样本裂解和PCR反应组合物的制作方法

样本裂解和pcr反应组合物
技术领域
[0001]
本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及样本裂解和pcr反应组合物，更具体地，本发明涉及组合物以及冻干粉。


背景技术：

[0002]
现有的荧光定量pcr反应一般主要分4个步骤：首先进行样本的裂解和核酸的提取，之后进行荧光定量pcr反应试剂的配制，随后将样本加入pcr反应体系中，最后再进行上机检测。


技术实现要素：

[0003]
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
[0004]
发明人发现，一方面，在样本提取期间使用的试剂苯酚、氯仿、盐酸胍、乙醇、异硫氰酸胍等不仅对人体有害，严重的甚至致癌；而且有些试剂是易燃品，对实验室环境和安全风险控制的要求较高；另外，这些试剂也容易造成大气和水源的污染。另一方面，荧光定量pcr试剂的配制和分装要求在标准的试剂准备间进行，以防造成样本污染，且配置和分装的操作复杂，需要特定培训后的人员才可以进行。基于上述问题，发明人研究开发了一种组合物，该组合物中的第一组分可以有效用于样本的裂解和核酸的提取，第二组分可以有效用于pcr扩增反应，该第一组分与现有试剂相比，毒性和污染性显著降低，安全性、稳定性显著提高，对运输和储存有利，且对样本的要求降低；该第二组分与现有技术相比，稳定性显著提高，对运输和储存有利，且降低了对实验环境的要求；第一组分与第二组分的联合使用，可以使样本的裂解、核酸的提取以及荧光定量pcr试剂的配制无需专业人士即可完成，降低了对操作人员的技术要求，同时pcr扩增效果优异。
[0005]
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于pcr反应的组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括：第一组分，所述第一组分包括金属离子螯合剂，十二烷基硫酸钠(sds)，皂苷(saponin)，蛋白酶k(proteinase k)，聚乙二醇3350(peg 3350)，tris-hcl，水；和/或第二组分，所述第二组分包括甘露醇，蔗糖，氯化盐，牛血清白蛋白(bsa)，dntp，聚氧乙烯十二烷醚(brij 35)，hepes，dna聚合酶，反转录酶和rna酶抑制剂，水。在一些实施例中，所述金属离子螯合剂为edta和egta。在一些实施例中，所述氯化盐为氯化钾和氯化镁。根据本发明实施例的组合物中的第一组分配合其他仪器的加热功能可以有效用于样本的裂解和核酸的提取，第二组分可以有效用于pcr扩增反应，发明人发现，所述第一组分与现有试剂相比，毒性和污染性显著降低，安全性显著提高，且利用第一组分裂解样本后得到的混合液不需要再单独进行纯化，即可直接用于后续的pcr反应，对样本的要求降低；所述第二组分与现有技术相比，稳定有效，对运输和储存有利，且降低了对运输和储存温度的要求；第一组分与第二组分的联合使用，可以使样本的裂解、核酸的提取以及荧光定量pcr试剂的配制无需专业人士即可完成，降低了对操作人员的技术要求，同时pcr扩增效果优异。
[0006]
根据本发明的实施例，上述组合物还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0007]
根据本发明的实施例，基于所述第一组分的总体积，所述edta的浓度为0.1～10mmol/l，如为0.5、0.7、1.0、2.0、3.0或4.0mmol/l，所述egta的浓度为0.1～15mmol/l，如为0.5、0.7、3、5、7、10或13mmol/l，所述蛋白酶k的浓度为5～150u/ml，如为7、10、15、30、45、60、75、90或120u/ml，所述十二烷基硫酸钠的浓度为0.1～3.0％，如为0.3、0.5、1.0、1.5、2.0或2.5％，所述皂苷的浓度为0.1～3.0％，如为0.3、0.5、1.0、1.5、2.0或2.5％，所述聚乙二醇3350的浓度为0.1～5.0％，如为0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或4.5％。需要说明的是，所述十二烷基硫酸钠、皂苷以及聚乙二醇3350的浓度为质量体积浓度，指的是每100ml溶液中所述十二烷基硫酸钠、皂苷或聚乙二醇3350的质量，单位为g。例如，所述十二烷基硫酸钠的浓度为0.1～3.0％，指的是每100ml的第一组分中十二烷基硫酸钠的质量为0.1～3.0g。发明人发现，所述第一组分中各成分的浓度在该范围内时，第一组分可以进一步有效用于样本的裂解和核酸的提取，同时毒性和污染性更低，安全性更高，对样本的要求更低，进而，后续的pcr扩增效果更优。
[0008]
根据本发明的实施例，基于所述第一组分的总体积，所述edta的浓度为0.5～5mmol/l，所述egta的浓度为0.5～10mmol/l，所述蛋白酶k的浓度为10～100u/ml，所述十二烷基硫酸钠的浓度为0.5～2.5％，所述皂苷的浓度为0.5～2.5％，所述聚乙二醇3350的浓度为0.5～4.5％。发明人发现，所述第一组分中各成分的浓度在该范围内时，第一组分可以进一步有效用于样本的裂解和核酸的提取，同时毒性和污染性更低，安全性更高，对样本的要求更低，进而，后续的pcr扩增效果更优。
[0009]
根据本发明的实施例，所述tris-hcl是以溶于水的形式提供的。需要说明的是，tris-hcl是本领域常用的一类缓冲物质，可以自己配置，也可以直接购买。
[0010]
根据本发明的实施例，所述tris-hcl溶于水形成的溶液的ph为7.5～8.2，如7.6、7.7、7.8、7.9、8.0或8.1。需要说明的是，所述ph并不是指第一组分的ph，而是tris-hcl溶于水形成的溶液的ph。根据本发明的实施例，所述tris-hcl溶于水形成的溶液的ph为7.5～8.2时，tris-hcl对第一组分的缓冲效果更好，更有利于样本的裂解和核酸的提取，稳定性更好，进而，后续的pcr扩增效果更优。在一些实施方案中，所述tris-hcl溶于水形成的溶液的ph为7.6。
[0011]
根据本发明的实施例，基于所述第一组分的总体积，所述tris-hcl的浓度为1～25mmol/l，如为2、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24mmol/l。根据本发明的实施例，所述tris-hcl的浓度为1～25mmol/l时，tris-hcl对第一组分的缓冲效果更好，更有利于样本的裂解和核酸的提取，稳定性更好，进而，后续的pcr扩增效果更优。在一些实施方案中，所述tris-hcl的浓度为5～20mmol/l。
[0012]
根据本发明的实施例，基于所述第二组分的总体积，所述氯化钾的浓度为10～150mmol/l，如为15、20、30、40、60、80、100或120mmol/l，所述氯化镁的浓度为0.5～10.0mmol/l，如为0.7、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0或10.0mmol/l，所述dntp的浓度为150～250μmol/l，如为180、200或230μmol/l，所述dna聚合酶的浓度为10～250u/ml，如为13、15、18、20、30、50、80、100、120、150、180、200或230u/ml，所述反转录酶的浓度为5～100u/ml，如为7、10、20、30、40、50、70或90u/ml，所述rna酶抑制剂的浓度为100～1000u/ml，如为150、200、300、500、700或900u/ml，所述甘露醇的浓度为0.1～10％，如为0.2、0.4、0.5、1.0、3.0、
5.0、7.0或9.0％，所述蔗糖的浓度为0.1～10％，如为0.2、0.4、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0或9.0％，所述牛血清白蛋白的浓度为0.1～5mg/ml，如为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0或4.0mg/ml，所述聚氧乙烯十二烷醚的浓度为0.01～0.10％，如为0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08或0.09％。需要说明的是，所述蔗糖以及聚氧乙烯十二烷醚的浓度为质量体积浓度，指的是每100ml溶液中所述蔗糖或聚氧乙烯十二烷醚的质量，单位为g。例如，所述蔗糖的浓度为0.1～10％，指的是每100ml的第二组分中蔗糖的质量为0.1～10g。所述甘露醇的浓度0.1～10％，指每100ml的第二组分中甘露醇的体积为0.1～10ml。发明人发现，所述第二组分中各成分的浓度在该范围内时，所述第二组分可以进一步有效用于pcr扩增反应，pcr扩增效果更好，同时稳定性更高。
[0013]
根据本发明的实施例，基于所述第二组分的总体积，所述氯化钾的浓度为20～100mmol/l，所述氯化镁的浓度为1.0～5.0mmol/l，所述dntp的浓度为200μmol/l，所述dna聚合酶的浓度为20～200u/ml，所述反转录酶的浓度为10～50u/ml，所述rna酶抑制剂的浓度为200～1000u/ml，所述甘露醇的浓度为0.5～8％，所述蔗糖的浓度为0.5～8％，所述牛血清白蛋白的浓度为0.1～1mg/ml，所述聚氧乙烯十二烷醚的浓度为0.05％。发明人发现，所述第二组分中各成分的浓度在该范围内时，所述第二组分可以进一步有效用于pcr扩增反应，pcr扩增效果更好，同时稳定性更高。
[0014]
根据本发明的实施例，所述hepes是以溶于水的形式提供的。需要说明的是，hepes是本领域常用的一类缓冲物质，可以自己配置，也可以直接购买。
[0015]
根据本发明的实施例，所述hepes溶于水形成的溶液的ph为8.0～8.5，如为8.1、8.2、8.25、8.3或8.4。需要说明的是，所述ph并不是指第二组分的ph，而是hepes溶于水形成的溶液的ph。根据本发明的实施例，所述hepes溶于水形成的溶液的ph为8.0～8.5时，hepes对第二组分的缓冲效果更好，更有利于pcr扩增反应，pcr扩增效果更好，同时稳定性更高。在一些实施方案中，所述hepes溶于水形成的溶液的ph为8.25。
[0016]
根据本发明的实施例，基于所述第二组分的总体积，所述hepes的浓度为5～55mmol/l，如为10、15、20、25、30、35、40、45或50mmol/l。根据本发明的实施例，所述hepes的浓度为5～55mmol/l时，hepes更有利于pcr扩增反应，pcr扩增效果更好，同时稳定性更高。在一些实施方案中，所述hepes的浓度为10～50mmol/l。
[0017]
根据本发明的实施例，所述皂苷包括选自茶皂素、人参皂苷、重楼皂苷、大豆皂苷的至少之一。
[0018]
根据本发明的实施例，所述dna聚合酶包括选自taq酶、tth dna聚合酶的至少之一。
[0019]
根据本发明的实施例，所述反转录酶包括选自m-mlv反转录酶、amv反转录酶的至少之一。
[0020]
根据本发明的实施例，所述rna酶抑制剂包括选自焦磷酸二乙酯、异硫氰酸胍、氧钒核糖核苷复合物、rnasin、尿素、硅藻土的至少之一。
[0021]
在本发明第二方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括：第一组分，基于所述第一组分的总体积，所述第一组分包括浓度为0.5～5mmol/l的edta，浓度为0.5～10mmol/l的egta，浓度为10～100u/ml的蛋白酶k，浓度为0.5～2.5％的十二烷基硫酸钠，浓度为0.5～2.5％的皂苷，浓度为0.5～4.5％的聚乙二醇3350，浓度为5
～20mmol/l的tris-hcl，以及水；和/或第二组分，基于所述第二组分的总体积，所述第二组分包括浓度为20～100mmol/l的氯化钾，浓度为1.0～5.0mmol/l的氯化镁，浓度为200μmol/l的dntp，浓度为20～200u/ml的dna聚合酶，浓度为10～50u/ml的反转录酶，浓度为200～1000u/ml的rna酶抑制剂，浓度为0.5～8％的甘露醇，浓度为0.5～8％的蔗糖，浓度为0.1～1mg/ml的牛血清白蛋白，浓度为0.05％的聚氧乙烯十二烷醚，浓度为10～50mmol/l的hepes，以及水。发明人发现，第一组分与第二组分的联合使用，可以使样本的裂解、核酸的提取以及荧光定量pcr试剂的配制无需专业人士即可完成，降低了对操作人员的技术要求，同时pcr扩增效果优异。
[0022]
在本发明的第三方面，本发明提出了一种冻干粉。根据本发明的实施例，所述冻干粉是由上述任一项所述的组合物制备的。发明人发现，所述第一组分和/或所述第二组分以冻干粉的形式存在时，稳定性大大提升，可以在常温条件下进行储存和运输，大大降低了对储存和运输的环境要求，且将冻干粉与合适的缓冲液混合后便可以复溶，同时保持了原有的功能。
[0023]
在本发明的第四方面，本发明提出了一种pcr反应系统。根据本发明的实施例，参考图8，该系统包括：样本容纳单元100，所述样本容纳单元100内设置有裂解原料冻干粉，并且所述样本容纳单元100设置有第一液体出/入口110；稀释液容纳单元200，所述稀释液容纳单元200内设置有稀释液，并且所述稀释液容纳单元200设置有稀释液出口210；pcr反应单元300，所述pcr反应单元300内设置有反转录酶和pcr原料冻干粉，并且所述pcr反应单元300设置有裂解后的样本混合液入口310和pcr反应液出口320，所述pcr反应液出口320与所述稀释液出口210通过第四管路940相连；以及活塞单元400，所述活塞单元400包括注射室410和活塞420，所述注射室410设置有第二液体出/入口411，所述第二液体出/入口411与所述第一液体出/入口110通过第一管路910相连，所述第二液体出/入口411与所述稀释液出口210通过第二管路920相连，所述第二液体出/入口411与所述裂解后的样本混合液入口310通过第三管路930相连；其中：所述裂解原料冻干粉包括金属离子螯合剂，十二烷基硫酸钠，皂苷，蛋白酶k，聚乙二醇3350，tris-hcl，水；所述反转录酶和pcr原料冻干粉包括甘露醇，蔗糖，氯化盐，牛血清白蛋白，dntp，聚氧乙烯十二烷醚，hepes，dna聚合酶，反转录酶和rna酶抑制剂，水。在一些实施例中，所述金属离子螯合剂为edta和egta。在一些实施例中，所述氯化盐为氯化钾和氯化镁。需要说明的是，前述两方面关于组合物的描述同样适用于pcr反应系统。
[0024]
根据本发明实施例的pcr反应系统通过微流控管路将样本容纳单元100、稀释液容纳单元200、pcr反应单元300以及活塞单元400相互连接在一起；同时，各单元又分别为独立设置的单元，以便使各单元在使用前存放不同的反应物，有利于反应物在不使用的情况进行长久保存。例如，样本容纳单元100的独立设置有利于样本的单独添加，使样本的添加操作简单化，同时也有利于样本的长久保存。参考图8，首先，将活塞420向外拉动到一定位置，从而使稀释液容纳单元200中的稀释液流向注射室410；之后往复移动活塞420，使注射室410中的部分稀释液进入样本容纳单元100，同时与样本容纳单元100中的裂解冻干粉以及样本(即裂解原料冻干粉)混合均匀；之后对样本容纳单元100进行加热升温到设定温度，使样本容纳单元100中的样本在设定的温度下进行充分裂解；裂解完成后，再次将活塞420向外拉动到一定位置，从而使样本容纳单元100中已裂解的样本混合液流向注射室410；之后
往复移动活塞420，使注射室410中已裂解的样本混合液返回稀释液容纳单元200，同时与稀释液容纳单元200中剩余的稀释液混合均匀，从而将已裂解的样本混合液进行稀释，将其中的杂质浓度降低；之后，再次将活塞420向外拉动到一定位置，从而使稀释液容纳单元200中稀释后的样本混合液流向注射室410；随后往复移动活塞420，使注射室410中稀释后的样本混合液进入pcr反应单元300，同时与pcr反应单元300中的反转录酶以及pcr原料的冻干粉混合均匀；最后对pcr反应单元300进行pcr温度加热控制，以便最终完成pcr扩增反应。根据本发明实施例的pcr反应系统中，所述pcr反应液出口与所述稀释液出口通过第四管路相连，形成了pcr反应液出口与稀释液出口的压力系统连通，从而使得pcr反应单元内过多的反应液可以顺利通过反应液出口流出到第四管路。进一步地，根据本发明实施例的pcr反应系统中，可以在微流控管路的合适位置灵活设计阀门或者其他开关，以便控制活塞单元400与样本容纳单元100、稀释液容纳单元200或pcr反应单元300的连通状态。另外，活塞的移动以及各阀门或其他开关的控制也可以灵活设计其他机械装置来实现自动化。由此，根据本发明实施例的pcr反应系统将活塞单元分别与样本容纳单元、稀释液容纳单元以及pcr反应单元连接起来，实现了从样本核酸提取到与试剂混合，最后再到pcr反应的全自动过程，解决了传统pcr实验过程需要在专业实验环境下由专业人士进行操作的难题，无需专业人士即可完成，且减少了人为操作带来的误差，极大地提高了pcr反应的工作效率，大大节约了人力资源成本。
附图说明
[0025]
图1是根据本发明实施例1的测试结果示意图；
[0026]
图2是根据本发明实施例2的测试结果示意图；
[0027]
图3是根据本发明对比例1的测试结果示意图；
[0028]
图4是根据本发明对比例2的测试结果示意图；
[0029]
图5是根据本发明对比例3的测试结果示意图；
[0030]
图6是根据本发明对比例4的测试结果示意图；
[0031]
图7是根据本发明对比例5的测试结果示意图；
[0032]
图8是根据本发明实施例的pcr系统结构示意图。
[0033]
附图标记：
[0034]
100：样本容纳单元
[0035]
110：第一液体出/入口
[0036]
200：稀释液容纳单元
[0037]
210：稀释液出口
[0038]
300：pcr反应单元
[0039]
310：裂解后的样本混合液入口
[0040]
320：pcr反应液出口
[0041]
400：活塞单元
[0042]
410：注射室
[0043]
411：第二液体出/入口
[0044]
420：活塞
[0045]
910：第一管路
[0046]
920：第二管路
[0047]
930：第三管路
[0048]
940：第四管路
具体实施方式
[0049]
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0050]
需要说明的是，如无特别说明，本发明中各成分以及各浓度的含义按照本领域的常规解释进行理解即可，如edta和egta。另外，amplification plot表示扩增曲线；cycle表示循环数。
[0051]
还需要说明的是，除本发明的样本裂解以及核酸提取组合物或其冻干粉为发明人的研发成果外，如无特别说明，下述步骤中使用到的其他相关试剂均可以购买或者查阅现有技术获得。本领域技术人员可依据实际需要购买相关试剂，或查阅现有技术获得相关试剂。
[0052]
一、样本裂解以及核酸提取冻干粉的制备
[0053]
1、称量或吸取一定量的目标成分，以便配置预定体积的混合溶液，该混合溶液中：edta为0.5mm-5mm，egta为0.5mm-10mm，十二烷基硫酸钠为0.5％-2.5％，皂苷为0.5％-2.5％，蛋白酶k为10-100u/ml，聚乙二醇3350为0.5-4.5％，tris-hcl为5mm-20mm，用水配置到预定体积，吸取的tris-hcl溶液的ph为7.5～8.2。
[0054]
2、吸取50μl上述混合溶液，按照常规冻干方法(如干冰上冻干，放入冻干机，-30℃干燥升华)冻干，制备获得一定量的样本裂解以及核酸提取冻干粉。
[0055]
二、荧光定量pcr试剂冻干粉的制备
[0056]
1、称量或吸取一定量的目标成分，以便配置预定体积的混合溶液，该混合溶液中：甘露醇为0.5％-8％，蔗糖为0.5％-8％，氯化钾为20-100mm，氯化镁为1.0mm-5mm，牛血清白蛋白为0.1-1mg/ml，dntp为200μm，brij 35为0.05％，hepes为10-50mm，dna聚合酶为20-200u/ml，m-mlv反转录酶为10-50u/ml，rna酶抑制剂为200-1000u/ml，用水配置到预定体积，吸取的hepes溶液的ph为8.0～8.5。
[0057]
2、将上述混合溶液过滤，并按照常规冻干方法冻干，制备获得一定量的荧光定量pcr试剂冻干粉。
[0058]
三、性质测试
[0059]
1)毒性
[0060]
样本裂解以及核酸提取冻干粉的配置成分不包含苯酚、氯仿、盐酸胍或异硫氰酸胍等有毒物质，毒性低。
[0061]
2)稳定性
[0062]
荧光定量pcr试剂冻干粉室温保存即可，稳定性好。
[0063]
3)样本裂解和核酸提取以及荧光定量pcr的验证测试
[0064]
样本裂解：
[0065]
将flu a甲型流感病毒以一定比例，加入裂解液中。并于95℃温浴一定时间，进行
样本裂解。
[0066]
荧光定量pcr验证测试：
[0067]
将上述裂解样本以一定比例加入复溶后的荧光定量pcr反应体系中，并加入对应的flu a引物与探针。上机进行荧光定量pcr反应。反应程序为：50℃，5min；95℃2min；95℃15s，60℃1min，40cycles。其中，引物和探针的序列如下所示：
[0068]
flua-forward：cagagacttgaagatgtttttgc(seq id no：1)
[0069]
flua-reverse：ctacgctgcagtcctcgctc(seq id no：2)
[0070]
flua-prob：cy3-caagaccaatcctgtcacctctga-bhq2(seq id no：3)
[0071]
下面通过具体实施例进一步详细描述本发明。
[0072]
实施例1
[0073]
1、样本裂解以及核酸提取冻干粉的制备
[0074]
称量或吸取一定量的目标成分，以便配置预定体积的混合溶液，该混合溶液中：edta为2mm，egta为2mm，十二烷基硫酸钠为1％，皂苷为1.0％，蛋白酶k为20u/ml，聚乙二醇3350为1％，tris-hcl为10mm，用水配置到预定体积，吸取的tris-hcl溶液的ph为7.6。
[0075]
吸取50μl上述混合溶液，加入八连管中，离心到管底，放入-80℃冰冻过夜。取出放入冻干机进行过夜冻干，冻干后盖盖，放在室温保存。确保冻干机温度低于-45℃，真空压力<450torr，试管中样本在干冰上放置至少30分钟。
[0076]
2、荧光定量pcr试剂冻干粉的制备
[0077]
称量或吸取一定量的目标成分，以便配置预定体积的混合溶液，该混合溶液中：甘露醇为4％，蔗糖为1.5％，氯化钾为80mm，氯化镁为3.5mm，牛血清白蛋白为0.5mg/ml，dntp为200μm，brij 35为0.05％，hepes为20mm，dna聚合酶为40u/ml，m-mlv反转录酶为20u/ml，rna酶抑制剂为500u/ml，用水配置到预定体积，吸取的hepes溶液的ph为8.25。
[0078]
吸取18μl上述混合溶液，加入八连管中，离心到管底，放入-80℃冰冻过夜。取出放入冻干机进行过夜冻干，冻干后盖盖，放在室温保存。确保冻干机温度低于-45℃，真空压力<450torr，试管中样本在干冰上放置至少30分钟。
[0079]
3、样本裂解和核酸提取以及荧光定量pcr的验证测试
[0080]
按照上述方法进行样本裂解和核酸提取以及荧光定量pcr的试剂配制和冻干。室温存储3个月后，加水复溶后加入flu a病毒进行样本裂解，进而将裂解后样本加入上述比例的复溶后加入flu a引物和探针的荧光定量pcr反应体系中，上机行荧光定量pcr验证测试，测试结果如图1所示。
[0081]
结论：由图1可以看出，冻干粉试剂，室温保存3个月后，复溶，仍能正常扩增。说明第一组分、第二组分试剂配方在冻干后重新复溶仍保持样本裂解和pcr检测活性。
[0082]
实施例2
[0083]
1、样本裂解以及核酸提取冻干粉的制备
[0084]
称量或吸取一定量的目标成分，以便配置预定体积的混合溶液，该混合溶液中：edta为4mm，egta为4mm，十二烷基硫酸钠为2％，皂苷为2％，蛋白酶k为80u/ml，聚乙二醇3350为4％，tris-hcl为18mm，用水配置到预定体积，吸取的tris-hcl溶液的ph为7.6。
[0085]
吸取50μl上述混合溶液，加入八连管中，离心到管底，放入-80℃冰冻过夜。取出放入冻干机进行过夜冻干，冻干后盖盖，放在室温保存。确保冻干机温度低于-45℃，真空压力
<450torr，试管中样本在干冰上放置至少30分钟。
[0086]
2、荧光定量pcr试剂冻干粉的制备
[0087]
称量或吸取一定量的目标成分，以便配置预定体积的混合溶液，该混合溶液中：甘露醇为6％，蔗糖为3％，氯化钾为40mm，氯化镁为5mm，牛血清白蛋白为1mg/ml，dntp为200μm，brij 35为0.05％，hepes为40mm，dna聚合酶为100u/ml，m-mlv反转录酶为40u/ml，rna酶抑制剂为800u/ml，用水配置到预定体积，吸取的hepes溶液的ph为8.25。
[0088]
吸取18μl上述混合溶液，加入八连管中，离心到管底，放入-80℃冰冻过夜。取出放入冻干机进行过夜冻干，冻干后盖盖，放在室温保存。确保冻干机温度低于-45℃，真空压力<450torr，试管中样本在干冰上放置至少30分钟。
[0089]
3、样本裂解和核酸提取以及荧光定量pcr的验证测试
[0090]
按照上述方法进行样本裂解和核酸提取以及荧光定量pcr的试剂配制和冻干。室温存储3个月后，加水复溶后加入flu a病毒进行样本裂解，进而将裂解后样本加入上述比例的复溶后加入flu a引物和探针的荧光定量pcr反应体系中，上机行荧光定量pcr验证测试，测试结果如图2所示。
[0091]
结论：由图2可以看出，冻干粉试剂，室温保存3个月后，复溶，仍能正常扩增。说明第一组分、第二组分试剂配方在冻干后重新复溶仍保持样本裂解和pcr检测活性。
[0092]
对比例1
[0093]
原料配比与实施例1仅区别于：第一组分中蛋白酶k为2u/ml，其他组分配比不变。测试方法与实施例1相同。
[0094]
扩增结果如图3所示。
[0095]
结论：由图3可以看出，当蛋白酶k的浓度过低时，会影响第一组分裂解样本的效果，进而影响pcr扩增结果。说明蛋白酶k在第一组分中的配比浓度很重要。
[0096]
对比例2
[0097]
原料配比与实施例1仅区别于：第一组分中edta、egta浓度均为0mm，其他组分配比不变。测试方法与实施例1相同。
[0098]
扩增结果如图4所示。
[0099]
结论：由图4可以看出，当去掉edta、egta成分，会影响第一组分裂解样本的效果，进而影响pcr扩增结果。说明edta、egta在第一组分中的作用很重要。
[0100]
对比例3
[0101]
原料配比与实施例1仅区别于：第一组分中皂苷的浓度为10％，其他组分配比不变。测试方法与实施例1相同。
[0102]
扩增结果如图5所示。
[0103]
结论：由图5可以看出，当皂苷的浓度过高后，会影响第一组分裂解样本的效果，进而影响pcr扩增结果。说明皂苷在第一组分中的配比浓度很重要。
[0104]
对比例4
[0105]
原料配比与实施例1仅区别于：第二组分中氯化镁的浓度为0.2mm，其他组分配比不变。测试方法与实施例1相同。
[0106]
扩增结果如图6所示。
[0107]
结论：由图6可以看出，当氯化镁的浓度过低，会影响第二组pcr反应结果。说明氯
化镁在第二组分中的配比浓度很重要。
[0108]
对比例5
[0109]
原料配比与实施例1仅区别于：第二组分中hepes的浓度为2mm，其他组分配比不变。测试方法与实施例1相同。
[0110]
扩增结果如图7所示。
[0111]
结论：由图7可以看出，当hepes的浓度过低，会影响第二组pcr反应结果。说明hepes在第二组分中的配比浓度很重要。
[0112]
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
[0113]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0114]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。