一种用于鉴别鹿角的引物探针组合物及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于鉴别鹿角的引物探针组合物及其应用。

背景技术：

中国药典2015年版规定鹿角来源为马鹿和梅花鹿，其饮片规格为极薄片和鹿角粉，无法从性状上加以区分，也没有专属的鉴别方法，造成了造假的重灾区，给鹿角市场造成了巨大冲击。

根据有关文献报道，目前已出现从dna分子水平对物种加以界定，每个物种的dna序列都存在有一定的不同，根据序列的snp位点来设计特异性引物和探针组合可以对物种进行有效鉴别，采用该分子水平的界别可作为传统形态鉴别方法的有效补充。

技术实现要素：

为了克服现有技术所存在的缺陷，本发明依据鹿科动物基因树，发现马鹿和梅花鹿遗传距离最小，并对其和其余鹿科动物进行dna序列比对，寻找snp位点，设计引物探针组合，以实现正伪品鹿角的鉴别。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种用于鉴别鹿角的引物探针组合物，其包括：引物f1、引物r1、探针p1；

其中，所述引物f1为如seqidno.1所示序列的单链dna分子，或为将seqidno.1所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的dna分子；

所述引物r1为如seqidno.2所示序列的单链dna分子，或为将seqidno.2所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的dna分子；

所述探针p1为如seqidno.3所示序列的单链dna分子，或为将seqidno.3所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的dna分子。

上述引物、探针的具体序列如下：

引物f1：5'-cgtctgaatcggattcgaaat-3'(seqidno.1)；

引物r1：5'-agtgagagccattgttatgaa-3'(seqidno.2)；

探针p1：5'-cacgagccacagaggcagca-3'(seqidno.3)。

进一步地，所述探针p1由荧光基团和荧光淬灭基团修饰；其中，所述荧光基团选自fam、vic、hex、joe、rox、cy5，所述荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2、tamra。更优选为，所述荧光基团为fam，所述荧光淬灭基团为bhq1。

进一步地，所述鉴别鹿角为鉴别正品鹿角与伪品鹿角或检测是否含有正品鹿角成分。

进一步地，所述正品鹿角为马鹿和梅花鹿，所述伪品鹿角包括其余18种鹿科动物以及猪、牛、羊，所述其余18种鹿科动物包括鹿亚科鹿属：白唇鹿，水鹿，坡鹿，泽鹿；麋鹿属：麋鹿；黇鹿属：黇鹿；花鹿属：斑鹿，豚鹿。麂亚科毛冠鹿属：毛冠鹿；麂属：小麂，赤麂，黑麂。空齿鹿亚科驯鹿属：驯鹿；驼鹿属：驼鹿；狍属：狍子；空齿鹿属：白尾鹿，黑尾鹿。獐亚科獐属：獐。

本发明的第二个方面是提供一种含有上述用于鉴别鹿角的引物探针组合物的试剂盒。

进一步地，所述试剂盒中，引物f1、引物r1、探针p1的浓度均为10μm。

进一步地，所述试剂盒还包括：反应预混液、dna模板、双蒸水。

进一步地，所述试剂盒采用的扩增反应体系为：反应预混液10μl，引物f1、引物r1、探针p1各0.5μl，dna模板2μl，双蒸水6.5μl；其中，各引物、探针在扩增反应体系中的浓度均为250nm，dna模板在扩增反应体系中的浓度为5ng/μl。

进一步，所述dna模板以dna溶液的形式加至反应体系中。

进一步地，所述反应预混液为包括pcr缓冲液、dntps和mg²⁺的2×taqmanmastermix。

进一步地，所述扩增反应体系的配制如下表所示：

进一步地，所述试剂盒还包括正品鹿角阳性对照品、阴性对照品以及空白对照品。

本发明的第三个方面是提供一种包含上述引物探针组合物或试剂盒的系统。

进一步地，所述系统还包括利用定量pcr鉴别正品鹿角和伪品鹿角所需要的仪器，包括但不限于pcr扩增仪等。

本发明的第五个方面是提供一种上述引物探针组合物、试剂盒或系统在鉴别鹿角中的应用。

进一步地，所述应用包括用于鉴别正品鹿角和伪品鹿角，或者用于检测待测鹿角样本中是否含有正品鹿角成分。

进一步地，所述鉴别正品鹿角和伪品鹿角的方法包括步骤：以待测鹿角的基因dna为模版，采用上述引物探针组合物进行荧光定量pcr，若结果显示为阳性，则待测鹿角为正品；若结果显示为阴性，则待测鹿角为伪品。

进一步地，所述检测待测鹿角样本中是否含有正品鹿角成分的方法包括步骤：以待测鹿角的基因dna为模版，采用上述引物探针组合物进行荧光定量pcr，若结果显示为阳性，则待测鹿角中包含正品鹿角成分；若结果显示为阴性，则待测鹿角不包含正品鹿角成分。

进一步地，在上述两个方法中，所述阳性结果具体可为ct值<25，所述阴性结果具体可为ct值≥25(或undet)。

本发明的第六个方面是提供一种上述试剂盒的制备方法，其包括各条引物、探针单独包装的步骤。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

本发明提供一种鉴别正品鹿角(马鹿，梅花鹿)和伪品鹿角的方法，其从分子水平对真伪鹿角进行区分，具有简单，快速，高特异性和高灵敏度的特点。

附图说明

附图仅用于对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。

图1为本发明一实施例中样本中含有马鹿成分的扩增图。

图2为本发明一实施例中样本中含有梅花鹿成分的扩增图。

图3为本发明一实施例中马鹿标准质粒orf1以10倍依次稀释的检测结果图。

图4为本发明一实施例中马鹿标准质粒的标准曲线图。

图5为本发明一实施例中梅花鹿标准质粒orf2以10倍依次稀释的检测结果图。

图6为本发明一实施例中梅花鹿标准质粒的标准曲线图。

图7为本发明一实施例中检测引物探针特异性的结果示意图。

具体实施方式

本发明涉及一种用于鉴别鹿角的引物探针组合物，其包括：引物f1、引物r1、探针p1；其中，所述引物f1为如seqidno.1所示序列的单链dna分子，或为将seqidno.1所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的dna分子；所述引物r1为如seqidno.2所示序列的单链dna分子，或为将seqidno.2所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的dna分子；所述探针p1为如seqidno.3所示序列的单链dna分子，或为将seqidno.3所示序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的dna分子。本发明还涉及含有上述引物探针组合物的试剂盒和系统及其应用。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的原料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径获得。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例涉及的试剂及仪器具体为：

所用试剂：柱式骨骼dna提取试剂盒购自北京百奥莱博生物科技有限公司。引物与探针组合、标准质粒由生工生物工程(上海)有限公司负责合成，2×taqmanmaster为罗氏公司lightcycler480probesmaster。

所用仪器：lightcycler480ii荧光定量pcr仪为罗氏公司产品。

实施例1

本实施例为用于鉴别鹿角的引物探针组合物的设计，其具体步骤如下：

对马鹿、梅花鹿和其余18种鹿科动物以及猪牛羊的线粒体完整基因进行序列分析、比对，获得了一套鉴别马鹿、梅花鹿与其余18种鹿科动物以及猪牛羊的引物探针组合，如下所示：

引物f1：5'-cgtctgaatcggattcgaaat-3'(seqidno.1)；

引物r1：5'-agtgagagccattgttatgaa-3'(seqidno.2)；

探针p1：5'-cacgagccacagaggcagca-3'(seqidno.3)；

探针p1的5'端采用fam荧光基团修饰，3'端采用bhq1淬灭基团修饰。

探针p1可同时检测到马鹿和梅花鹿成分。

实施例2

本实施例为采用实施例1所述的引物探针组合物鉴别正品、伪品鹿角的方法或检测是否含有正品鹿角成分的方法，其包括：

(1)鹿角dna的提取

参照北京百奥莱博柱式骨骼dna提取试剂盒说明书，从猪牛羊骨粉以及麋鹿、驯鹿、马鹿和梅花鹿鹿角粉中提取鹿角dna。

(2)定性鉴别模型的建立

以步骤(1)得到的总dna为模板，进行荧光定量pcr检测。

荧光定量pcr反应体系：引物f1、引物r1、探针p1各0.5μl，2×taqmanmaster10μl，dna模板2μl，ddh2o6.5μl。

各条引物探针在体系中的浓度为250nm，dna模板以dna溶液的形式加至反应体系中。

荧光定量pcr反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，共30个循环。

设置阳性对照组、阴性对照组，与待测样本同法提取dna作为模板，空白对照以双蒸水作为模板进行实验。

(3)对检测结果进行分析

如果ct值<25，结果为阳性；ct值≥25(或undet)，结果为阴性。

阴性对照应无ct值。

更具体地：若待测样品具有扩增曲线，并且ct值<25，说明待测样品为马鹿角(图1)、梅花鹿角(图2)或含有马鹿角成分(图1)、梅花鹿角成分(图2)；若待测样品不具有扩增曲线，说明待测样品为伪品鹿角。

阳性对照应具有扩增曲线，且ct值<25，阴性对照及空白对照应无扩增曲线。

实施例3

本实施例为正品鹿角成分的标准曲线的制作过程，该标准曲线用于检测结果的定量，其包括：

1)标准质粒的制备

根据物种间序列比对情况，分别选取由f1、r1引物扩增的马鹿及梅花鹿dna片段(226bp)，交由生物公司插入puc57载体制成标准质粒orf1和orf2。

2)标准曲线的绘制

制作标准质粒orf1(2.98×10¹²copies/μl)，orf2(3.70×10¹²copies/μl)，分别作为马鹿和梅花鹿的标准品，计算拷贝数，并以10倍的梯度稀释标准质粒，通过qpcr来绘制标准曲线，并验证该引物探针组合的敏感性。

标准曲线荧光定量pcr反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，共30个循环。

图3为马鹿标准质粒orf1以10倍依次稀释的检测结果：其中每个梯度做三次重复。

图4为马鹿标准质粒orf1的标准曲线。

图5为梅花鹿标准质粒orf2以10倍依次稀释的检测结果：其中每个梯度做三次重复。

图6为梅花鹿标准质粒orf2的标准曲线。

3)敏感性实验

根据所得标准曲线的方程以及仪器所能检测到的最大ct值25，计算得出：最低可检测到8.494×10⁷copies/μl的马鹿dna和7.680×10⁷copies/μl的梅花鹿dna。

实施例4

本实施例为实际样本的检测，待测样本为一份猪骨粉样本、一份牛骨粉样本、一份羊骨粉样本、一份麋鹿角粉样本、一份驯鹿角粉样本、一份马鹿角粉样本和一份梅花鹿角粉样本。

采用实验例2中的方法进行检测，结果如图7所示。

结果判定：样品具有扩增曲线并且ct值在25以内为正品鹿角(马鹿和梅花鹿)，样品无扩增曲线均为伪品。

定量结果：梅花鹿、马鹿样品ct值分别为17.88、21.47，经标准曲线方程换算，其起始dna拷贝数分别为2.42×10¹¹copies/μl和1.82×10¹⁰copies/μl。

上述结果表明，利用本发明的方法鉴别正伪品鹿角，结果准确可靠，特异性好，并且可以精确对样本起始拷贝数进行定量。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>上海市食品药品检验所

<120>一种用于鉴别鹿角的引物探针组合物及其应用

<130>ipi192584

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>引物f1(artificialsequence)

<400>1

cgtctgaatcggattcgaaat21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>引物r1(artificialsequence)

<400>2

agtgagagccattgttatgaa21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>探针p1(artificialsequence)

<400>3

cacgagccacagaggcagca20