生防复合菌剂及其制备方法与应用与流程

本发明属于植物保护技术领域，涉及微生物及其应用，具体涉及一种由链霉菌kn37、哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌组合的生防复合菌剂，以及其在棉花黄萎病防治中的应用。

背景技术：

新疆优越的自然条件使其在农产品生产方面具有先天的优势。种植业是新疆农业中的主要产业，占农业总产值的76％，是增加农业收入的主要来源。新疆种植作物主要包括粮食类、油料类、棉花类、蔬菜类、瓜果类和其他经济作物。目前，新疆是我国最大的棉花产区，占全国棉花种植面积的83％以上。随着棉花种植面积的增加，棉花黄萎病的发生越来越普遍，已经遍布全国各大产区，对该病害对棉花种植的影响极为严重，很多棉田因黄萎病造成了绝收情况。据统计，新疆棉花每年因病害损失皮棉约36万吨，市价约70亿元。

棉花黄萎病被称为“棉花的癌症”，是棉花生产中的主要顽固性病害，并且有逐年加重的趋势。棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌(verticilliumdahliaekleb.)侵染引起的。棉花发病初期在植株下部叶片上的叶缘和叶脉间出现浅黄色斑块，后逐渐扩展，叶色失绿变浅，主脉及其四周仍保持绿色，病叶出现掌状斑驳，叶肉变厚，叶缘向下卷曲，叶片由下而上逐渐脱落，仅剩顶部少数小叶，蕾铃稀少，棉铃提前开裂，后期病株基部生出细小新枝。纵剖病茎，木质部上产生浅褐色变色条纹。该病害可造成棉花减产40～60％，纤维素品质下降。棉花黄萎病已经成为棉花种植过程中最普遍、损失最严重的病害，严重影响了棉花的品质和产量。

目前，防治棉花黄萎病的主要途径是培育抗病品种、农业轮作、化学防治等措施，但是防治效果均不理想。现有的抗病棉花品种的品质较差，市场前景不是很好。鉴于棉花黄萎病的微菌核在土壤中能存活十几到几十年，短期的轮作无法达到预期目的。在土壤中大量使用化学农药将会造成严重的农产品出口受限、抗药性及环境污染等问题，难以作为持久优选的解决办法。在这种情况下，生物防治就成了优选的选择手段。开发新型高效、广谱、低毒、环保的杀菌剂(微生物药剂)一直是当今农药研究的难点和热点。生物防治对病害防治效果好，对人畜及环境安全，无残留，对天敌及有益生物安全。目前市场上销售的可用于防治棉花黄萎病的生防菌剂主要有芽孢杆菌类和木霉菌类，但防效均不理想。

技术实现要素：

本发明针对当前新疆棉田黄萎病发生较为严重的现状，旨在探索研发一种防治棉花黄萎病的生防复合菌剂。这种生防复合菌剂融合了放线菌、真菌、细菌等菌株，为棉花黄萎病防治提供了一条切实有效的解决途径。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种生防复合菌剂，其包含菌种保藏号为cgmccno.13160的链霉菌kn37(streptomycessp.kn37)、菌种保藏号为cgmccno.5.1250的哈茨木霉菌(trichodermaharzianum)、菌种保藏号为cgmccno.1.821的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。链霉菌kn37是发明人团队在新疆喀纳斯地区采集的土壤中分离得到的一种放线菌，授权专利zl201611143553.8记载链霉菌kn37的发酵液对葡萄灰霉病菌、番茄早疫病菌、棉花枯萎病菌、番茄叶霉病菌具有较好的抑制作用。但专利zl201611143553.8没有通过确切的田间数据证实对棉花黄萎病的防效。为了拓展链霉菌kn37的生防用途，本专利尝试将其与哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌配合使用，探索一种对棉花黄萎病具有较好防效的生防复合菌剂。本专利所使用的哈茨木霉菌菌种、枯草芽孢杆菌菌种均购自于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

作为所述生防复合菌剂的优选实施例，本专利给出了链霉菌kn37与哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌的优选配合使用比例，以质量比计，所述链霉菌kn37、哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌的组合比例为1∶1.3～1.4∶0.5～0.6，活菌总浓度为1×10¹⁰～10¹²cfu/ml。试验数据证实，该比例配置的生防复合菌剂对棉花黄萎病的防效高于70％。

另外，本专利还给出了生防复合菌剂的制备方法，其由链霉菌kn37、哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌的菌粉，按质量比1∶1.3～1.4∶0.5～0.6混合形成。经测定，按此比例制备的生防复合菌剂的活菌总浓度为1×10¹⁰～10¹²cfu/ml。

作为生防复合菌剂制备方法的进一步优选，制备方法包含，

分别将链霉菌kn37、哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌接种培养，获得菌悬液；

所述菌悬液分别接入发酵培养液，培养，过滤，干燥，分别获得所述链霉菌kn37、哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌的菌粉；

将所述链霉菌kn37、哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌的菌粉，按质量比1∶1.3～1.4∶0.5～0.6混合。

作为生防复合菌剂制备方法的优选实施例，获得所述链霉菌kn37菌悬液的培养基选用高氏一号培养基；获得所述哈茨木霉菌菌悬液的培养基选用pda培养基；获得所述枯草芽孢杆菌菌悬液的培养基选用lb培养基；培养条件为：温度32℃，转速180rpm，震荡培养36h。所用高氏一号培养基、pda培养基、lb培养基，本领域普通技术人员均可依据现有技术配制。

作为生防复合菌剂制备方法的优选实施例，所述链霉菌kn37、哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌菌悬液以质量比1:100的比例分别接入发酵培养液。

作为生防复合菌剂制备方法的优选实施例，所述发酵培养液的配方为：小米10g/l、黄豆粉10g/l、葡萄糖10g/l、蛋白胨3g/l、nacl2g/l、caco31g/l，ph值7.2～7.4；所述发酵培养条件为：温度32℃，转速280rpm，ph值7.0～7.5，溶氧量20％，通气量5～7m³/h，罐压0.05～0.1kpa。

还有，本给出了所述生防复合菌剂在棉花黄萎病防治中的应用。试验数据得出，在棉花生长过程中以滴灌方式施用所述生防复合菌剂，对棉花黄萎病的防治效果达76.79％。

还有，本给出了所述生防复合菌剂在增加棉花产量中的应用。试验数据得出，所述生防复合菌剂对棉花具有较好的促生长的作用，对棉花株高和鲜重的增加率均超过35％。

与现有技术相比，本发明至少具有下述的有益效果或优点：

(1)本发明提供一种包含链霉菌kn37与哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌的生防复合菌剂，以质量比计，链霉菌kn37、哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌的组合比例为1∶1.3～1.4∶0.5～0.6。按此比例制备的生防复合菌剂，具有对棉花黄萎病具有较好的防治效果，试验数据得出，在棉花生长过程中以滴灌方式施用所述生防复合菌剂，对棉花黄萎病的防治效果达76.79％。

(2)所述生防复合菌剂的活性成分为链霉菌kn37与哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌，对环境安全，避免了化学农药带来的负面影响。

(3)所述生防复合菌剂还具有促生长和增产的效果，浓度为0.6g/l的生防复合菌剂对棉花株高和鲜重的促进作用最强，达到35.47％和35.02％，可减少农民的开支，提高农民的收入。

附图说明

图1是生防复合菌剂最佳配比筛选实施例中，哈茨木霉菌和枯草芽孢杆菌添加量的曲面图。

图2是生防复合菌剂最佳配比筛选实施例中，哈茨木霉菌和枯草芽孢杆菌添加量的等高线。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细阐述。

实施例1：生防复合菌剂的制备

本实施例给出一种生防复合菌剂的优选制备方法。这种生防复合菌剂的微生物活性组分包括链霉菌kn37与哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌。将链霉菌kn37接种至高氏一号培养基，将哈茨木霉菌接种至pda培养基，将枯草芽孢杆菌接种至lb培养基，三种菌的培养条件为温度32℃，转速180rpm，震荡培养36h，分别获得链霉菌kn37菌悬液、哈茨木霉菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液。将这三种菌悬液以质量比1:100的比例分别接入装有发酵培养液的50l发酵罐中。所述发酵培养液的配方为：小米10g/l、黄豆粉10g/l、葡萄糖10g/l、蛋白胨3g/l、nacl2g/l、caco31g/l，ph值7.2～7.4；所述发酵培养条件为：温度32℃，转速280rpm，ph值7.0～7.5，溶氧量20％，通气量5～7m³/h，罐压0.05～0.1kpa。培养4～5d后过滤、喷雾干燥得到三种菌粉，每克菌粉中含9×10¹³～10¹⁷个菌体。将所述链霉菌kn37、哈茨木霉菌、枯草芽孢杆菌的菌粉，按质量比1∶1.3～1.4∶0.5～0.6混合，制备成所述生防复合菌剂。

实施例2：生防复合菌剂最佳配比筛选

将链霉菌kn37作为定量，哈茨木霉菌和枯草芽孢杆菌作为变量，按照表1所示用designexpert8.0软件进行ccd(centralcompositedesign)响应面试验设计并进行试验。取100mg链霉菌kn37菌粉，按照表2试验设计分别添加相应的哈茨木霉菌菌粉和枯草芽孢杆菌菌粉，混匀后溶于1l水中，分别进行棉花黄萎病盆栽药效试验。

表1，ccd试验设计中所选变量和参数水平

表2，ccd试验设计方案及结果

采用响应面分析法对结果进行统计分析，得到多项拟合回归模型为：y＝64.9760+12.7395x1－4.9812x2－0.7550x1x2－8.1749x1²－5.5524x2²，对该模型进行方差分析后可以看出回归方程模型能较好地描述各因子与响应值之间的关系(p<0.0001)，模型失拟项不显著(p＝0.0648)，说明该回归方程的失拟平方和主要由试验误差等偶然因素引起。模型的相关系数r²＝0.9786，表明该模型能较好地描述试验结果。综合分析说明可以用此模型来分析和预测哈茨木霉菌与枯草芽孢杆菌的添加量对防效的影响。

从回归方程模型方差分析(表3)可知，哈茨木霉菌(p<0.0001)为主要效应。从图1和图2可以看出，哈茨木霉菌和枯草芽孢杆菌对防效的影响均为先升高后降低，因此存在最高值。通过designexpert8.0软件求得哈茨木霉菌和枯草芽孢杆菌的最佳比例为：哈茨木霉菌添加量为136mg(x1＝0.72)，枯草芽孢杆菌添加量为56mg(x2＝-0.88)，理论防效为70.50％。根据以上分析结果，将链霉菌kn37菌粉100mg、哈茨木霉菌菌粉136mg、枯草芽孢杆菌56mg均匀混合后溶于1l无菌水中，进行棉花黄萎病盆栽药效试验，结果显示该配方对棉花黄萎病的防效达71.43％，与理论防效差异不大。因此，最终得到复合菌剂的最佳配比为：链霉菌kn37∶哈茨木霉菌∶枯草芽孢杆菌＝1∶1.3～1.4∶0.5～0.6，此时活菌总浓度为1×10¹⁰～10¹²cfu/ml。

表3，回归模型方差分析

实施例3：棉花黄萎病盆栽试验

取长势一致的5叶期棉苗作为试验作物，将实施例制备的生防复合菌剂稀释为一定浓度(0.2、0.4、0.6g/l)后，取50ml灌根，5d后灌根10ml棉花黄萎病菌孢子悬浮液(10⁷cfu/ml)，继续培养，每5d灌根50ml生防复合菌剂，待空白对照充分发病时调查病情指数、株高、植株鲜重，计算防效。

10亿活芽胞/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(保定市科绿丰生化科技有限公司)和3亿cfu/g哈茨木霉菌可湿性粉剂(美国拜沃股份有限公司)作为对照药剂。棉花黄萎病盆栽试验处理及结果见表4。

盆栽试验结果(表4)表明，浓度为0.2、0.4、0.6g/l的生防复合菌剂对棉花黄萎病的防治效分别为58.87％、72.54％、88.36％，均优于对照药剂哈茨木霉菌剂和枯草芽孢杆菌剂的防效。生防复合菌剂、哈茨木霉菌剂和枯草芽孢杆菌剂对棉苗的生长均具有一定的促进作用，其中浓度为0.6g/l的生防复合菌剂对棉花株高和鲜重的促进作用最强，达到35.47％和35.02％。

表4，生防复合菌剂对棉花黄萎病的盆栽防治效果

实施例4：棉花黄萎病田间药效试验

在新疆建设兵团第八师143团选择土壤形状一致、肥力均匀、棉花黄萎病发病较重的滴灌棉田，滴水时将所用菌剂混入其中滴入土壤。试验划分4组分别做如下处理：

处理一：六月初第二次滴水开始，将3kg/亩的生防复合菌剂混入水中，每次滴水量为20m³/亩，每隔10d滴一次，共滴5次。

处理二：六月初第二次滴水开始，将3kg/亩的哈茨木霉菌wp混入水中，每次滴水量为20m³/亩，每隔10d滴一次，共滴5次。

处理三：六月初第二次滴水开始，将3kg/亩的枯草芽孢杆菌wp混入水中，每次滴水量为20m³/亩，每隔10d滴一次，共滴5次。

处理四：清水对照。

各试验小区采用五点取样法，每点取样40株，调查黄萎病病级，记录并统计病情指数、发病率和防效，分级标准和计算方法如下：

棉花黄萎病分级标准：

0级：棉株健康，无病叶，生长正常；

1级：棉株25％以下叶片发病，变黄萎蔫；

2级：棉株25～50％叶片发病，变黄萎蔫；

3级：棉株50～75％叶片发病，变黄萎蔫；

4级：棉株75％以上叶片发病，或棉株枯死。

病情指数＝[σ(病级叶片数×病级)/总叶片数×最高病级]×100

防效(％)＝(对照组病情指数－处理组病情指数)/对照组病情指数×100

棉田收获后，记录棉田产量，并计算增产率，计算方法如下：

增产率(％)＝(处理组籽棉产量－对照组籽棉产量)/对照组籽棉产量

各处理对棉花黄萎病的田间防治效果见表5。各处理对棉花的增产效果见表6。

表5，各处理对棉花黄萎病的田间防治效果

表6，各处理对棉花的田间增产效果

表5防效结果显示，生防复合菌剂、哈茨木霉菌wp和枯草芽孢杆菌wp均可降低棉花黄萎病的发病率，使用生防复合菌剂后棉花黄萎病的发病率降低至13.28％，显著低于哈茨木霉菌wp和枯草芽孢杆菌wp处理组，生防复合菌剂对棉花黄萎病的防治效果可达76.79％，显著高于哈茨木霉菌wp和枯草芽孢杆菌wp处理组。表6田间增产效果显示，使用生防复合菌剂后，棉花的产量达到423.84kg/亩，增产率达到33.15％，明显高于哈茨木霉菌wp和枯草芽孢杆菌wp处理组。

上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。