基因TaPT13在提高植物对禾顶囊壳小麦变种抗性方面的应用的制作方法

本发明属于农业生物领域，具体涉及基因tapt13在提高植物对禾顶囊壳小麦变种抗性方面的应用。

背景技术：

磷是植物生长发育所必需的第二大元素，它广泛参与了能量的转移、信号转导、大分子的生物合成、光合作用以及调控呼吸和其他的代谢过程，对植物生长具有重要作用。磷在土壤中主要以复合体、不溶物及有机形式存在，而植物主要以无机磷形式获取磷，因而土壤中的磷难以被植物吸收利用。植物应对低磷环境的胁迫进化出了一系列有效的策略来促进磷的吸收和利用，包括改变根系结构、根系分泌有机酸和磷酸酶、改变生物膜结构及代谢途径，以及与丛枝菌根建立共生关系促进磷的吸收等。

丛枝菌根(arbuscularmycorrhiza,am)是自然界中最古老且分布最广泛的植物共生体。作为活体共生菌，am真菌从植物体内吸收碳源维持自身的生长，同时am真菌促进植物吸收矿质元素，植物根系获取的磷几乎都是通过菌根吸收。am真菌促进植物对磷的吸收和利用有以下三个原因：第一，菌根的根外菌丝扩大了磷的吸收范围；第二，am真菌在生长过程中可分泌质子和酸性磷酸酶，加快土壤中有机磷的酸化，提高有机磷的含量；第三，am真菌在低磷条件下激发了菌根特异性植物高亲和力磷转运蛋白的表达，从而提高植物对磷的吸收。

植物为了适应低磷的环境，进化出了低亲和力磷转运系统和高亲和力磷转运系统。低亲和力转运蛋白在高磷浓度时发挥作用，高亲和力转运蛋白在低磷浓度时发挥作用，已发现的磷转运蛋白基因主要分为4个家族：pht1、pht2、pht3、pht4。pht2、pht3和pht4的大部分家族成员为低亲和力磷转运蛋白，而pht1大部分成员为高亲和力转运蛋白。目前，通过基因组测序和同源基因克隆的方法，已分离鉴定出多个pht1蛋白。拟南芥的pht1家族包括9个成员。在番茄、土豆、辣椒和茄子等茄科植物也分别已经分离到了5个成员，pht1；3受菌根诱导增强表达，pht1；4和pht1；5是菌根特异的磷转运蛋白基因，马铃薯的stpt3在菌根共生的根系表达量显著升高，该基因是第一个被克隆并进行功能验证的菌根诱导磷转运蛋白。在单子叶模式植物水稻的13个pht1家族成员中，ospt11是第一个鉴定的菌根特异磷转运蛋白，主要在丛枝细胞中表达且蛋白定位在围丛枝膜上；ospt13是菌根诱导的磷转运蛋白，它参与了菌根共生水稻磷的吸收。双子叶植物苜蓿中发现了ospt11的同源基因mtpt4，它定位在围丛枝膜上，是am共生所必需的。

以往对磷转运蛋白的研究主要集中在植物对无机磷酸盐的吸收和再分配中的作用，磷转运蛋白在植物防御中的作用鲜有报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基因tapt13的应用。

本发明的再一目的在于提供蛋白tapt13的应用。

根据本发明具体实施方式的丛枝菌根特异的磷转运蛋白基因tapt13的应用，其可提高植物抗病性，尤其是提高小麦对禾顶囊壳小麦变种抗性，并且还能够同时促进小麦对磷的高效吸收。

根据本发明具体实施方式的基因tapt13，其为植物丛枝菌根特异的磷转运蛋白，来源于普通面包小麦(triticumaestivum)，在ncbi的genbank中登录号为kx130942.1，其核苷酸序列如seqidno.1所示：

atgccatggcggcagccaacacaggcattgatggcacggaagcagctcaaggtgctccatgccctcgacattgcgacgacgcaggtgtaccacttcaccgccatcgcaatcgccggcatgggcttcttcactgatgcctacgacctcttctccatttccctcgtcaccgacctcctcggccgcatttactacacggacggtgtcctccctgtcggcgtctcggcgcttgtcaacggtgttgcactatgcggcacggtggtcgggcagctcttcttcggatggctcggcgacaaggtgggccggcggcacatctatggtgtcaccctgaagctcatggtcatctgctccatcgcctccggcctctccttccaccgttcacgcaagagcgtcattaccacgctctgtttttttcgtttttggcttggctttggcatcggtggcgactatccactctccgctacgatcatggcggagtacgcaaataagaagactcgtggcgccttcattgccgctgtattcgccatgcagggtctaggaaatcttgctgctggaatagttgccataatcgtctcacagtcattcaagcatgcaccaggatatgaccatgacccacactggcacgctgactatgtgtggcgtataattctcatggtaggcgccatccctgctatcctgacttattattggcgcatgaggatgcccgagacggcacgctttacggcgctcatagctaaggacatcaagaaagcttcttcaaacatggccttggtccttaacatcgacatcgtggctgaaatagaagaggctgatgtgttcaacagagagcatgagtttggtttcttcaccatggagttcgtccatcgacatggcctccacctccttagcaccatgatctgttggtttatgcttgacatgtcattttacctgctcaacctgttcatgaagaacatctttaccgaagttcgattcatcaaagatgcaagcacaatgagcccgcttgaccaaacatacaacatagcaagaacccaagctctcattaccgtcattggcacgttgccgggcttcttctttgcagtcaagttcatggacagaattggtcgaatcaagatgcaaattgtaggattcattatgatgagcgtcttcatgctcgggcttgctattccacaagtgttatcgaaaacgatatggtattctcgctacgggaacatctacttcattgtcatttactcggcaataatgttcttcactgacttcggccccaactcgaccactttcatccttccagcagagatcttcccagcacgtatgcggtcaacatgccacggcatagccggtgctggcgggaagggtggtgctatcactggtgtgctttggttcctatatgccaataaaggtctcccaattattctcttcgtgctagttggttgcaacataattggcttggtgttcacgctcatcttaccagaaaccaaaaagaggtcccttgaagaggtcactggtgaaagaggaaatgatgaggaccagggaggtttttctcttgtgagaacacctctatttactatatag

磷转运蛋白基因tapt13编码的蛋白质，其氨基酸序列为seqidno.2：mpwrqptqalmarkqlkvlhaldiattqvyhftaiaiagmgfftdaydlfsislvtdllgriyytdgvlpvgvsalvngvalcgtvvgqlffgwlgdkvgrrhiygvtlklmvicsiasglsfhrsrksvittlcffrfwlgfgiggdyplsatimaeyankktrgafiaavfamqglgnlaagivaiivsqsfkhapgydhdphwhadyvwriilmvgaipailtyywrmrmpetarftaliakdikkassnmalvlnidivaeieeadvfnrehefgfftmefvhrhglhllstmicwfmldmsfyllnlfmkniftevrfikdastmspldqtyniartqalitvigtlpgfffavkfmdrigrikmqivgfimmsvfmlglaipqvlsktiwysrygniyfiviysaimfftdfgpnsttfilpaeifparmrstchgiagaggkggaitgvlwflyankglpiilfvlvgcniiglvftlilpetkkrsleevtgergndedqggfslvrtplfti

本发明确定tapt13基因为一种丛枝菌根特异的磷转运蛋白基因，在植株接种禾顶囊壳小麦变种后，tapt13基因表达量显著提高；而植株中沉默tapt13基因后，植物的感病性增加，且抗病标志基因表达量下降。所述植物为禾本科植物，包括小麦、稻米、玉米、大麦或高粱等。因此，tapt13基因可用于提高小麦对禾顶囊壳小麦变种抗性，在植物育种、栽培中具有广阔的应用空间。

附图说明

图1显示在不同磷浓度下野生型小麦根系与丛枝菌根共生后tapt13基因的表达量分析情况；

图2显示tapt13基因在野生型小麦根系接种禾顶囊壳小麦变种菌不同时间点的表达量分析情况；

图3显示沉默tapt13基因增强了对禾顶囊壳小麦变种菌的感病性；a和b分别为对照植株和tapt13-vigs沉默植株接种禾顶囊壳小麦变种菌发病部位的显微分析；c和d分别为对照植株和tapt13-vigs沉默植株接种禾顶囊壳小麦变种菌发病部位的表型分析；

图4显示tapt13基因和抗病标志基因的表达量变化情况；a为对照植株和tapt13-vigs沉默植株的根和叶中tapt13基因的表达量变化；b为对照植株和tapt13-vigs沉默植株中抗病标志基因的表达量变化。

具体实施方式

植物材料和病原菌培养

供试的小麦品种为周麦26；am真菌为摩西球囊霉(glomusmosseae,gm)和地表球囊霉(glomusversiforme,gv)；病原菌为禾顶囊壳小麦变种。

载体：烟草脆裂病毒诱导基因沉默的pyl156载体。

将小麦种子置于放有吸水纸的培养皿上，加入适量蒸馏水，4℃春化处理1周，然后将其放入25℃恒温光照培养箱中，光/暗周期：16h/8h，生长至三叶期。

摩西球囊霉和地表球囊霉在宿主植物苜蓿和三叶草中培养生长。

禾顶囊壳小麦变种在马铃薯葡萄糖培养基(pda)中扩繁生长，温度：25±2℃。

实施例1

1.1菌根及低磷处理

将三叶期小麦移植到分别加g.mosseae(gm)和g.versiforme(gv)两种菌根的细沙、蛭石与珍珠岩1：1：1比例混合的培养基质中，菌根接种量为200个孢子/15g。在光周期为16h/8h，温度为18℃/15℃的光照培养箱中生长，所有接种和对照植株每周浇两次1/2的hoagland营养液(5μmkh2po4低磷处理、500μmkh2po4高磷处理)，6周后取小麦根部，清水洗净，收获根部样本，液氮速冻后-80℃保存备用。

将菌根及低磷处理、高磷处理的样品采用trizolreagent(invitrogen)分别提取总rna。

以1μg总的rna做模板，利用cdna合成试剂盒合成第一链cdna，并将提取的rna反转录为cdna。

以上述不同处理材料的cdna为模板，进行实时定量pcr反应。用相对定量2^-δδct法对表达量进行相对定量分析，以小麦的actin(genebank登录号kc775780)基因作为参照基因。

tapht-myc为已知的丛枝菌根特异的小麦磷转运蛋白，在不接种菌根时，几乎不表达，接种菌根后表达量显著升高。与tapht-myc类似，在低磷没有菌根共生的条件下(-p-m)，tapt13和tapht-myc基因表达受到抑制，在不同磷浓度下接种g.mosseae和g.versiforme两种不同菌根后表达量显著升高，如图1所示，特别是在低磷条件下(-p+gm和-p+gv)表达显著高于tapht-myc对照基因，与对照相比，tapt13基因表达量升高了约120-160倍，因此，将tapt13确定为丛枝菌根特异的小麦磷转运蛋白基因。

1.2禾顶囊壳小麦变种处理

划取于pda培养基上生长好的禾顶囊壳小麦变种的菌丝块，菌丝块大小为5cm×5cm，与小麦培养土混合，选取生长一致的三叶期小麦移植到培养土中，分别在0、2、3、4、5和6d取小麦根部样本，清水洗净保存，液氮速冻后-80℃保存备用。

取上述样本进行实时qrt-pcr反应分析，同时以病原相关蛋白tapr4a和tapr4b为标志基因。

如图2所示，在接种禾顶囊壳小麦变种菌后，tapr4a和tapr4b基因表达量明显上升，在5d时达到最高峰，表达量增加约900-1000倍，表明禾顶囊壳小麦变种真菌成功侵染了小麦根系；在接种禾顶囊壳小麦变种菌的2d后，tapt13基因表达量有所升高，约是对照的10倍，在侵染后的3-4d表达量又逐渐下降，在真菌侵染5d后表达量达到最高峰，升高了约15倍，之后表达量又降低。

实施例2trv病毒介导的tapt13-vigs植株的功能分析

以tapt13基因全长为模板，根据trv病毒载体pyl156的载体特点，选用ecori和bamhi位点构建至pyl156中，将重组载体pyl156-tapt13和空载pyl156转化到农杆菌gv3101(阴性对照)中，利用刚发芽的小麦种子抽提转化trv载体实现整株小麦的沉默。

禾顶囊壳小麦变种菌的接种方法采用菌块接种法，取在pda培养基上培养7d的新鲜菌块(5×5cm²)接种在tapt13-vigs和对照植株幼苗的根系，在光照培养箱中培养21d后(白天20℃/夜晚12℃，光照周期16h/8h，相对湿度50％)，首先取其茎基部发病部位放入脱色液中固定24h(乙醇：乙酸＝1:1(v/v))，之后用台盼蓝溶液染色6h在bx61显微镜下进行显微分析，再用canoneos600d相机对发病部位进行表型观察和拍照。

在tapt13-vigs和对照植株幼苗根系接种禾顶囊壳小麦变种真菌21d后，取其发病部位进行台盼蓝显微观察发现，tapt13-vigs沉默植株的菌丝明显多于trv:00对照植株，如图3中a、b所示；对发病部位进行表型观察，结果与显微观察结果一致，如图3中c、d所示，tapt13-vigs沉默植株发病部位的茎基部发黑变褐的现象比对照植株更明显。

为进一步分析tapt13-vigs沉默植株中tapt13和抗病标志基因的表达变化，提取tapt13-vigs不同株系的rna，利用荧光定量pcr试验分析tapt13和tapr4a、tapr4b的表达量变化，参照基因选用小麦的taactin基因。定量pcr，每次定量实验中每个模板进行三次同步扩增与检测，且进行三次生物学重复，引物序列如下：

tapt13-f：5’-agccaacacaggcattga-3’，

tapt13-r：5’-gaagaggtcgtaggcatcagt-3’；

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tapr4a-r：5’-ggcagtcgacgaactggta-3’；

tapr4b-f：5’-cttcaccaagatcgacacca-3’，

tapr4b-r：5’-agcaagctagcctttgatcg-3’；

taactin-f：5’-ccaggtatcgctgaccgtat-3’，

taactin-r：5’-gctgagtgaggctaggatgg-3’。

如图4中a、b所示，荧光定量pcr结果表明，tapt13-vigs沉默植株的根和叶中tapt13基因的表达量显著低于对照植株，说明由trv病毒可介导实现小麦全株的沉默，且抗病标志基因tapr4a和tapr4b的表达量在tapt13-vigs沉默植株中的表达量也明显低于对照植株，该结果与表型和显微观察结果一致，感病性增强的植株中抗病标志基因表达量下降。

实施例3在拟南芥中过表达tapt13的功能分析

为进一步分析tapt13的功能，克隆tapt13的全长构建至以35s启动子启动的植物载体ctapi-gw-3ha中，获得过表达重组载体ctapi-gw-3ha-tapt13，分别将重组载体和空载体通过热激法转化农杆菌gv3101，通过蘸花方法将重组载体和空载体转化哥伦比亚生态型(col-0)的拟南芥，经过3代的筛选获得5个单拷贝纯合的转基因株系，在野生型拟南芥和转基因植株根系同时接种禾顶囊壳小麦变种菌(前期试验发现野生型拟南芥是禾顶囊壳小麦变种菌的宿主)。

结果发现，与野生型和空载体转基因植株相比，过表达tapt13的5个转基因株系对禾顶囊壳小麦变种菌抗性均明显增强，与其在小麦中沉默的结果一致，表明tapt13是禾顶囊壳小麦变种菌的正调控因子。

序列表

<110>周口师范学院

<120>基因tapt13在提高植物对禾顶囊壳小麦变种抗性方面的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1566

<212>dna

<213>面包小麦(triticumaestivum)

<400>1

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<213>面包小麦(triticumaestivum)

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