210>3

<211>1350

<212>dna

<213>浅黄分支杆菌(mycobacteriumgilvum)

<400>3

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<213>莫那分支杆菌(mycobacteriummonacense)

<400>4

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