一种联合检测人类全基因座组InDel遗传标记的复合扩增体系及其试剂盒和应用的制作方法

本发明属于生物技术与遗传学技术领域，尤其涉及一种联合检测人类全基因座组indel遗传标记的复合扩增体系及其试剂盒和应用，其用于检测人类常染色体和性别染色体上具有良好遗传多态性的插入/缺失(insertion/deletion，indel)分子遗传标记，具体涉及适用于法医学研究应用的45个indel遗传标记。

背景技术：

目前，用于法医遗传学检测的主要遗传标记为多态性短串联重复序列(shorttandemrepeat，str)，在应用中发现其存在突变率高、pcr扩增片段长、可用标记数量有限等缺陷。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)作为第三代遗传标记，是在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的dna序列多态性，与str相比，具有相对较低的突变率，约10^-8；snp扩增子相对较短，容易实现多个位点的复合扩增，有利于降解检材的分型。然而，snp位点的检测技术复杂多样，检测平台多样，难以实现法医实验室间普及。插入/缺失(insertion/deletion，indel)遗传标记表现为dna片段的插入或缺失形成的二等位基因长度多态性，兼具snp和str的特征，二态的分型结果易于分析和检测，灵活的扩增产物大小可以实现对降解检材的分型。indel遗传标记本质上属于snp位点，但是从某种角度看，str遗传标记也可看作是多等位基因的indel，不同的等位基因看成重复单元的插入与缺失不同。更为重要的是indel遗传标记可以通过长度多态性进行分型，在法医实验室必备的毛细管电泳检测平台上就可以完成分型，因而受到了国内外学者的关注。目前，市场上仅有一款针对indel标记检测的商业化试剂盒：德国qiagen公司的investigatordipplexkit。除此以外，国内外法医dna实验室的研究大都针对常染色体或x染色体上30个左右的indel标记，法医学效能较为局限。因此，开发一款适用于中国人群、包含位于不同染色体上、更多数目的indel标记的检测试剂盒对于我国法医学、群体遗传学等研究及应用具有重要意义。

技术实现要素：

本发明针对现有indel研究中的不足，提供一种适用于中国人群法医学应用的45个indel遗传标记的复合扩增体系及其试剂盒和应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种联合检测人类全基因座组indel遗传标记的复合扩增体系，其包括45个indel遗传标记的扩增引物，其中27个位于常染色体的indel、16个位于x染色体的indel、2个位于y染色体的indel；

其中，所述45个indel遗传标记为af05(rs71953876)，af09(rs45332265)，xf39(rs5903978)，xf09(rs72513349)，af18(rs2308232)，af20(rs10666410)，xf02(rs3048996)，af27(rs35248926)，af29(rs2308139)，af33(rs201273179)，af35(rs2308276)，af37(rs66879403)，af44(rs45833136)，ah02(rs3033486)，ah07(rs16458)，ah15(rs3837647)，xh22(rs112397470)，ah23(rs10578778)，xh13(rs2308280)，ah28(rs2307661)，xh26(rs66554185)，ah45(rs1160953)，ah49(rs2067373)，xh03(rs36094418)，at03(rs66850318)，at17(rs2307507)，xt10(rs764329515)，yt82(rs2032675)，xt36(rs36208458)，at19(rs1610878)，xt32(rs67266231)，xt15(rs5902185)，at36(rs2307805)，xt12(rs63345861)，xt18(rs16397)，at53(rs2307783)，yt17(rs3908)，ar08(rs112052995)，ar12(rs112250269),xr38(rs200177947)，ar21(rs3049448)，xr28(rs199686249)，ar43(rs66481141)，ar40(rs2307963)，xr53(rs3050111)。

为了进一步优化上述复合扩增体系，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述45个indel遗传标记的复合扩增系统中基因座的扩增子长度小于280bp，适用于检测降解检材。

进一步地，所述扩增引物序列如seqidno.1-90所示，每对扩增引物的反应终浓度为0.05～0.68μm。

进一步地，每对扩增引物中至少一条引物采用荧光染料标记，所述荧光染料选自fam、hex、trmra、rox。

进一步地，所述复合扩增体系包括：2.5×pcr反应预混液ⅳ、引物混合液、去离子水以及基因组dna。

进一步地，所述扩增反应体系的总体积为20μl，2.5×pcr反应预混液ⅳ为4μl，引物混合液为4μl，基因组dna的终浓度为0.5ng～2ng，其余用去离子水补足。

进一步地，所述基因组dna需从人体样本，如血液(血斑)、精液(精斑)、唾液(唾液斑)、骨骼、毛发、人体组织等采集，采用磁珠法、酚氯仿法、树脂纯化等方法进行提取及定量。

进一步地，所述2.5×pcr反应预混液ⅳ包括50mmkcl、10mmtris-hcl、2.0mmmgcl2、0.2mg/ml牛血清白蛋白和0.2mmdntp。

进一步地，所述复合扩增体系的扩增程序为：95℃，预变性5分钟；94℃，30秒，58℃，1分钟，70℃，1分钟，循环30次；60℃，保温60分钟；4℃，保温。

进一步地，所述复合扩增反应在在各种反应热循环仪上进行，所述反应热循环仪包括但不限于：abi9700、abi9600、abi2720、bio-radicycler、bio-radc1000等。

进一步地，所述复合扩增体系还包括：分型检测分子量内标org-500sizestandard，所述分子量内标采用liz荧光标记，荧光校正采用5-dyematrixstandards。

本发明的第二个目的是提供一种含有任一上述的联合检测人类全基因座组indel遗传标记的复合扩增体系的试剂盒。

本发明的第三个目的是提供一种任一上述的联合检测人类全基因座组indel遗传标记的复合扩增体系或试剂盒在个体识别、亲权鉴定中的应用。

进一步地，所述应用的检测方法包括：采用seqidno.1-90所示序列的扩增引物对基因组dna样本进行pcr复合扩增；取pcr扩增产物，与适量的分子量内标试剂、甲酰胺混匀；混合物在95℃变性3min，随后置冰上冷却3min；采用遗传分析仪进行分型检测。

进一步地，所述pcr扩增产物、分子量内标试剂、甲酰胺的用量如下：1μlpcr扩增产物、8.5μl甲酰胺、0.5μl分子量内标。

进一步地，所述遗传分析仪包括但不限于：3100系列、3130系列、3500系列遗传分析仪。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

本发明开发了适用于中国人群、包含位于不同染色体上、更多数目的indel标记的检测试剂盒，为我国法医学研究中个体识别、亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定等法医学实际工作提供了新的补充检测手段，对于我国法医学、群体遗传学等研究及应用具有重要意义。

附图说明

图1为本发明一实施例中标准品dna9948经该复合扩增试剂盒检测后在45个indel标记的基因分型图谱。

图2为本发明一实施例中45个indel复合扩增试剂盒对dna样本的检测结果。

图3为本发明一实施例中采用常规str分型试剂盒对dna样本的检测结果。

具体实施方式

本发明涉及一种联合检测人类全基因座组indel遗传标记的复合扩增体系及其试剂盒和应用，该复合扩增体系包括45个indel遗传标记的扩增引物，其中27个位于常染色体的indel、16个位于x染色体的indel、2个位于y染色体的indel。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例为含有联合检测人类全基因座组indel遗传标记的复合扩增体系的试剂盒及其相应的检测方法。其包括：

1.适用于法医学应用的indel遗传标记筛选；

基于不同数据库，筛选适用于中国主要人群、具有高个人识别能力，覆盖于人类常染色体及性别染色体上的indel遗传标记。具体筛选原则如下：以美国加州大学圣克鲁兹分校(universityofcaliforniasantacruz，ucsc)人类基因组生物信息学中心(ucscthegenomebioinformaticsgroup)开发和维护的银河系统(galaxy)中的人类基因组浏览器(genomebrowser)为筛选工具，结合dbsnp数据库，按以下拟定标准进行indel标记筛选：①indel等位基因长度(插入或缺失的碱基)≥1bp且＜30bp；②位于内含子区域；③dbsnp数据库中该indel标记的最低等位基因频率(minorallelefrequency，maf)>0.1；④散布于人类不同常染色体和性染色体；⑤同一条染色体上的indel标记间距不小于5mb；⑥同一条染色体上indel标记不形成连锁，且在中国汉族人群中的分布符合hardy-weinberg遗传平衡。

最终选取的45个indel遗传标记为：af05(rs71953876)，af09(rs45332265)，xf39(rs5903978)，xf09(rs72513349)，af18(rs2308232)，af20(rs10666410)，xf02(rs3048996)，af27(rs35248926)，af29(rs2308139)，af33(rs201273179)，af35(rs2308276)，af37(rs66879403)，af44(rs45833136)，ah02(rs3033486)，ah07(rs16458)，ah15(rs3837647)，xh22(rs112397470)，ah23(rs10578778)，xh13(rs2308280)，ah28(rs2307661)，xh26(rs66554185)，ah45(rs1160953)，ah49(rs2067373)，xh03(rs36094418)，at03(rs66850318)，at17(rs2307507)，xt10(rs764329515)，yt82(rs2032675)，xt36(rs36208458)，at19(rs1610878)，xt32(rs67266231)，xt15(rs5902185)，at36(rs2307805)，xt12(rs63345861)，xt18(rs16397)，at53(rs2307783)，yt17(rs3908)，ar08(rs112052995)，ar12(rs112250269)，xr38(rs200177947)，ar21(rs3049448)，xr28(rs199686249)，ar43(rs66481141)，ar40(rs2307963)，xr53(rs3050111)，括号中的rs号表示该遗传标记在dbsnp数据库的编号。45个indel遗传标记包含27个位于常染色体的indel、16个位于x染色体的indel、2个位于y染色体的indel。

2.设计扩增引物组分；

建立包含五色荧光标记(fam、hex、tamra、rox和liz)的复合扩增检测试剂盒，分子量内标采用liz荧光标记(org-500)。

本实施例所述的indel遗传标记及其对应的扩增引物序列、标记荧光和在引物池(primermix)中的终浓度如表1所示。

表1-45个indel遗传标记及其对应的扩增引物序列与浓度

3.多重pcr扩增体系的构建与优化；

对构建的indel复合扩增分型体系进行包括引物配比浓度、dna模板量、退火温度等pcr反应条件的调整优化，得到均衡稳定的pcr产物分型结果，实现45个indel遗传标记的复合扩增，建立包含上述indel遗传标记的复合扩增检测体系。

本实施例所述45个indel标记的检测体系如表2所示，其中2.5×pcr反应预混液ⅳ包括50mmkcl、10mmtris-hcl(ph8.3，25℃)、2.0mmmgcl2、0.2mg/mlbsa(牛血清白蛋白)和0.2mm的dntp。dna需从人体样本，如血液(血斑)、精液(精斑)、唾液(唾液斑)、骨骼、毛发、人体组织等采集，采用磁珠法、酚氯仿法、树脂纯化等方法进行提取及定量。

表2-包含45个indel标记的复合扩增试剂盒的反应体系

反应体系在各种反应热循环仪上(如abi9700、abi9600、abi2720、bio-radicycler、bio-radc1000等)采用以下的程序可以得到良好的结果：95℃，预变性5分钟；94℃，30秒，58℃，1分钟，70℃，1分钟，循环30次；60℃，保温60分钟；4℃，保温。

4.分析方法的建立与复合扩增产物的检测；

建立3100系列、3130系列、3500系列遗传分析仪光谱校正(matrix)文件。毛细管电泳加样时，1μlpcr产物与8.5μl甲酰胺、0.5μl分子量内标(org-500)混合；混合物在95℃变性3min，随后置冰上冷却3min；采用上述型号遗传分析仪对45个indel遗传标记进行分型检测。通过毛细管电泳获得各标记不同等位基因的电泳迁移参数，并以此为基础，分别根据genemapperidv3.2.1和id-xv1.5软件的格式要求编写相应的bin文件和panel文件，创建电泳分析方法。将indel标记中的插入(insertion)等位基因命名为1，缺失(deletion)等位基因命名为0。

其中，标准品dna9948经该复合扩增试剂盒检测后在45个indel标记的基因分型图谱如图1所示。

实施例2

本实施例为实施例1构建的试剂盒在检测降解检材中的应用。

1.收集用福尔马林固定、石蜡包埋的人体组织检材，提取样本dna；

2.分别采用实施例1中包含45个indel标记的复合扩增试剂盒和包含21个str基因座的sifastrtm23-plex试剂盒对步骤1中的dna进行扩增检测，分型图谱分别如图2和图3所示。

法医学实践工作中的多种生物检材受到环境中温度、湿度、生物或化学等复杂因素的影响，其dna分子容易被破坏，dna链发生断裂。如图2所示，采用本实施例所述的indel复合扩增试剂盒的扩增产物短，有利于降解检材的分型检测，提供了更多的dna遗传证据；而图3所示的sifastrtm23-plex系统为常规str复合扩增试剂盒，扩增如上述降解dna样本时，常常无法检出大片段str基因座，造成等位基因的丢失。

实施例3

本实施例为实施例1构建的试剂盒的法医学验证工作。

按照dna分析方法科学工作组(scientificworkinggroupfordnaanalysismethods，swgdam)要求对实施例1构建的试剂盒进行灵敏度、特异性、准确性、适用性以及法医学参数计算。结果显示实施例1构建的试剂盒具有高灵敏度，在dna模板量低至62.5pg时可以获得45个indel遗传标记的完整基因分型；具有种属特异性，仅对人源性dna进行有效扩增；准确性高；适用于多种类型检材的dna分型；本发明所述的27个常染色体indel遗传标记在汉族群体的累积个体识别效能(combinedpowerofdiscrimination，cpd)达到0.999999以上，二联体和三联体累积非父排除概率(combinedpowerofexclusioninduosandtrios，cped和cpet)分别为0.955118和0.997754；对于16个x染色体indel遗传标记，在女性群体中的累积个体识别概率(cpdfemale)为0.999998，在男性群体中的累积个体识别概率(cdpmale)为0.999845，二联体和三联体的累积平均排除率(cmectrio和cmecduo)分别为0.976220和0.998163。y染色体上的两个indel标记在检测样本中均能达到性别判断的要求，在所有男性样本中检测到单一峰，在女性样本中均未检见。

由上述实施例可知，本发明所述的联合检测人类全基因座组indel遗传标记的复合扩增体系的试剂盒为我国法医学研究中个体识别、亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定等法医学实际工作提供了新的补充检测手段。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>司法鉴定科学研究院

<120>一种联合检测人类全基因座组indel遗传标记的复合扩增体系及其试剂盒和应用

<130>ipi192538

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<213>扩增af35的下游引物(artificialsequence)

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<213>扩增xh22的下游引物(artificialsequence)

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<213>扩增xh13的下游引物(artificialsequence)

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<213>扩增ah28的上游引物(artificialsequence)

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<213>扩增ah28的下游引物(artificialsequence)

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<212>dna

<213>扩增ah49的上游引物(artificialsequence)

<400>45

taactgacatgtagctaatactgatacgcac31

<210>46

<211>29

<212>dna

<213>扩增ah49的下游引物(artificialsequence)

<400>46

agaaaggaaataacatgtaccagcaattc29

<210>47

<211>23

<212>dna

<213>扩增xh03的上游引物(artificialsequence)

<400>47

gtgcctaatttatgacccactca23

<210>48

<211>22

<212>dna

<213>扩增xh03的下游引物(artificialsequence)

<400>48

agacaaacatttttcaagggca22

<210>49

<211>26

<212>dna

<213>扩增at03的上游引物(artificialsequence)

<400>49

ttgttgccaaatactgtcaatgctac26

<210>50

<211>26

<212>dna

<213>扩增at03的下游引物(artificialsequence)

<400>50

cagaactaccagggctgtaagttctg26

<210>51

<211>24

<212>dna

<213>扩增at17的上游引物(artificialsequence)

<400>51

cgctttagggctttgaaattactg24

<210>52

<211>24

<212>dna

<213>扩增at17的下游引物(artificialsequence)

<400>52

ccgtcttagtttgcataaaaccct24

<210>53

<211>22

<212>dna

<213>扩增xt10的上游引物(artificialsequence)

<400>53

cgaaagggagcatctactccag22

<210>54

<211>22

<212>dna

<213>扩增xt10的下游引物(artificialsequence)

<400>54

ctagggcaatccagaattggac22

<210>55

<211>24

<212>dna

<213>扩增yt82的上游引物(artificialsequence)

<400>55

cgcaagacaaagggaataaagatc24

<210>56

<211>24

<212>dna

<213>扩增yt82的下游引物(artificialsequence)

<400>56

cgaacaaacctacctggaaacata24

<210>57

<211>26

<212>dna

<213>扩增xt36的上游引物(artificialsequence)

<400>57

tgtaaagctacaccaatggacagatg26

<210>58

<211>26

<212>dna

<213>扩增xt36的下游引物(artificialsequence)

<400>58

tgcaaagattaagtgcattttctctg26

<210>59

<211>27

<212>dna

<213>扩增at19的上游引物(artificialsequence)

<400>59

taggcaatagtaagaagcacagatacc27

<210>60

<211>24

<212>dna

<213>扩增at19的下游引物(artificialsequence)

<400>60

ctcggcagttaatgacagtgatgt24

<210>61

<211>25

<212>dna

<213>扩增xt32的上游引物(artificialsequence)

<400>61

caaattgactatagccttccaccct25

<210>62

<211>25

<212>dna

<213>扩增xt32的下游引物(artificialsequence)

<400>62

tgccttcctctcattgacttcataa25

<210>63

<211>28

<212>dna

<213>扩增xt15的上游引物(artificialsequence)

<400>63

ttcccagatttgaaatgtatgaaactct28

<210>64

<211>26

<212>dna

<213>扩增xt15的下游引物(artificialsequence)

<400>64

ccttagtgccttgttagaaggaatga26

<210>65

<211>26

<212>dna

<213>扩增at36的上游引物(artificialsequence)

<400>65

agtaattgagccatactacccgaact26

<210>66

<211>25

<212>dna

<213>扩增at36的下游引物(artificialsequence)

<400>66

aatccatgtaaaacctgataaccca25

<210>67

<211>26

<212>dna

<213>扩增xt12的上游引物(artificialsequence)

<400>67

ccttattttgtgccttttattcttgg26

<210>68

<211>26

<212>dna

<213>扩增xt12的下游引物(artificialsequence)

<400>68

tcctctaaattggggacctatgtgta26

<210>69

<211>22

<212>dna

<213>扩增xt18的上游引物(artificialsequence)

<400>69

ccagaggcagggaaatcagtta22

<210>70

<211>24

<212>dna

<213>扩增xt18的下游引物(artificialsequence)

<400>70

aagcctgtcatcttctcctcaaac24

<210>71

<211>25

<212>dna

<213>扩增at53的上游引物(artificialsequence)

<400>71

gtttggctttgtttgatttctgttg25

<210>72

<211>23

<212>dna

<213>扩增at53的下游引物(artificialsequence)

<400>72

tggtggtcaatgcctttgttcag23

<210>73

<211>23

<212>dna

<213>扩增yt17的上游引物(artificialsequence)

<400>73

ggtagataccctttggccttgtc23

<210>74

<211>23

<212>dna

<213>扩增yt17的下游引物(artificialsequence)

<400>74

gcttcttgtttctccaggctttt23

<210>75

<211>29

<212>dna

<213>扩增ar08的上游引物(artificialsequence)

<400>75

ctaaaaggctaagattaactaatggctct29

<210>76

<211>29

<212>dna

<213>扩增ar08的下游引物(artificialsequence)

<400>76

aaaggaaatgtagtacagaaaggtaacat29

<210>77

<211>25

<212>dna

<213>扩增ar12的上游引物(artificialsequence)

<400>77

atggagccacttccttaacccctca25

<210>78

<211>24

<212>dna

<213>扩增ar12的下游引物(artificialsequence)

<400>78

ccattcaattgcctttgacccaca24

<210>79

<211>23

<212>dna

<213>扩增xr38的上游引物(artificialsequence)

<400>79

ctttgggtgataggaggttttgc23

<210>80

<211>23

<212>dna

<213>扩增xr38的下游引物(artificialsequence)

<400>80

aacccctggtgctgtgtgtaaat23

<210>81

<211>26

<212>dna

<213>扩增ar21的上游引物(artificialsequence)

<400>81

ggaaacctataagccaggaagtagga26

<210>82

<211>26

<212>dna

<213>扩增ar21的下游引物(artificialsequence)

<400>82

acaaatatgtagagtgcaagggagca26

<210>83

<211>26

<212>dna

<213>扩增xr28的上游引物(artificialsequence)

<400>83

ccttctctggagtgcaattttaagtc26

<210>84

<211>21

<212>dna

<213>扩增xr28的下游引物(artificialsequence)

<400>84

ccaagccagccatttgttctt21

<210>85

<211>25

<212>dna

<213>扩增ar43的上游引物(artificialsequence)

<400>85

acagctttcaaacagataaggaagg25

<210>86

<211>20

<212>dna

<213>扩增ar43的下游引物(artificialsequence)

<400>86

ccttgggctgagaggactgt20

<210>87

<211>25

<212>dna

<213>扩增ar40的上游引物(artificialsequence)

<400>87

atgctggaaaggtggtgcctaaact25

<210>88

<211>25

<212>dna

<213>扩增ar40的下游引物(artificialsequence)

<400>88

tccttgaaatagtccttgggctggt25

<210>89

<211>26

<212>dna

<213>扩增xr53的上游引物(artificialsequence)

<400>89

cgccattgctattaagtagacctctt26

<210>90

<211>25

<212>dna

<213>扩增xr53的下游引物(artificialsequence)

<400>90

ccgcccatattttcctctattttct25