一种鉴定或辅助鉴定大豆是否含有雄性不育基因的方法及其应用

本发明涉及大豆遗传育种领域，尤其涉及一种鉴定或辅助鉴定大豆是否含有雄性不育基因的方法及其应用。

背景技术：

大豆是世界上最为重要的油料作物和高蛋白粮食作物。在我国，大豆是四大粮食作物之一，对保证国家粮食安全、改善城乡人民生活和增加农民收入有十分重要的作用。

大豆是典型的短日照作物，单个品种的适种范围大都在1-1.5个纬度之间，不同纬度地区间引种会因日照长度的变化导致开花时间、成熟期提前或延迟，造成产量下降甚至颗粒无收。同时，我国地域范围大，生态类型多，育种水平不均衡，迫切需要加强优异种质资源的交流应用，提升大豆育种的整体水平，提高我国大豆单产水平。

大豆是典型自花授粉作物，花朵小、去雄难，不利于传统的人工杂交工作的开展。这严重限制了大豆种质资源的挖掘利用，严重限制了优异基因位点的聚合利用。

大豆雄性核不育基因ms1，无需费时费力的人工去雄步骤，可直接借助自然界昆虫或风进行传粉授粉，使封闭式杂交变为开放式杂交，加快种质资源的交流，促进优异基因的聚合，在大豆遗传育种中具有重要作用。

前人研究将ms1定位在satt516-satt595之间，大致物理位置为chr13:22489400-24602997，有2百多万个碱基，2百多个基因。这两个分子标记不是ms1紧密连锁的分子标记，加之ms1的分子本质仍不清楚，限制了ms1的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于，通过分子生物学的方法，提供一种鉴定或辅助鉴定大豆是否雄性不育的方法及其应用。

本发明提供一种鉴定或辅助鉴定大豆是否含有大豆雄性核不育基因ms1的方法，包括检测待测大豆基因组在chr13:22489400-24602997区间内是否存在一个39kb的删除，若存在，则所述待测大豆含有大豆雄性核不育基因或候选含有大豆雄性核不育基因；若不存在所述39kb的删除，则所述待测大豆为不含有大豆雄性核不育基因。

其中，所述检测待测大豆基因组在chr13:22489400-24602997区间内是否存在一个39kb的删除通过下述方法确定：检测所述待测大豆中是否含有分子标记ms1-marker，如果待检测大豆中含有分子标记ms1-marker的序列，则待测大豆基因组存在一个39kb的删除，如果待检测大豆中不含有分子标记ms1-marker，则说明待检测大豆中不含有大豆雄性核不育基因ms1，其中，所述分子标记ms1-marker是如下dna分子：1)其核苷酸序列是seqidno.1的dna分子；

2)大豆基因组中包含1)的dna分子的片段(该片段为来源于大豆基因组的离体dna分子)。

其中，所述检测所述待测大豆中是否含有分子标记ms1-marker包括如下步骤：针对所述分子标记ms1-marker设计特异性引物对，将所述特异性引物对命名为buyu引物对。

其中，所述buyu引物对由seqidno.2和seqidno.3中所示的两条单链dna组成。

进一步，所述方法包括如下步骤：

1)根据所述分子标记ms1-marker的序列，设计并合成分子探针；

2)使用所述分子探针检测待鉴定大豆中是否含有分子标记ms1-marker，如果待检测大豆中含有分子标记ms1-marker的序列，则表明待检测大豆中含有大豆雄性核不育基因ms1，如果待检测大豆中不含有分子标记ms1-marker的序列，则说明待检测大豆中不含有大豆雄性核不育基因ms1。

本发明提供一种鉴定或辅助鉴定不育大豆的方法，以待鉴定大豆的基因组dna为模板，用keyu引物对进行pcr扩增，检测扩增产物的大小，按照如下方法确定所述待鉴定大豆的雄性可育性：如果待鉴定大豆的pcr扩增产物有219bp的dna片段，则待鉴定大豆为不育大豆或候选为不育大豆；所述keyu引物对由seqidno.4和seqidno.5中所示的两条单链dna序列组成。

本发明还提供一种鉴定或辅助鉴定纯合型不育大豆的方法，所述方法包括以待鉴定大豆的基因组dna为模板，分别使用所述keyu引物对和所述buyu引物对进行pcr扩增，通过电泳检测扩增产物，如果待鉴定大豆的pcr扩增产物电泳带仅有342bp的阳性条带，没有219bp的阳性条带，则待鉴定大豆为纯合型不育大豆。

所述buyu引物对，或所述分子标记ms1-marker也应在本发明的保护范围之内。

含有所述buyu引物对的鉴定或辅助鉴定大豆雄性不育的试剂或者试剂盒也应在本发明的保护范围之内。

所述的方法、所述分子标记ms1-marker、所述引物对或者所述的试剂或试剂盒的用途，所述用途为1)或2)：

1)所述的方法、所述分子标记ms1-marker、所述引物对或者所述的试剂或试剂盒在大豆育种的应用；

2)所述的方法、所述分子标记ms1-marker、所述引物对或者所述的试剂或试剂盒在筛选含有大豆雄性核不育基因的大豆中的应用。

附图说明

图1为高通量测序鉴定ms1位点的大片段删除示意图；

图2为在轮回群体不育株系中分子鉴定ms1位点侧翼特征序列的电泳图谱；

图3为ms1位点侧翼特征序列的比对结果；

图4为在f2群体不育株系中分子鉴定ms1位点侧翼特征序列的电泳图谱；

图5为在f2群体可育株系中分子鉴定ms1位点侧翼特征序列的电泳图谱；

图6为在f2群体可育株系中分子鉴定ms1位点相关删除片段的电泳图谱；

图7为在f2群体不育株系中分子鉴定ms1位点相关删除片段的电泳图谱。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由北京擎科公司完成。

实施例1

与大豆雄性核不育基因ms1的紧密连锁的分子标记的获得

本实施例利用高通量测序技术，在ms1大致区间chr13:22489400-24602997发现了一个约39kb的删除(如图1所示)。

根据删除片段两侧的序列，设计如下引物:

从大豆ms1轮回群体(大豆ms1轮回群体核心种质在贵州的性状表现及相关性，陈东亮，陈佳琴等，2018中公开，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获取)中，随机选择30个不育株系(1-30)，提取基因组dna，作为pcr反应模板，以buyu-f和buyu-r为引物对进行pcr扩增，扩增体系如下：

pcr反应条件：先95℃预变性5min；然后95℃30sec，52℃30sec，72℃45sec，35个循环；再72℃延伸10min，16℃保存。

将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。其中，m为d2000plusladder的dna分子量标准，1-30为不育株系的pcr产物。结果表明编号为1-30的不育株系均获得342bp的阳性片段。切下阳性条带，纯化回收后，进行测序。测序结果通过比对分析表明获得的342bp片段确实为39kb片段删除的两侧序列(如图3所示)，删除长度为38760bp，选择所述删除片段两侧各30bp的序列形成的片段序列为分子标记ms1-marker(即seqidno.1中的序列)。所有不育株系均发生片段删除，说明这一片段删除与不育性状紧密连锁。

实施例2

与大豆雄性核不育基因ms1的紧密连锁的分子标记的应用

根据删除片段的本身序列，设计特异性引物keyu-f和keyu-r。引物序列如下：

从大豆ms1轮回群体中，随机选择24个不育植株(1-24)和24个可育植株(25-48)，提取各自基因组dna，并作为pcr反应模板，分别使用keyu引物对和buyu引物对进行pcr扩增，扩增体系如下：

pcr反应条件：先95℃预变性5min；然后95℃30sec，52℃30sec，72℃45sec，35个循环；再72℃延伸10min，16℃保存。

琼脂糖凝胶电泳表明，对于buyu引物对(如seqidno.2和seqidno.3所示)，所有不育植株(24个,1-24)均获得342bp的阳性条带，说明这些不育系发生了发生片段删除，含有雄性不育ms1基因；可育植株(24个，25-48)中有16个株系也获得342bp的阳性条带，含有雄性不育ms1基因，这符合基因型ms1ms1:ms1ms1之比为1:2的孟德尔分离定律。对于keyu引物对(如seqidno.4和seqidno.5所示)，所有24个可育株系(25-48)均有219bp阳性条带，说明含有雄性可育ms1基因；24个不育株系(1-24)中只有三个(5、9和13)获得219bp阳性条带，说明这三个不育株系(5、9和13)中含有雄性可育ms1基因。这说明，在这个位点上，21个不育株系(1-4，6-8，10-12，14-24)的基因型为纯合ms1ms1；8个可育株系(24-28，30，34，37，47)的基因型为纯合ms1ms1，其余可育株系为杂合ms1ms1。这个位点基因型的鉴定，可明显加快优异基因的聚合，促进ms1轮回群体的育种应用。由于除了自身基因的特殊性可以引起植株不育外，其他原因比如环境影响、营养不良也有可能导致植株不育；另外观测时机不合适也有可能导致不育表型判断不准确。通过本发明的方法，能够筛选伪不育株系，精确分析大豆不育的成因，为后续的大豆分子聚合育种提供理论支持。

实施例3

与大豆雄性核不育基因ms1的紧密连锁的分子标记的应用

根据片段序列ms1-marker(其核苷酸序列如seqidno.1所示)，设计并合成地高辛标记的分子探针(所述分子探针的核苷酸序列如seqidno.6所示)。

从大豆ms1轮回群体中，随机选择24个不育株系(1-24)和24个可育株系(25-48)，提取各自基因组dna。采用斑点杂交方法，检测ms1-marker是否存在。基本步骤如下：

1预处理处理：将尼龙膜浸泡于20×ssc中吸足液体后，夹在两层滤纸中37℃烘烤20—30min。(将尼龙膜置入烤箱后立即进行下一步操作)

2.变性：将基因组dna样品，置于pcr仪中100℃加热10min，立即置冰中，并置于-20℃冰箱中骤冷5min。

3.点样：将上述变性后的样品各2μl点在尼龙膜的毛面上，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤30min。

4.预杂交：将杂交膜封入杂交袋中(每两组的膜背靠背封在一个杂交袋中)，做好剪角标记(勿过大)。用1000μl加样器，加入预杂交液(digeasyhyb)，每组5ml全部加完，使尼龙膜恰恰漂起即可，若5ml预杂交液不足，可适当补加。除去气泡，置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min-60min。

5.杂交液制备：用预杂交液将分子探针按100ng/ml浓度稀释，即为杂交液。

6.杂交：剪开杂交袋一个小角，倾去预杂交液，加入杂交液2-3ml，除去气泡，封口。置50℃恒温摇床上，轻轻振荡过夜。

7.洗膜：(1)回收杂交液；(2)室温下，用2×washsolution洗膜两次，每次5min；(3)将0.1×washsolution预热到50℃洗膜两次，每次15min。

8.封闭：取出膜，在含有30mlbufferⅰ的培养皿中浸泡1分钟平衡后，转入30mlbufferⅱ中，室温作用30-60min。

9.酶联抗体结合：将杂交膜封入一个新的杂交袋中，加入3mlanti-dig-ap/bufferⅱ中室温作用30min，经常摇动，使酶联抗体与地高辛结合。

10.洗膜：(1)取出膜，将膜放入含有30mlbufferⅰ的培养皿中，洗膜两次，每次15min。(2)取出膜，将膜放入含有20mlbufferⅲ的培养皿中平衡2min。

11.显色：(1)将45μlnbtsolution和35μlx-phosphate加入到10mlbufferⅲ中，显色液必需现配现用！(2)在10ml新鲜制备的显色底物液中静止避光显色数小时，常在12h内完成显色反应。

如果存在显色反应的，则表明所述检测的基因组中存在ms1-marker，即说明基因组dna含有大豆大豆雄性核不育基因ms1。如果不存在显色反应的，则表明所述检测的基因组中不存在ms1-marker,即说明基因组dna不含有大豆大豆雄性核不育基因ms1。利用类似分子杂交手段，将来可结合dna芯片技术，批量化规模化检测。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种鉴定或辅助鉴定大豆是否雄性不育的方法及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>60

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgtcattgtcataaccaccactactcccatattccctacaccttctgtaacgatgttcaa60

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

caccatcaccactagtatcacttttattac30

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aagttgtgtgattgcccagcaac23

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gacgaccttgttgagtcgaga21

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

atgaagtttgatggttcacgtacta25

<210>6

<211>60

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cgtcattgtcataaccaccactactcccatattccctacaccttctgtaacgatgttcaa60