两步法筛选柑橘黄龙病生防菌的方法与流程

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，具体涉及柑橘黄龙病生防细菌的筛选。

背景技术：

柑橘黄龙病(huanglongbing，hlb)是一种世界性细菌病害，已在40多个国家有发生。它主要由柑橘木虱和嫁接传播，柑橘类所有的植物几乎都可以感染黄龙病。柑橘黄龙病一旦发病，对果实的品质和产量影响很大，会造成严重的经济损失。例如，美国佛罗里达州自2005年首次发现柑橘黄龙病以来，黄龙病已造成该州45多亿美元的损失。近些年来，我国的柑橘产业也面临因黄龙病带来的巨大损失和严峻挑战。

由于柑橘黄龙病的病原无法离体培养，未能完成柯赫氏法则，但植物病理学家依据病菌的来源地、致病能力和基因组信息，将黄龙病菌暂定为细菌韧皮部杆菌属下4个亚种，即亚洲亚种(candidatusliberibacterasiaticus)、非洲亚种(candidatusliberibacterafricanus)、美洲亚种(candidatusliberibacteramericanus)和2015年报导的加勒比亚种(candidatusliberibactercaribbeanus)。4个亚种中，亚洲亚种分布最广，是对世界柑橘产业造成最大威胁的亚种。我国主要分布的也为亚洲亚种。检测其病原的方法主要为普通pcr和实时荧光定量pcr。黄龙病叶片的典型症状与缺素症相似，表现为斑驳黄化。

黄龙病病原菌在寄主植物中的时间分布和空间分布都不均匀。在中国，10-12月黄龙病病原菌含量最高，3-5月份最低；黄龙病病原菌在寄主植物中的空间分布为：种皮>叶片中脉≈枝条>果柄≈桔络>叶肉>果皮≈果肉>主干。叶片之间病原菌含量也有差异，再加之病原菌不能培养和叶片典型症状与缺素症很接近，常规筛选生防菌的方法难以有效地实施，因此，给筛选和评价生防菌的防效带来了巨大困难。

因为缺乏有效的化学防治药剂和抗病品种，黄龙病的防控目前仍是世界难题。柑橘黄龙病的综合管理策略主要包括以下内容：1、铲除并销毁染病柑橘树；2、化学药剂控制传病介体—木虱的群体数量；3、培育无病种苗，严格检疫；4、加强营养管理；5、移栽无病大苗；6、网棚防虫栽培。生物防治是一种绿色、安全和可持续发展的病害防治手段，也符合我国“双减”政策的内涵。因此柑生物防治对于柑橘黄龙病控制有重要意义。

技术实现要素：

为解决柑橘黄龙病的病原无法离体培养，无法采用常规生防菌筛选方法筛选其生防菌的技术难题，本发明提供一种两步法筛选柑橘黄龙病生防菌的方法，该方法包括以下步骤：

(1)生防细菌对指示病原菌拮抗活性的检测：以柑橘溃疡病菌(xanthomonasaxonopodispv.citri)、软腐细菌(erwiniacarotovorasubsp.carotovoradye)、烟草青枯病菌(ralstoniasolanacearum)、西瓜噬酸菌(acidovoraxcitrulli)和克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)为五种指示病原菌，将从柑橘黄龙病发病田中的健株和病株分离的生防内生细菌分别与前述五种指示病原菌做对峙培养，选取赋值最高的生防内生细菌为潜力生防菌，所述健株和病株采用常规的实时荧光定量pcr检测柑橘黄龙病病原菌的方法确定；

(2)半叶法评价潜力生防菌对柑橘黄龙病的防效：将采集的每片柑橘黄龙病寄主病叶，从叶片中间横刀剪断分成两半，取其中半叶片的叶中脉用与步骤(1)中相同的实时荧光定量pcr检测柑橘黄龙病病原菌的方法检测其柑橘黄龙病病原菌含量作为处理组试验前柑橘黄龙病菌含量，用添加有吐温-20的潜力生防菌菌悬液喷洒处理每片叶片剩余的一半叶片，处理后的一半叶片用与步骤(1)中相同的实时荧光定量pcr检测柑橘黄龙病病原菌的方法检测其柑橘黄龙病病原菌含量作为处理组试验后柑橘黄龙病菌含量，通过以下公式计算潜力生防菌对柑橘黄龙病的防效，筛选防效高的潜力生防菌为柑橘黄龙病生防菌；所述的柑橘黄龙病寄主病叶采用与步骤(1)中相同的实时荧光定量pcr检测柑橘黄龙病病原菌的方法检测确定是否为柑橘黄龙病寄主病叶；

处理组柑橘黄龙病菌下降率(％)＝[处理组试验前柑橘黄龙病菌含量-处理组试验后柑橘黄龙病菌含量]×100/处理组试验前柑橘黄龙病菌含量；

对照组柑橘黄龙病菌下降率(％)＝[对照组试验前柑橘黄龙病菌含量-对照组试验后柑橘黄龙病菌含量]×100/对照组试验前柑橘黄龙病菌含量；

校正防效(％)＝[处理组柑橘黄龙病菌下降率-对照组柑橘黄龙病菌下降率]×100/[100-对照组柑橘黄龙病菌下降率]。

进一步，步骤(1)中所述的健株和病株以及步骤(2)中所述的寄主包括但不限于宽皮橘、杂柑、柑、葡萄柚、甜橙、椽、柚、柠檬、酸橙、金桔中的一种或几种以上。

进一步，步骤(1)中所述的实时荧光定量pcr检测柑橘黄龙病病原菌的方法中所用的引物为上游引物cqula04f和下游引物cqula04r，所述上游引物cqula04f的碱基序列如seqidno：1所示，所述下游引物cqula04r的碱基序列如seqidno：2所示，实时荧光定量pcr反应体系为：tbgreenpremixextaq12.5μl，上游引物cqula04f0.8μl，下游引物cqula04r0.8μl，ddh2o5.9μl，模板dna5.0μl；每个样品设置3个重复，阴性对照最后加样；实时荧光定量pcr反应条件：预变性95℃1分钟、变性95℃15秒、退火59℃15秒，从变性至退火45个循环，延伸72℃45秒。

步骤(2)中所述的潜力生防菌菌悬液通过以下方法制备得到：将步骤(1)中所述的潜力生防菌接种到tsa液体培养基，30℃170r/分钟震荡培养48小时后，室温12000r/分钟离心10分钟，弃上清，0.01mpbs缓冲液重悬浮菌体，调至菌含量为5×10⁷-1×10⁸cfu/ml。

步骤(2)所述的添加有吐温-20的潜力生防菌菌悬液是用100ml潜力生防菌菌悬液加200μl吐温-20混合而成。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明针对柑橘黄龙病病原菌不能培养、其病原菌含量时间和空间分布不均、叶片症状多样且肉眼与缺素症难以区分而导致常规生防菌筛选方法无法应用的难题，经大量实验筛选出五种指示病原菌做对峙培养，能高效地检测出对柑橘黄龙病病原菌具有拮抗活性的生防细菌。

2.采用的半叶法，一半叶片作为柑橘黄龙病病原菌含量基准，另一半叶片作为处理后的柑橘黄龙病病原菌含量，可准确地检测出生防菌的防效。

3.如果采用大量的指示病原菌来检查生防菌对柑橘黄龙病病原菌的拮抗活性，即费工费时，又增加试验成本，功效不高。而发明仅用筛选出的五种指示病原菌，即可达到高效检测出对柑橘黄龙病病原菌具有拮抗活性的潜在生防细菌，大幅度地节约了试验成本和时间。

4.本发明采用上述关键的两步法(五种指示病原菌作对峙培养、半叶法计算防效)，具有高效、快速(筛选周期4-7天)，大幅度节约试验成本和时间，不受季节影响等特点，解决了现有生防菌筛选方法无法解决的技术难题，并可广泛应用于柑橘黄龙病的各类寄主，包括宽皮橘、杂柑、柑、葡萄柚、甜橙、椽、柚、柠檬、酸橙和金桔等。

序列表中seqidno：1所示的是上游引物cqula04f的碱基序列。

序列表中seqidno：2所示的是下游引物cqula04r的碱基序列

附图说明

图1：生防内生菌对指示病原菌的抑菌效果。图1中1、2、3为生防内生菌的菌落及其产生的抑菌圈；其余部分为指示病原菌(柑橘溃疡病菌)

图2：半叶法筛选防治柑橘黄龙病潜力内生菌菌株示意图。图2中，左，完整的柑橘黄龙病病叶；右上，用于潜力生防菌株的筛选；右下，不做任何处理。

图3：防治柑橘黄龙病潜力内生生防菌株处理的柑橘黄龙病叶片。

具体实施方式

下面将结合本发明具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，各实施例无特殊说明的为常规方法。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.分离可培养生防内生细菌：从湖南省永州学院实验农场采集了温州蜜桔柑橘黄龙病发病田中的健株和病株，所述健株和病株用常规的实时荧光定量pcr检测柑橘黄龙病病原菌的方法确定；分别取所述健株和病株的根、茎、叶，分别用75％(v/v)的酒精消毒30秒，2.5％(v/v)次氯酸钠表面消毒1分钟，分别充分研磨后用0.85％w/w的氯化钠稀释10倍和100倍浓度涂板于tsa(大豆蛋白胨5g/l、胰蛋白胨15g/l、氯化钠5g/l、琼脂粉20g/l)培养基上，30℃培养48小时后，挑取形态不同的细菌划线纯化后得生防内生细菌，接生防内生细菌于液体tsa培养基中30℃170r/分钟震荡培养16h-18h为液体菌液。液体菌液与40％的甘油1:1(v/v)保存于-80℃。

2.生防细菌对指示病原菌拮抗活性的检测：以柑橘溃疡病菌(xanthomonasaxonopodispv.citri)、软腐细菌(erwiniacarotovorasubsp.carotovoradye)、烟草青枯病菌(ralstoniasolanacearum)、西瓜噬酸菌(acidovoraxcitrulli)和克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)为五种指示病原菌，将从柑橘黄龙病发病田中的健株和病株分离的生防内生细菌分别与前述五种指示病原菌中每一种指示病原菌做对峙培养(图1)，测量并记录抑菌圈的大小。没有抑菌活性为0分，抑菌圈大小为0.1-1.0cm为1分,抑菌圈1.1-2.0cm为2分，抑菌圈2.1-3.0cm为3分，抑菌圈3.1-4.0cm为4分，每个生防内生细菌的赋值总分为对应的各个病原菌赋值分相加，选取生防内生细菌赋值最高的生防内生细菌为潜力生防菌，用10株潜力生防菌进行下一步。

上述五种指示病原菌在如下非专利文献公开，云南农业大学有保存并可以提供。

柑橘溃疡病菌(xanthomonasaxonopodispv.citri)：吴明琼，韩宁宁，廖咏梅.4种杀菌剂对柑橘溃疡病菌的室内毒力测定[j].广西植保，2018(1)：14-16.

软腐细菌(erwiniacarotovorasubsp.carotovoradye)：张学君，王金生，方中达.cu²⁺对软腐细菌(erwiniacarotovorasubsp.carotovoradye)致病因子的影响[j].南京农业大学学报，1990，13(4增)：46-50.

烟草青枯病菌(ralstoniasolanacearum)：李小杰，李成军，胡亚静，李淑君，邱睿，白静科，陈玉国.豫南烟区烟草青枯病菌拮抗内生细菌的筛选及其防病效果初探[j].河南农业科学,2018,47(5):57-61.

西瓜噬酸菌(acidovoraxcitrulli)：蔡馥宇，关巍，乔培，闫建培，杨玉文，赵廷昌.瓜类细菌性果斑病研究新进展[j].中国瓜菜，2017，30(11)：1-5.

克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)：陆竞争，任顺利，诸葛斌，陆信曜，宗红，方慧英，宋健.磷酸转移酶系统关键基因敲除对klebsiellapneumoniae产1，3-丙二醇的影响[j].食品与发酵工业，2017，43(8):22-26.

3.半叶法评价潜力生防菌对柑橘黄龙病的防效：

3.1潜力生防菌菌悬液的制备：将步骤2中所述的潜力生防菌接种到tsa液体培养基(大豆蛋白胨5g/l、胰蛋白胨15g/l、氯化钠5g/l)，30℃170r/分钟震荡培养48小时后，室温12000r/分钟离心10分钟，弃上清，0.01mpbs缓冲液重悬浮菌体，潜力生防菌含量调至为5×10⁷-1×10⁸cfu/ml备用。

3.2半叶法评价潜力生防菌对柑橘黄龙病的防效：

3.2.1将柑橘黄龙病寄主病叶采回实验室，所述柑橘黄龙病寄主病叶用与实施例1步骤1中相同的实时荧光定量pcr检测柑橘黄龙病病原菌的方法检测确定为病叶，将采集的每片柑橘黄龙病寄主病叶从叶片中间横刀剪断分成上下两半(图2)，取其中半叶片的叶中脉用与实施例1步骤1中相同的实时荧光定量pcr检测柑橘黄龙病病原菌的方法检测其柑橘黄龙病病原菌含量作为处理组试验前柑橘黄龙病菌含量；

3.2.2将灭过菌的培养皿里加灭菌纯水和滤纸(用来保湿经添加有吐温-20的潜力生防菌菌悬液处理过的半叶片)，用添加有吐温-20的潜力生防菌菌悬液喷洒处理每片叶片剩余的一半叶片，正反面喷洒均匀，每个处理至少12个叶片，3个重复。晾干该半叶片表面的菌悬液后将其置于前述培养皿中的滤纸上(图3)，放置于30℃培养箱中，4天后取出处理过的半叶片中脉用ctab法提取dna，用与步骤(1)中相同的实时荧光定量pcr检测柑橘黄龙病病原菌的方法检测其柑橘黄龙病病原菌含量作为处理组试验后柑橘黄龙病菌含量，通过以下公式计算潜力生防菌对柑橘黄龙病的防效，筛选防效高的潜力生防菌为柑橘黄龙病生防菌，对照喷等量的0.01mpbs缓冲液。

处理组柑橘黄龙病菌下降率(％)＝[处理组试验前柑橘黄龙病菌含量-处理组试验后柑橘黄龙病菌含量]×100/处理组试验前柑橘黄龙病菌含量

对照组柑橘黄龙病菌下降率(％)＝[对照组试验前柑橘黄龙病菌含量-对照组试验后柑橘黄龙病菌含量]×100/对照组试验前柑橘黄龙病菌含量

校正防效(％)＝[处理组柑橘黄龙病菌下降率-对照组柑橘黄龙病菌下降率]×100/[100-对照组柑橘黄龙病菌下降率]

步骤3.2.2所述的添加有吐温-20的潜力生防菌菌悬液是用3.1所述的100ml潜力生防菌菌悬液加200μl吐温-20混合而成。

ctab提取dna的方法如下：剪去叶肉留下叶中脉，用液氮速冻之后，研磨成粉末状称重0.1克，转移至离心管；加入2×ctab缓冲液900μl后65℃水浴1个小时，期间反复轻轻颠倒混匀；加入900μl氯仿：异戊醇24:1(v:v)，12000r/分钟室温离心10分钟；转移上清至一新离心管后加入等体积氯仿：异戊醇24:1(v:v)，12000r/分钟离心10分钟；转移上清至一新离心管后加入0.6倍体积的异丙醇和0.1体积的3.0m醋酸钠后4℃放置30分钟；以12000r/分钟速度下，于室温离心10分钟，弃上清，加入70％的乙醇400μl，以12000r/分钟速度下，于室温离心2分钟；弃上清，加入无水乙醇200μl，以12000r/分钟速度下，于室温离心2分钟；37℃烘干无水乙醇，加灭菌去离子水100μl溶解dna，保存于-20℃。

实施例1步骤1中所述实时荧光定量pcr检测柑橘黄龙病病原菌的方法：其所用的引物为上游引物cqula04f和下游引物cqula04r，所述上游引物cqula04f的碱基序列如seqidno：1所示，所述下游引物cqula04r的碱基序列如seqidno：2所示；实时荧光定量pcr反应体系为：tbgreenpremixextaq12.5μl，上游引物cqula04f0.8μl，下游引物cqula04r0.8μl，ddh2o5.9μl，模板dna5.0μl；每个样品设置3个重复，加样时避免交叉污染，阴性对照最后加样；实时荧光定量pcr反应条件：预变性95℃1分钟、变性95℃15秒、退火59℃15秒，45个循环(从变性至退火)，延伸72℃45秒。

4.结果与分析

4.1总共分离278株生防内生细菌，统计结果如表1。

表1实施例1生防内生细菌的分离统计

4.2评分最高的10株菌株如表2。从健康树叶片上分离的hl19菌株赋值最高。

表2实施例1生防内生细菌赋值最高的10株结果

注：抑菌圈0代表没有抑菌活性。

4.3生防内生细菌离体处理柑橘叶片防效结果，如表3。赋值最高的hl19校正防效为99.10％，筛选到1株有潜力的生防菌。最低的为hl11，其校正防效1.09％。其他的生防菌的校正防效在3.12％-45.57％之间。筛选到的潜力生防菌可用于田间试验，进一步验证其效果。

表3实施例1中10株生防内生细菌对柑橘黄龙病的生防效果

计算举例：以hl19为例，其它生防内生细菌防治黄龙病效果计算与此相同。

1)处理组柑橘黄龙病菌下降率(％)＝[8.14×10⁵-6.89×10³]×100/8.14×10⁵＝99.15

2)对照组柑橘黄龙病菌下降率(％)＝[1.19×10⁶-1.13×10⁶]×100/1.19×10⁶＝5.04

3)校正防效(％)＝[99.15-5.04]×100/[100-5.04]＝99.10

实施例2

实施例2除以下试验及结果不同外，其余操作步骤与实施例1相同。

1.分离可培养生防内生细菌所用材料是从云南省永善县甜橙柑橘黄龙病发病田中采集的健株和病株。

2.结果与分析

2.1总共分离258株生防内生细菌，统计结果如表4。

表4实施例2生防内生细菌的分离统计

2.2评分最高的10株菌株如表5。从健康树根上分离的hr26菌株赋值最高。

2.3生防内生细菌离体处理柑橘叶片防效结果，如表6。赋值最高的hr26校正防效为98.79％，防效90％的菌株有两株。最低的为dl27，其校正防效5.50％。其他的生防菌其校正防效在13.40％-94.55％之间。

表5实施例2生防内生细菌赋值最高的10株结果

注：抑菌圈0代表没有抑菌活性。

表6实施例2中10株生防菌对柑橘黄龙病的生防效果

实施例3

实施例3除以下试验及结果不同外，其余操作步骤与实施例1相同。

1.分离可培养生防内生细菌所用材料是从云南省大理宾川县州城镇华侨农社区五组柑橘田采集的沃柑黄龙病发病田中的健株和病株。

2.结果与分析

2.1总共分离286株生防内生细菌，统计结果如表7。

表7实施例3生防内生细菌的分离统计

2.2评分最高的10株菌株如表8。从健康树叶片上分离的hl33菌株赋值最高。

表8实施例3生防内生细菌赋值最高的10株结果

注：抑菌圈0代表没有抑菌活性。

2.3生防内生细菌离体处理柑橘叶片防效结果，如表9。赋值最高的hl33校正防效为91.60％。最低的为ds14，其校正防效19.50％。其他的生防菌其校正防效在27.15％-87.13％之间。

表910株生防菌对柑橘黄龙病的生防效果

序列表

<110>云南农业大学

<120>两步法筛选柑橘黄龙病生防菌的方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>柑橘黄龙病菌亚洲亚种(candidatusliberibacterasiaticus)

<400>1

tggaggtgtaaaagttgccaaa22

<210>2

<211>27

<212>dna

<213>柑橘黄龙病菌亚洲亚种(candidatusliberibacterasiaticus)

<400>2

ccaacgaaaagatcagatattcctcta27