一种用于指导人精神疾病用药的试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及试剂盒领域，更具体地涉及一种用于指导人精神疾病用药的试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：精神疾病已经成为我国的高发疾病，据统计我国成年人中有超过17％的人深受抑郁症、精神分裂症等精神疾病的困扰。药物治疗是目前精神疾病的主要临床手段，但是仍然处于试误法(trialanderror)的阶段，药物疗效和不良反应也呈现出显著的个体差异。在精神分裂症患者中，只有33％～50％的患者在足量足疗程的抗精神分裂症药物治疗下可以获得临床症状的完全缓解。导致药物治疗出现巨大个体差异的原因，除了传统上的病理、生理、性别、年龄、身高、体重、依从性等方面外，遗传因素是影响药物反应差异的重要因素。近年来，药物基因组学得到了飞速发展，通过对药物代谢、疗效和不良反应的相关基因检测指导药物的选择和剂量调整，达到个体化治疗的目的。对于临床医生来说如何合理地选择药物、进行剂量调整、临床监测以及合理地控制不良反应显得尤为重要。目前，在美国食品药品监督管理局(fda)批准的药品说明书中，已有超过200种药物被推荐进行药物基因组生物标记物的检测，占据前3位的分别是抗肿瘤药物、精神类药物和心血管类药物。大量的临床数据也都显示了精神科开展个体化药学的紧要性和必要性，但在中国，精神类药物的药物相关基因检测一直没有在临床得到广泛的应用,随着个体化用药基因学检测的临床模式的建立，药物基因组学在指导临床合理用药中将发挥越来越重要的作用，其临床应用和普及将成为趋势。目前市场上从事基因检测的公司很多，但大多数是针对肿瘤，使用的主流检测技术都是基于高通量的全基因组重测序(即对人基因组的全部约30亿个碱基全部重新测定，并和参考基因组进行比较，以确定变异位点)或全外显子组测序(测定人基因组上所有基因中可以表达为蛋白质的部分，即外显子的序列)技术；近年来使用大、中、小型基因位点组成的panel技术在肿瘤基因检测领域也开始得到一定程度的应用。相比之下，针对精神疾病进行基因检测及用药指导的产品不是很多。全基因组重测序和全外显子组测序技术虽然准确性较高，但检测成本和时间周期还不能满足临床需求：全基因组重测序每个样本的费用在1万元左右，全外显子组测序每个样本也要3000-4000元，因为检测的基因位点多，后续的生物信息分析需要较长时间，因此这两项技术都基本不可能在两个月内拿到结果，而临床精神疾病的基因检测需要反馈及时，医生及病人希望最多一周之内拿到结果。基于荧光定量pcr技术的基因分型技术虽然在时效性上可以满足，但是通量较低，每个反应仅能检测一个样本的一个位点，16个位点需要16个检测反应才能实现，这无疑也增加了检测成本。在样本量较多的情况下，荧光定量pcr技术的检测时间将会被大大延长，因而会丧失检测时效性的优势。在先专利申请cn201910168662.2公开了一种用于指导人精神疾病用药的试剂盒及其检测方法，虽然该专利能够基本实现对大多数检测样本基于多重pcr和质谱测序技术的分型，可以检测出精神疾病用药相关的人类基因组突变，但是对于部分检测样本分型效果仍然较差，不能实现针对绝大多数检测样本的分型，在临床应用中具有一定的局限性。技术实现要素：本发明的目的是提供一种用于指导人精神疾病用药的试剂盒及其检测方法，从而解决现有技术中针对精神疾病进行基因检测及用药指导的试剂盒仍然存在针对部分检测样本的分型效果较差，不能实现针对所有检测样本的分型，在临床应用中具有一定局限的问题。为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：根据本发明的第一方面，提供一种用于指导人精神疾病用药的试剂盒，该试剂盒可同时对16个基因位点进行分型，所述试剂盒包括用于扩增16个基因片段的16对扩增引物，所述16对扩增引物的序列seqidno.1～32具体如下：所述试剂盒还包括用于鉴定这16个基因片段突变的16条延伸引物，所述延伸引物的序列seqidno.33～48具体如下：其中，pcr扩增的反应体系如下：10×pcr缓冲液0.5μlmgcl21.8～2.2μmdntps480～520μm扩增引物混合液0.05～0.15μmtaq酶1u纯水补齐至5μl；iplex延伸的反应体系如下：单碱基延伸反应混合液0.4μliplexenzyme1u延伸引物混合液0.08～0.20μm纯水补齐至2μl。根据本发明提供的上述试剂盒，该试剂盒还包括sap反应体系，所述sap反应体系如下：sap缓冲液0.17μlsap酶0.5u纯水补齐至2μl。根据本发明提供的上述试剂盒，所述扩增引物混合液中16对扩增引物的摩尔浓度相当，即各扩增引物的用量是基本相等的。根据本发明提供的上述试剂盒a，所述16条延伸引物的摩尔浓度比值优选为：seqidno.33﹕seqidno.34﹕seqidno.35﹕seqidno.36﹕seqidno.37﹕seqidno.38﹕seqidno.39﹕seqidno.40﹕seqidno.41﹕seqidno.42﹕seqidno.43﹕seqidno.44﹕seqidno.45﹕seqidno.46﹕seqidno.47﹕seqidno.48＝(1.57～1.59)﹕(1.00～1.02)﹕(1.08～1.10)﹕(1.75～1.76)﹕(1.33～1.35)﹕(1.76～1.78)﹕(1.56～1.57)﹕(1.30～1.32)﹕(1.43～1.44)﹕(1.79～1.81)﹕(1.41～1.43)﹕(1.52～1.54)﹕(1.92～1.94)﹕(1.25～1.27)﹕(1.56～1.57)﹕(1.68～1.70)。最优选地，16条延伸引物的摩尔浓度比值为：seqidno.33﹕seqidno.34﹕seqidno.35﹕seqidno.36﹕seqidno.37﹕seqidno.38﹕seqidno.39﹕seqidno.40﹕seqidno.41﹕seqidno.42﹕seqidno.43﹕seqidno.44﹕seqidno.45﹕seqidno.46﹕seqidno.47﹕seqidno.48＝1.59﹕1.00﹕1.09﹕1.75﹕1.35﹕1.77﹕1.56﹕1.32﹕1.44﹕1.80﹕1.43﹕1.54﹕1.93﹕1.26﹕1.56﹕1.69。根据本发明所提供的试剂盒，优选采用飞行时间质谱仪进行检测。本发明优选采用美国agena公司推出的massarray，即一种飞行时间质谱仪，确保了检测结果的准确性和灵敏度，简单可行，其优势具体如下：(1)准确性高，直接检测待测物分子量，准确度超过99.9％；还可以检测pcr实验失败或三等位基因的存在；(2)灵敏度高，检测窗口内，任何pmol级别的物质都能被检测出来；(3)通量高，一张芯片上可同时完成384个样品的多重检测，每个反应孔可实现多达30重反应，每次最多能进行数万个基因型分析；(4)灵活，一张芯片上，样本的数量和位置可以自由选择，同时样本和snp位点的配对可以自由选择；(5)质控严格，质谱技术是“一管式操作”，即反应体系在生化学实验过程中始终在一个试管内反应，避免了多次转移造成的人为误差。(6)操作简单，完全改变传统测序等技术在基因检测中价格昂贵，耗时长，操作繁琐等劣势。根据本发明的第二方面，还提供一种试剂盒的检测方法，所述检测方法不用于疾病的诊断和治疗，仅用于个体鉴别，所述检测方法的具体步骤如下：1)pcr扩增：按照上述pcr扩增的反应体系配置pcr反应混合液，分装至96孔板中，取dna样本分别加入96孔板中，放入扩增仪，扩增程序如下：95℃变性2min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共45个循环；72℃最后延伸5min；2)sap反应：配置sap反应混合液，反应体系如下：sap缓冲液0.17μl，sap酶0.5u，纯水补齐至2μl；取2μlsap反应混合液分别加至步骤1)的每个孔中，放入扩增仪，扩增程序如下：37℃，40min；85℃，5min；4℃保温；3)延伸反应：取出sap反应板，2000rpm离心1～2min；按照上述iplex延伸的反应体系配置iplex延伸反应液，取2μliplex延伸反应液分别加至离心后的孔板中，放入扩增仪，进行以下热循环以同时对16个基因位点进行精准分型，热循环程序如下：根据本发明提供试剂盒，其中所采用的16个位点组合是发明人通过大量文献阅读，搜集证据，对证据进行评级，然后结合自建中国人群基因突变型数据库中基因型频率数据才最终确定的。虽然根据现有的资料记载，可以用于指导精神疾病用药指导的基因位点很多，但是我们选取的16个位点是既具有丰富的临床试验证据支持，又适合中国人群遗传特征(位点在中国人群中的突变频率在3％以上)的位点。具体地，本发明所涉及的位点包括cyp2d6*10(包括rs1135840,rs1065852,rs1058164三个位点)，cyp2c19*2(rs4244285位点)，cyp1a2*1f(rs762551位点)，cyp1a2*1c(rs2069514位点)，cyp3a5*3(rs776746位点)，nat2*6(rs1799930位点)，nat2*13(rs1041983位点)，drd2(rs1079597位点)，drd2(rs1799978位点)，drd2(rs1800497位点)，mc4r(rs489693)，ugt2b15*2(rs1902023位点)，fkbp5(rs1360780位点)，以及htr2a(rs7997012位点)。其中，多种选择性5-羟色胺再吸收抑制剂(ssri)类和三环类精神药物经由cyp2d6或者主要经由cyp2d6代谢。而cyp2d6*10是中国人群多发的导致活性减弱的突变。cyp2d6活性的减弱会致使经cyp2d6代谢的药物的血药浓度和峰值的升高，进而可能影响其治疗效果和毒副作用。部分ssri和三环类精神药物经cyp2c19代谢或部分经cyp2c19代谢。cyp2c19*2是中国人群中常见的活性降低的突变。cyp2c19活性的减弱将会导致经由cyp2c19代谢的药物血药浓度和峰值的升高。部分ssri类和三环类精神药物经由cyp1a2代谢。cyp1a2*1f和cyp1a2*1c是东亚人群中重要的突变类型。cyp1a2*1f突变会增强cyp1a2酶的代谢活性，而cyp1a2*1c则会减弱cyp1a2的代谢活性。cyp1a2活性的改变将会改变经由其代谢的药物的血药浓度状态。抗焦虑药物阿普唑仑主要经由cyp3a5代谢，而cyp3a5*3是东亚人群中主要的无活性突变。cyp3a5活性的丧失显著影响阿普唑仑代谢，改变其血药浓度。nat2是n-乙酰转移酶，是氯硝西泮的重要代谢酶。nat2*6和*13突变导致氯硝西泮代谢明显减慢，从而影响氯硝西泮的治疗效果和毒副作用。drd2是多巴胺受体，是多种抗精神分裂类药物的作用靶点。rs1079597，rs1800497和rs1799978三个位点的多态性可以影响到多种抗精神分裂症及相关治疗的药物疗效。mc4r是黑色细胞刺激素受体，在控制体重增加中起重要作用。体重增加是第二代抗精神分裂药物的常见副作用，而mc4r的单核苷酸多态性位点rs489693与多种抗精神分裂药物的体重增加副作用相关，其多态性可以帮助预测精神分裂药物的体重增加副作用。ugt2b15是苯二氮卓类药物的主要代谢酶，ugt2b15*2突变导致其酶活性降低，将导致劳拉西泮，奥沙西泮等药物的代谢变慢。fkbp5是一种亲免蛋白，可以影响多种ssri类药物的治疗效果。fkbp5的rs1360780位点多态性可以帮助预测多种ssri类药物的疗效。htr2a是5羟色胺受体，是许多ssri类药物的作用靶点。多项研究表明，htr2ars7997012位点多态性可以帮助预测ssri类药物的治疗效果。因此，本发明针对这16个基因位点的精确分型结果将为医生临床个体化用药提供重要依据。应当理解的是，根据本试剂盒获得的检测结果仅代表cyp2d6*10(包括rs1135840,rs1065852,rs1058164三个位点)，cyp2c19*2(rs4244285位点)，cyp1a2*1f(rs762551位点)，cyp1a2*1c(rs2069514位点)，cyp3a5*3(rs776746位点)，nat2*6(rs1799930位点)，nat2*13(rs1041983位点)，drd2(rs1079597位点)，drd2(rs1799978位点)，drd2(rs1800497位点)，mc4r(rs489693)，ugt2b15*2(rs1902023位点)，fkbp5(rs1360780位点)，htr2a(rs7997012位点)这16个基因位点的分型结果，为医生临床个体化用药提供参考。在16个基因位点组合确定后，发明人进一步针对每个基因位点设计专用引物，然后通过多次尝试不同的引物组合，最终选择出对绝大部分样本都可以达到16个位点精准分型，同时空白对照又没有出现异常延伸的引物组合，最终才得到具有非常显著的应用效果的试剂盒。而既可以同时对16个位点进行精准分型，同时又不会出现异常延伸对于获得一个合格的试剂盒来说是非常重要，是必须同时满足的两个要求。总之，本试剂盒所采用的技术在通量上是荧光定量pcr的16倍，可以很好的解决在样本量较多时的效率问题。在成本方面据测算，使用荧光定量pcr，16个位点的检测成本约在3千元(包括人工和试剂耗材以及仪器损耗等成本)左右，而本试剂盒的检测成本可以控制在1000以内。其次，本发明基于飞行时间质谱技术进行基因分型，是对精心挑选的和精神疾病用药最为相关的一些基因的变异位点进行中通量测序，因此可以大大降低时间周期和检测成本，而且仍然得到高度可靠的检测结果，从而使得该技术在临床上具有实际使用的价值。根据本发明提供的上述试剂盒及其检测方法，首先，该试剂盒基于多重pcr和质谱测序技术的分型，可以精确地识别突变位置的碱基，因此其分型的精准性相比非基于测序技术的分型有了的极大提高，而相对于其它基于测序技术的方法(全基因组重测序和全外显子组测序)大大降低了实验成本及周期，因此具有非常重要的实际应用价值；其次，根据本发明提供的上述试剂盒，针对所有的检测样本均具有非常好的分型效果，并且各引物相互干扰极低，也避免了出现任何异常延伸现象的发生，因此相对现有技术中已经公开的试剂盒也具有明显的优越性，在临床应用中能够发挥更好的使用效果，应用前景更加广阔。附图说明图1是采用本发明提供的试剂盒针对15个人源dna样本进行检测的分型效果图，其中，除了右侧最下面一个孔为ntc，其余孔从左往右、从上至下依次为样本1-15；图2是采用本发明提供的试剂盒的ntc全体分型结果图；图3是采用本发明提供的对比引物组合一针对15个人源dna样本进行检测的分型效果图，其中，除了右侧最下面一个孔为ntc，其余孔从左往右、从上至下依次为样本1-15；图4是采用本发明提供的对比引物组合一的ntc全体分型结果图；图5是采用本发明提供的对比引物组合二针对15个人源dna样本进行检测的分型效果图，其中，除了右侧最下面一个孔为ntc，其余孔从左往右、从上至下依次为样本1-15；图6是采用本发明提供的对比引物组合二的ntc全体分型结果图。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。实施例1有关试剂盒的详情说明1)检验原理本发明采用的检测方法为多重pcr结合核酸飞行质谱。首先通过多重pcr在一个体系内同时扩增16个目标序列，然后加入针对每个snp序列的特异延伸引物，在snp位点上，延伸1个碱基。然后将上述制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出snp位点信息。2)主要组成成分该试剂盒的主要组成成分包括：10xpcr缓冲液，mgcl2溶液，dntp溶液，taq酶，3-ptcalibrant，sap缓冲液，sap酶，单碱基延伸混合液，iplexenzyme，扩增引物混合液，延伸引物混合液，ddh2o，阳性对照品，干燥树脂，芯片板。1.3储存条件及有效期本试剂盒保存于-20℃，保质期9个月。1.4配套仪器通用pcr仪；点样仪massarraynanodispenser，型号rs1000(agenabioscience)；质谱仪massarrayanalyserfour，型号massarrayanalyserfoursystem96/24genotyping(agenabioscience)。1.5样本要求本品适用于从口腔黏膜细胞、口腔脱落细胞、血液、组织和干血片中提取的基因组dna，要求dna的a260/a280比值应介于1.8到2.0之间。冷冻dna样本应在-20℃以下，并且避免反复冻融。1.6检验方法1.6.1pcr反应3)在pcrⅰ区，从-20℃冰箱中将各试剂(盒)取出，置于冰上(4℃)融解，再从4℃冰箱取出扩增引物，均涡旋震荡10s后简短离心，备用。4)按下表依次加入相关试剂组分配置pcr反应混合液，并做好标记、分装至96孔板中，3μl/孔；分装完后从pcrⅰ区通过传递窗传至ⅱ区；10xpcr缓冲液0.5μlmg2+溶液2μm(终浓度)dntp溶液500μm(终浓度)扩增引物混合液0.5ul(终浓度0.1μm，各引物之间量比为1)taq酶1u水补齐至5μlpcr反应混合液由pcrbuffer、mg2+、dntp混合，a)在pcrⅱ区，从-20℃冰箱取出dna模板，冰上(4℃)熔解，涡旋震荡10s后简短离心，吸出一定量dna稀释至5ng/μl，备用。b)向96孔板中每孔加入2μl5ng/μldna模板，盖上管盖，涡旋震荡10s后简短离心，从pcrⅱ区通过传递窗传至ⅲ区，再从pcrⅲ区通过传递窗传至ⅳ区，每次实验时必须设定空白对照(2μlddh2o)、阴性对照(2μldna提取洗脱液)和阳性对照。c)将96孔板放入扩增仪，运行程序：pcr，具体程序如下：1.6.2sap反应1)pcr反应结束后，按下表在1.5mlep管中配制sap混液。表2的数字是以一块96孔板加上38％过剩额计算出来的。该配置过程在pcrⅰ区完成。sap反应混合液如下表所示：sap缓冲液0.17μlcutsmartbuffer(生产商neb)sap酶0.5u(生产商neb)水补齐至2μl2)将配制好的sap混液由pcrⅰ区传递至ⅳ区，加2μlsap混液到每一个孔里(加混液后总体积：7μl)。3)把板用膜(用life的或其它公司质量较好的膜)封好，涡旋震荡和离心(4000rpm5秒)。4)将板放上pcr仪进行以下程序：37℃40分钟，85℃5分钟，4℃保温。1.6.3延伸反应1)取出sap反应板2000rpm离心1min。2)根据下表在1.5ml管中配制iplex延伸混液，表3的数字是以一块96孔板加上38％过剩额计算出来的。请根据实际反应的数量调整数字。该配置过程在pcrⅰ区完成。3)将iplex延伸混液由pcrⅰ区传递至ⅳ区，每一个孔加入2μliplex延伸混液并混匀(加混液后总体积：9μl)。4)把板用膜封好，涡旋震荡和离心(4000rpm5秒)。5)将96孔板放上pcr仪进行以下热循环：1.6.4调节(样本脱盐)以下程序为一块96孔板而设，请根据实际孔的数量调节程序。戴上手套和护眼镜。1)把洁净树脂(resin)铺平在96/15mg凹坑板(dimpleplate)上，风干最少10分钟。注意：先用勺子将树脂铺放在板上，然后用刮板刮从左至右或从右至左刮树脂，使96个孔都被树脂填满，当96个孔都被填满后再用刮板轻轻地刮一遍并将表面残留的树脂刮下去，防止干扰下步贴膜。当树脂由深黄变为淡黄色，即表明树脂已经干的差不多了。2)在样本板的每一个有样本的孔里加入41μl水，封膜(用普通的膜即可)，然后离心。3)加入15mg洁净树脂(resin)：轻轻将样本板凌空反转，放在已放树脂的凹坑板上，一定要孔对孔！然后将凹坑板连样本板一起反转(过程中两块板不可水平移动)，让树脂掉到孔里。4)用膜(用普通的膜即可)把板封好，放在旋转器上颠倒摇匀15分钟。5)以3200g(标准板离心机的4000rpm)将板离心5分钟。1.6.5点样按照massarraynanodispenser操作说明将pcr产物转移至芯片板。1.6.6质谱分析1)从点样仪中取出芯片板。2)用镊子将芯片板转移至massarrayanalyserfour芯片槽，芯片印有文字的一面朝外，并用镊子将芯片向左下方方向挤压。3)按照massarrayanalyserfour操作说明，进行飞行质谱检测及结果读出。1.6.7检验结果的解释1)试剂盒有效性判定：标准品可以检测对应基因型，空白对照品(ntc)仅检出延伸引物信号，弱阳性对照可以检出对应阳性信号时，此次检测结果有效，否则此次检测结果无效。1.6.8检验方法的局限性1)本方法可能受到检测样本dna质量的影响，如果检测样本dna质量较差，可能出现假阴性结果。2)本检测结果仅供临床用药参考，用于指导个体化用药，不能作为临床用药的唯一依据。3)当本品检出对应位点的基因型为野生型时，不能排除该基因还有其它位点的突变。1.6.9产品性能指标本产品最低可以检出a260/a280纯度在1.80-2.00之间的10ng人类基因组dna。实施例2不同引物组合对样本的分型效果比较下面以相同的15个人源dna模板为样本，依次采用本发明提供的试剂盒，以及对比引物组合一、二对这15个样本进行基因分型，结果如下：2.1本发明提供的试剂盒的分型效果根据本发明提供的一种用于指导人精神疾病用药的试剂盒，可同时对16个基因位点进行分型，试剂盒包括用于扩增16个基因片段的16对扩增引物seqidno.1～seqidno.32，以及16条延伸引物seqidno.33～seqidno.48，具体序列参见序列表所示。经过实验验证，本试剂盒在使用中，优选地，扩增引物混合液中16对扩增引物的摩尔浓度相当，即各扩增引物的用量是基本相等的，而16条延伸引物的摩尔浓度比值优选如下表所示：采用该试剂盒对上述15个人源dna模板进行分析，其分型效果如图1所示，其中，右下角为ntc，其它为测试样本1-15，绿色越深，代表分型效果越好，ntc越红(原彩图中为深红色)，说明其引物相互干扰的本底越低。该结果证明，根据本发明提供的试剂盒，所述测试样本均显示为深绿色，说明针对所有测试样本的分型效果均非常好，ntc为深红色，说明各引物之间相互干扰也极小，从而证明该试剂盒可成功应用于指导人精神疾病的用药，甚至明显优于现有技术公开的相关试剂盒。如图2所示，为ntc全体分型结果图，没有出现异常延伸的情况。由此可见，该试剂盒同时也完全避免了异常延伸的情况。2.2对比引物组合一的分型效果在针对相同的16个基因位点的基础上，本发明还设计了对比引物组合一，其扩增引物和延伸引物的具体序列如下表所示：采用该对比引物组合一对上述15个人源dna模板进行分析，其分型效果如图3所示，其中，右下角为ntc，其它为测试样本1-15，绿色越深，代表分型效果越好，ntc越红，说明其引物相互干扰的本底越低。该结果证明，采用该对比引物组合一进行检测，大部分测试样本显示为深绿色，少部分测试样本显示为浅绿色，也就是说相对前面提供的试剂盒，该对比引物组合一对15个样本的分型效果明显变差，各引物之间的相互干扰较小，由此可以看出，试剂盒中各扩增引物以及延伸引物之间均为相辅相成的作用，如果对其进行任意替换则相应的分型效果也会相差巨大。如图4所示，为该引物组合的ntc全体分型结果图，基本没有异常延伸现象的发生。2.4对比引物组合二的分型效果在针对相同的16个基因位点的基础上，本发明还设计了对比引物组合二，其扩增引物是在对比引物组合一的基础上，进一步采用seqidno.95替换seqidno.65，seqidno.96替换seqidno.66，seqidno.97替换seqidno.69，seqidno.98替换seqidno.70，延伸引物是在对比引物组合一的基础上，进一步采用seqidno.99替换seqidno.84，seqidno.100替换seqidno.87。具体序列如下表所示：采用该对比引物组合二对上述15个人源dna模板进行分析，其分型效果如图5所示，其中，右下角为ntc，其它为测试样本1-15，绿色越深，代表分型效果越好，ntc越红，说明其引物相互干扰的本底越低，而实际上只有少部分测试样本为深绿色，部分测试样本为浅绿色，还有部分样本甚至为黄色，ntc为浅黄色，说明相互干扰的本底较高。该结果证明，虽然对比引物组合二相对对比引物组合一仅改变了4条扩增引物序列以及2条延伸引物序列，但是对15个样本的分型效果明显变差，各引物之间的相互干扰也明显增高，由此可以看出，根据本发明提供的试剂盒中各扩增引物以及延伸引物之间均为相辅相成的作用，如果对其进行任意替换则相应的分型效果也会相差巨大。综上所述，本发明基于多重pcr和质谱测序技术的分型，可以精确地识别突变位置的碱基，因此检测分型的精准性相比非基于测序技术的分型有了极大提高。根据本发明提供的由序列seqidno.1-48组成的试剂盒中各引物之间相互干扰极小，可以对几乎所有样本同时实现16个位点的精准分型，同时空白对照又没有出现异常延伸，因此相对现有技术中已经公开的试剂盒也具有明显的优越性，在临床应用中能够发挥更好的使用效果，应用前景更加广阔。而相对于其它基于测序技术的方法(全基因组重测序和全外显子组测序)，本发明所提供的试剂盒还大大降低了实验成本及周期，因此具有非常重要的实际应用价值。实施例3试剂盒的实验例子根据本发明提供的由序列seqidno.1-48组成的试剂盒，将其应用于测试样本的检测的实验例子说明如下：实验例子1：试剂盒检测得到如下结果：根据上面的结果，我们做出如下判读：因此，我们可以对下列药物的使用情况进行推荐，如下表所示：实验例子2：试剂盒检测得到如下结果：根据上面的结果，我们做出如下判读：因此，我们可以对下列药物的使用情况进行推荐，如下表所示：实验例子3：试剂盒检测得到如下结果：根据上面的结果，我们做出如下判读：因此，我们可以对下列药物的使用情况进行推荐，如下表所示：实验例子4：假如剔除检测cyp2c19*2这个位点的相关引物，试剂盒检测得到如下结果：根据上面的结果，我们做出如下判读：由于cyp2c19参与了阿普唑仑等药物的代谢，所以缺少了对该基因位点的检测，将导致阿普唑仑等药物无法正确归类。由此证明，任何一个基因位点的引物缺失，都将影响该试剂盒的检测效果。实施例4具体案例我们将根据本发明提供的由序列seqidno.1-48组成的试剂盒应用于人精神疾病用药的指导，获得了非常好的临床治疗效果，详细说明如下：案例一案例一：患者张xx，男，23岁，未婚，主因凭空闻语，疑心被害，懒散2年于2017年12月21日入院，被诊断为精神分裂症。曾2次住当地医院，利醅酮治疗，症状缓解，但出现肢体发僵。1月前病情加重，凭空闻声，自语自笑，感到被议论、被监视，担心饭里有毒，认为父母也不是亲生的，拒药，睡眠差。我们采用试剂盒对该病患的dna样本进行基因检测，检测得到如下结果：根据上面的结果，我们做出如下判读：根据以上判读结果，我们做出了以下个体化用药指导建议：处理：逐渐停用利培酮，奥氮平逐渐增量至20mg/日，患者阳性症状逐渐减少，治疗2周panss46分，治疗4周幻觉、妄想完全消失，自知力恢复，并能积极参加康复训练，无明显副作用，复查催乳素水平正常。住院治疗3月，panss34分，达临床痊愈出院。随访：患者服药依从性好，能参与相应的劳动。案例二：余xx，男，23岁，未婚。患者意识清楚，定向力完整，在家属陪同下自行步入病房，衣着适时，整洁，入病房后表现接触被动，注意力不集中，谈话时，心不在焉，东张西望。称周围人都针对自己，自己时常有攻击他人的想法，所以不敢出门。自己的想法不说出来其他人也知道。情感与周围环境不相符，情感反应不协调，意志缺乏，生活懒散，个人卫生需督促料理。患者否认自己有病，无任何治疗要求，无自知力。诊断为“精神分裂症”。病史：患者于6年前无明显诱因出现精神失常，表现认为别人都在针对他，他人吐口水都是针对他，上课不能听讲，不能坚持学业，由家属带患者前往常州102医院治疗，诊断“精神分裂症”，具体用药不详，住院1月，患者病情并未好转。随即患者家属带患者前往上海精神卫生中心住院治疗，诊断“精神分裂症”，经行奥氮平片10mg/日治疗，患者病情好转出院。出院后患者未坚持服用服药，病情反复，于2015年在次送往上海精神卫生中心住院治疗，诊断“精神分裂症”，经行奥氮平片10mg/日及马来酸氟伏沙明200mg/日治疗，患者病情稍好转出院。患者出院后一直坚持服用奥氮平片10mg/日及马来酸氟伏沙明200mg/日治疗，但患者病情改善不明显，精神症状依旧存在，依旧认为有许多人针对自己，故不愿出门。于2016年前往鄱阳当地精神病院门诊治疗，增用氨磺必利0.2/日治疗，但患者病情改善不明显。现近两月来患者病情加重，患者自诉控制不住脑中的想法，时常出现想伤人的想法。基因检测前用药情况：奥氮平由10mg/日渐渐加至25mg/日并持续80天，同时联用马来酸氟伏沙明100mg/日及丙戊酸镁缓释片1.0/日。基因检测结果：根据上面的结果，我们做出如下判读：根据以上判读结果，我们做出了以下个体化用药指导建议：检测后处理结果及随访：第一周：奥氮平15mg/日，氨磺必利0.2/日，氟伏沙明100mg/日，齐拉西酮40mg/日。出现想要伤人的想法，担心自己伤害他人，不敢出门，出现言语性幻听，有自杀想法。第二周：氨磺必利0.4/日，氟伏沙明100mg/日，齐拉西酮80mg/日。幻听基本消失，但仍然不愿出门，担心自己伤害他人第三周：氨磺必利0.5/日，氟伏沙明200mg/日，齐拉西酮80mg/日。幻听消失，担心自己伤害他人的想法仍然存在，但自己能控制。第四周：氨磺必利0.5/日，氟伏沙明200mg/日，齐拉西酮80mg/日。可以自行出门，偶有伤害他人的想法，但不会过分关注。案例三：赵某，女，36岁，意识清，接触被动，思维迟缓，情感低落，焦虑，有自杀观念，意志活动减退，自知力缺如，心情差，心烦3个月。1月前到被诊断为“重度抑郁症”，给予“舍曲林(200mg/d)”，”劳拉西泮(3mg/d)”治疗，效果欠佳，为求治疗入我院。自发病以来，患者饮食、睡眠均欠佳，二便可。曾出现自杀观念。否认既往出现兴奋话多等表现。入院后治疗:度洛西汀60mg/d；3周后患者仍旧心情差，进行基因检测。基因检测结果如下：根据上面的结果，我们做出如下判读：根据以上判读结果，我们给出个体化用药指导建议如下：4周后，根据检测结果：艾司西酞普兰为直接使用类，换为艾司西酞普兰。换药后一周抑郁缓解。一月后随访情况良好。以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。sequencelisting<110>上海康黎医学检验所有限公司<120>一种用于指导人精神疾病用药的试剂盒及其检测方法<160>100<170>patentinversion3.5<210>1<211>40<212>dna<213>人工序列<400>1acgttggatgacgttggatgagaccacaatgttaggaggg40<210>2<211>40<212>dna<213>人工序列<400>2acgttggatgacgttggatgcaggagaaggtgaaccatgc40<210>3<211>40<212>dna<213>人工序列<400>3acgttggatgacgttggatgactgctccagcgacttcttg40<210>4<211>40<212>dna<213>人工序列<400>4acgttggatgacgttggatgatagggttggagtgggtggt40<210>5<211>41<212>dna<213>人工序列<400>5acgttggatgacgttggatgccatttggtagtgaggcaggt41<210>6<211>42<212>dna<213>人工序列<400>6acgttggatgacgttggatggccatgtataaatgcccttctc42<210>7<211>40<212>dna<213>人工序列<400>7acgttggatgacgttggatgtccacagtgctgtcagaatc40<210>8<211>40<212>dna<213>人工序列<400>8acgttggatgacgttggatggagggccttaaaagtcatgc40<210>9<211>40<212>dna<213>人工序列<400>9acgttggatgacgttggatgactaggtaccccattctagc40<210>10<211>40<212>dna<213>人工序列<400>10acgttggatgacgttggatgccatggtgtctttgctttcc40<210>11<211>40<212>dna<213>人工序列<400>11acgttggatgacgttggatgtagctgcaagtccccaaaat40<210>12<211>44<212>dna<213>人工序列<400>12acgttggatgacgttggatgtttcctgaaaagattatctgatgc44<210>13<211>40<212>dna<213>人工序列<400>13acgttggatgacgttggatgctcatctcctgccaaagaag40<210>14<211>40<212>dna<213>人工序列<400>14acgttggatgacgttggatggggtgatacatacacaaggg40<210>15<211>40<212>dna<213>人工序列<400>15acgttggatgacgttggatgttttgaggcgggaacgcaac40<210>16<211>39<212>dna<213>人工序列<400>16acgttggatgacgttggatgaggacccagcctgcaatca39<210>17<211>40<212>dna<213>人工序列<400>17acgttggatgacgttggatgtgtgcagctcactccatcct40<210>18<211>40<212>dna<213>人工序列<400>18acgttggatgacgttggatgcaacacagccatcctcaaag40<210>19<211>40<212>dna<213>人工序列<400>19acgttggatgacgttggatgtagctctggaagctgtggaa40<210>20<211>39<212>dna<213>人工序列<400>20acgttggatgacgttggatgcgagaattttcagaagaga39<210>21<211>39<212>dna<213>人工序列<400>21acgttggatgacgttggatggaccggtgactcacacctg39<210>22<211>43<212>dna<213>人工序列<400>22acgttggatgacgttggatgtcatcaagctacacatgatcgag43<210>23<211>40<212>dna<213>人工序列<400>23acgttggatgacgttggatgcaataaagtcccgagggttg40<210>24<211>41<212>dna<213>人工序列<400>24acgttggatgacgttggatggatatgcaataattttcccac41<210>25<211>40<212>dna<213>人工序列<400>25acgttggatgacgttggatgccagatttggtcaatacagg40<210>26<211>40<212>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