一种检测B族链球菌核酸实时荧光PCR引物、探针、试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测
技术领域：
，具体来说，涉及一种检测b族链球菌核酸实时荧光pcr引物、探针、试剂盒。
背景技术：
：b族链球菌是一种革兰氏阳性球菌，学名无乳链球菌(s.agalactiae)，早期被兽医界重视是由于它能引起牛乳房炎，严重危害畜牧业。直至1938年，fry首次报告3例人类感染b族链球菌引起产后心内膜炎的死亡，证实b族链球菌也是人类的致病菌。由于该菌细胞壁中多糖物质属于抗原构造分类中的b族，故又被称为b族链球菌(groupbstreptococcus，gbs)。b族链球菌是一种条件致病菌，是国际上公认的新生儿侵袭性感染的首要原因。如果孕妇感染b族链球菌，新生儿就可能在出生时吸入感染的羊水或通过产道时感染b族链球菌。新生儿感染b族链球菌主要表现为早期侵入性感染，以新生儿败血症为主要临床表现。新生儿感染b族链球菌能够导致败血症，肺炎和脑膜炎，发病率和死亡率较高，也可能遗留长期病理状态如耳聋、视力受损、发育障碍以及脑瘫等。同时，b族链球菌还可引起早产、胎儿发育不良(低体重儿)、胎膜早破及晚期流产。美国新哈芬地区历经10年的调查统计结果显示：新生儿败血症年发生率为2.7‰，其中约50％是b族链球菌感染引起的。抗生素(尤其是青霉素)是治疗b族链球菌感染的有效手段，因此为避免抗生素滥用、同时又有效降低新生儿gbs感染，在孕妇产前进行b族链球菌感染筛检显得尤为必要。为降低由于b族链球菌感染导致的新生儿感染，中华医学会妇产科学分会产科学组在《孕前和孕期保健指南建议》(2018版)中明确将gbs筛查作为高危孕妇的备查项目，且最佳检测时间在35～37周。因此，建立有效快捷的孕产妇gbs筛查方法，对于降低新生儿gbs感染具有重要意义。目前，b族链球菌感染的实验室检测方案主要包括传统的培养法和荧光定量pcr法。培养法作为病原微生物检测的金标准，具有特异性高的显著优势，但却具有耗时长、费用大、培养难度高、通量低、灵敏度低等一系列缺点，很难满足临床实际需求；荧光定量pcr法具有灵敏度高、耗时短、通量相对较高的优势。对gbs感染阳性患者进行青霉素治疗是目前临床中最有效的治疗方案。但青霉素抗生素使用是目前所有药物过敏反应中发生率最高的。据统计，全球每年因使用药物发生过敏性休克而致死的人中约75％由青霉素抗生素引起，临床中通过皮试实验测试是否为青霉素过敏体质，但依然存在一定漏检率。而且皮试实验由于其操作的复杂性和结果判断的主观性已逐渐被部分医院取消。过敏反应的发生受多种因素影响，一般认为遗传因素和环境因素决定其发病，即具有遗传易感性的个体在一定环境条件下才会发病。因此，在gbs核酸检测的同时，从遗传学角度提示其青霉素过敏风险，对于gbs感染治疗药物的选择，防止青霉素过敏的发生具有重要意义。研究发现，人类白细胞抗原(humanleucocyteantigen，hla)基因群是调控人体特异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统。其中，hla-drb1*09基因是青霉素药物过敏反应的易感基因，hla-drb1*09与发生速发型过敏反应和出现荨麻疹症状有关，带有hla-drb1*09基因的个体使用青霉素发生过敏的几率比不带有该多态性位点的个体大3-4倍。鉴于以上所述现有临床b族链球菌检测的困难和技术空白，本发明旨在建立一种利用荧光定量pcr技术简便、快速、准确、高通量检测35～37周孕妇gbs感染情况的引物、探针及试剂盒，同时，本发明还提供hla-drb1*09多态性位点引物和探针，从而为gbs感染阳性患者青霉素的使用提供参考依据，避免青霉素过敏的发生。技术实现要素：针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种检测b族链球菌核酸实时荧光pcr引物、探针、试剂盒，能够克服现有技术的上述不足。为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种检测b族链球菌核酸实时荧光pcr引物，其序列为：正向引物序列：5’-caatcacatctgttaaggcttctacac-3’，如seqidno.1所示，反向引物序列：5’-ggttaatgaggctattactagcgttga-3’，如seqidno.2所示。根据本发明的另一方面，提供了一种检测b族链球菌核酸实时荧光pcr探针，其序列为：5’-fam-aatcataaactgtctcagagttggcacgca-qsy，如seqidno.3所示。本发明还提供了一种检测b族链球菌核酸实时荧光pcr试剂盒，包括：扩增反应液、gbs-dr9检测液、阳性对照品、阴性对照品，所述gbs-dr9检测液包括针对b族链球菌camp基因、人hla-drb1*09基因以及内参基因人血红蛋白β基因hbb的特异性引物、探针和rnasefreeddh2o；针对b族链球菌camp基因的引物、探针的序列为：正向引物序列：5’-caatcacatctgttaaggcttctacac-3’，如seqidno.1所示，反向引物序列：5’-ggttaatgaggctattactagcgttga-3’，如seqidno.2所示，探针：5’-fam-aatcataaactgtctcagagttggcacgca-qsy，如seqidno.3所示；针对人hla-drb1*09基因的引物、探针的序列为：正向引物序列：5’-gttatagatgcctctgtgcagatacc-3’，如seqidno.4所示；反向引物序列：5’-agcaggataagtttgagtgtcatttc-3’，如seqidno.5所示；探针：5’-ned-cacccgctccgtcccgttga-qsy3’，如seqidno.6所示；内参人血红蛋白β基因hbb扩增引物、探针的序列为：正向引物序列：5’-ttggacccagaggttctttga-3’，如seqidno.7所示，反向引物序列：5’-gccatgagccttcaccttagg-3’，如seqidno.8所示，探针：vic-5’-tccactcctgatgctg-3’-mgb-nfq，如seqidno.9所示。优选地，针对b族链球菌camp基因的引物浓度为50～400nm，针对b族链球菌camp基因的探针浓度为50～200nm。优选地，针对人hla-drb1*09基因的引物浓度为50～400nm，针对人hla-drb1*09基因的探针浓度为50～200nm。优选地，内参人血红蛋白β基因hbb扩增引物浓度为200nm～800nm；内参人血红蛋白β基因hbb的探针浓度为50nm～200nm。优选地，所述阳性对照品为含有b族链球菌camp基因序列和人hla-drb1*09基因序列的质粒。优选地，所述阴性对照品为rnasefreeddh2o。本发明的有益效果：(1)检测类型广泛：本发明提供了gbs实时荧光pcr检测的引物、探针、试剂盒及检测方法，能够快速、准确且灵敏地检测出b族链球菌，包括ia、ib、ic、ii、iii、iv等13种血清型；(2)填补临床空白：本发明提供了人hla-drb1*09实时荧光pcr的引物、探针及试剂盒，能够快速、准确且灵敏地检测人hla-drb1*09基因，从基因层面提示青霉素过敏风险，填补临床青霉素过敏基因检测空白领域；(3)加快临床诊断效率：实验结果重复性好，精密度高，本发明检测时间周期短，最快能在90分钟内完成检测，极大的节约了检测时间，加快临床诊断效率；(4)全程质量控制：本发明设计了内参基因，可对标本提取和扩增整个过程进行质量监控，能监控dna是否成功提取和pcr过程是否顺利进行，以及监控是否出现人工操作失误；(5)操作简单：本方法仅需操作者将扩增反应液、gbs-dr9检测液和模板进行混合即可上机检测，检测仪器仅依赖于荧光定量pcr仪器，结果ct值仪器可自动判读，对操作人员的要求极其简单，临床可推广性高。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是根据本发明实施例所述的阳性对照品检测结果，图2是根据本发明实施例所述的阴性对照品检测结果。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1本发明建立了一种利用荧光定量pcr技术简便、快速、准确、高通量检测35～37周孕妇gbs感染情况和人hla-drb1*09多态性位点引物、探针及试剂盒，从而为gbs感染及青霉素的使用提供参考依据，试剂盒保存于-20℃。试剂盒规格：50人份/盒，具体组分见表1。表1.试剂盒组分其中，扩增反应液购自南京诺唯赞生物科技有限公司(货号：q113-02/03)，该反应体系包括taqdna聚合酶、4种dntp及各种pcr扩增反应液所需离子。gbs-dr9检测液包括针对b族链球菌camp基因、人hla-drb1*09基因以及内参基因人血红蛋白β基因hbb的特异性引物、探针和rnasefreeddh2o。针对b族链球菌camp基因(如seqidno.10所示)的引物、探针序列为：campf：5’-caatcacatctgttaaggcttctacac-3’，如seqidno.1所示，campr:5’-ggttaatgaggctattactagcgttga-3’，如seqidno.2所示，campp:5’-fam-aatcataaactgtctcagagttggcacgca-qsy，如seqidno.3所示，引物浓度为50～400nm，探针5’端使用fam标记，3’采用abi最新设计的qsy淬灭基团(特异性更强，本底荧光更低)，浓度为50～200nm。人hla-drb1*09基因(如seqidno.11所示)引物、探针：dr9f:5’-gttatagatgcctctgtgcagatacc-3’，如seqidno.4所示，dr9r:5’-agcaggataagtttgagtgtcatttc-3’，如seqidno.5所示，dr9p:5’-ned-cacccgctccgtcccgttga-qsy3’，如seqidno.6所示，引物浓度为50～400nm，探针5’端使用ned标记，3’采用abi最新设计的qsy淬灭基团，浓度为50～200nm。内参人血红蛋白β基因(如seqidno.12所示)hbb扩增引物、探针：hbbf:5’-ttggacccagaggttctttga-3’，如seqidno.7所示，hbbr:5’-gccatgagccttcaccttagg-3’，如seqidno.8所示，hbbp:vic-5’-tccactcctgatgctg-3’-mgb-nfq，如seqidno.9所示，引物浓度为200nm～800nm；探针浓度为50nm～200nm，探针5’端使用vic标记，3’采用mgb-nfq作为淬灭基团。阳性对照品：含有b族链球菌camp基因序列、人hla-drb1*09基因序列的质粒。阴性对照品：rnasefreeddh2o。使用上述试剂盒检测的方法为以gbs或人基因组dna为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光pcr扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断。所述扩增反应体系包括：样品模板、扩增反应液、gbs-dr9检测液。扩增程序为：50℃2min(1个循环)；95℃5min(1个循环)；95℃10sec，60℃30sec，(40个循环)。荧光定量pcr仪参数设定中，以rox作为passivereference。对扩增曲线进行分析判断原则为：当fam荧光通道中扩增曲线呈s型，且ct≤35时，判断样品为gbs阳性；当fam荧光通道中ct>35或无扩增；vic荧光通道中扩增曲线呈s型，且ct≤35时，判断样品为gbs阴性；当ned荧光通道中扩增曲线呈s型，且ct≤35时，判断样品为hla-drb1*09阳性；当ned荧光通道中ct>35或无扩增；vic荧光通道中扩增曲线呈s型，且ct≤35时，判断样品为hla-drb1*09阴性；当fam/ned荧光通道中ct>35或无扩增，且vic荧光通道中ct>35或无扩增，判定为实验异常，需要重新提取标本检测或重新取样检测。实施例2对实施例1所述的试剂盒性能进行验证样本处理：选用《b族链球菌核酸检测试剂国家参考品》(批号370030-201801)进行试剂盒性能验证。所有样本按照美基生物核酸提取试剂盒(产品编号：ivd4173)进行核酸，所得dna样本保存于2-8℃；若样本长时间不使用可保存于-20℃。pcr扩增：按表2配置pcr扩增反应液(每个反应20μl)。将配置好的pcr扩增反应液按20μl每个反应孔进行分装。将已提取好的样品dna、阳性对照品dna、阴性对照品dna各5μl加入相应反应孔，上机进行pcr扩增。表2.pcr扩增反应液扩增程序：50℃2min(1个循环)；95℃5min(1个循环)；95℃10sec，60℃30sec，(40个循环)。选择fam(reporter:fam；quencher:none)检测gbs靶基因、选择ned(reporter:ned；quencher:none)检测hla-drb1*09靶基因；选择vic(reporter:vic；quencher:nfq-mgb)荧光检测通道检测内参基因，passivereference设置为rox。荧光数据采集在60℃。阳性对照品检测结果如图1所示，阴性对照品检测结果如图2所示。结果分析：当fam荧光通道中扩增曲线呈s型，且ct≤35时，判断样品为gbs阳性；当fam荧光通道中ct>35或无扩增；vic荧光通道中扩增曲线呈s型，且ct≤35时，判断样品为gbs阴性；当ned荧光通道中扩增曲线呈s型，且ct≤35时，判断样品为hla-drb1*09阳性；当ned荧光通道中ct>35或无扩增；vic荧光通道中扩增曲线呈s型，且ct≤35时，判断样品为hla-drb1*09阴性；当fam/ned荧光通道中ct>35或无扩增，且vic荧光通道中ct>35或无扩增，判定为实验异常，需要重新提取标本检测或重新取样检测。试剂盒性能：如表3所示，对13份国家参考品的阳性样本进行检测，结果均为阳性，阳性符合率为100％。表3.gbs国家阳性参考品如表4所示：对国家参考品中的肺炎链球菌、化脓性链球菌、嗜热乳酸链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌dh5α和白假丝酵母菌10种病原菌进行检测，检测结果均为阴性，符合率100％。表4.gbs国家阴性参考品精密度：本试剂盒检测稀释至1×107cfu/ml的gbs1、gbs5，各重复检测10次，cv≤5％。最低检出限：本试剂盒最低检测限为1×104cfu/ml。本试剂盒对稀释至不高于1×104cfu/ml的gbs1、gbs2、gbs5，检测结果均为阳性。实施例3采用实施例1所述的试剂盒对50份临床样本检测(1)样本处理：使用阴道拭子采集50名2020年4月就诊于北京朝阳医院妇产科35-37周产检孕妇阴道标本。样本采集要点：阴道标本采集前24小时，禁止性交，盆浴、阴道检查、阴道灌洗及局部是药等，以免影响检查结果。一般采用盐水浸湿的棉拭子睚阴道深部或阴道穹后部、宫颈管口等处取材，制备成1ml阴道分泌物的生理盐水溶液备用。每份样本取200μl、连同阴性、阳性对照品，按照美基生物核酸提取试剂盒(产品编号：ivd4173)进行核酸提取dna待用。(2)pcr扩增：按表5配置pcr扩增反应液(每个反应20μl)，将配置好的pcr扩增反应液液按20μl每个反应孔进行分装。将已处理样本dna、阳性对照品dna、阴性对照品dna各5μl加入相应反应孔，上机进行pcr扩增。表5pcr扩增反应液组分1个反应体积60gbs-dr9检测液7.5μl450μl扩增反应液12.5μl750μl总体积20μl1200μl扩增程序：50℃2min(1个循环)；95℃5min(1个循环)；95℃10sec，60℃30sec，(40个循环)。选择fam(reporter:fam；quencher:none)检测gbs靶基因、选择ned(reporter:ned；quencher:none)检测hla-drb1*09靶基因；选择vic(reporter:vic；quencher:nfq-mgb)荧光检测通道检测内参基因，passivereference设置为rox。荧光数据采集在60℃。(4)结果分析：当fam荧光通道中扩增曲线呈s型，且ct≤35时，判断样品为gbs阳性；当fam荧光通道中ct>35或无扩增；vic荧光通道中扩增曲线呈s型，且ct≤35时，判断样品为gbs阴性；当ned荧光通道中扩增曲线呈s型，且ct≤35时，判断样品为hla-drb1*09阳性；当ned荧光通道中ct>35或无扩增；vic荧光通道中扩增曲线呈s型，且ct≤35时，判断样品为hla-drb1*09阴性；当fam/ned荧光通道中ct>35或无扩增，且vic荧光通道中ct>35或无扩增，判定为实验异常，需要重新提取标本检测或重新取样检测。同时，采用购自博尔诚(北京)科技有限公司的b族链球菌(gbs)核酸检测试剂盒(国械注准20163402238)对50例样本进行对比检测(见表6)，其结果判定严格按照说明书进行。最终两种试剂盒检测结果显示其中8例阳性，42例阴性，与已获批荧光定量pcr试剂盒检测结果符合率100％。50例中，7人为hla-drb1*09位点阳性；8例gbs阳性患者中2人hla-drb1*09位点阳性，提示青霉素过敏高风险。表6.50例临床样本gbs核酸胶体金层析法与荧光定量pcr检测结果对比综上所述，借助于本发明的上述技术方案，通过将采集的细胞样本经常规方法提取核酸后，在taqdna聚合酶的作用下，使用taqman探针，利用实时荧光信号实现b族链球菌核酸检测。本试剂盒没有复杂的核酸提取过程；荧光定量pcr过程采用一步法进行，操作简单快捷，对操作人员素质的要求也较低。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>北京华瑞康源生物科技发展有限公司<120>一种检测b族链球菌核酸实时荧光pcr引物、探针、试剂盒<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1caatcacatctgttaaggcttctacac27<210>2<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggttaatgaggctattactagcgttga27<210>3<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aatcataaactgtctcagagttggcacgca30<210>4<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gttatagatgcctctgtgcagatacc26<210>5<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5agcaggataagtttgagtgtcatttc26<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cacccgctccgtcccgttga20<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ttggacccagaggttctttga21<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gccatgagccttcaccttagg21<210>9<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9tccactcctgatgctg16<210>10<211>768<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10atgaacgttaaacatatgatgtatttatctggaactctagtggctggtgcattgttattt60tcaccagctgtattagaagtacatgctgatcaagtgacaactccacaagtggtaaatcat120gtaaatagtaataatcaagcccagcaaatggctcaaaagcttgatcaagatagcattcag180ttgagaaatatcaaagataatgttcagggaacagattatgaaaaaccggttaatgaggct240attactagcgttgaaaaattaaagacttcattgcgtgccaactctgagacagtttatgat300ttgaattctattggtagtcgtgtagaagccttaacagatgtgattgaagcaatcactttt360tcaactcaacatttagcaaataaggttagtcaagcaaatattgatatgggatttgggata420actaagctagttattcgcattttagatccatttgcttcagttgattcaattaaagctcaa480gttaacgatgtaaaggcattagaacaaaaggttttaacttatcctgatttaaaaccaact540gatagagctaccatctatacaaaatcaaaacttgataaggaaatttggaatacacgtttt600actagagataaaaaagtacttaacgtcaaagaatttaaagtttacaatactttaaataaa660gcaatcacacatgctgttggagttcagttgaatccaaatgttacggtacaacaagttgat720caagagattgtaacattacaagcagcacttcaaacagcattaaaataa768<210>11<211>339<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tctgcacacggtgtccacctcggcccgcctccgctccaggaagtccttctggctgttcca60ggactcggcgacaggccgccccagctccgtcaccgcccggtactcccccacgtcgctgtc120gaagcgcacgttctcctcttggttatagatgcctctgtgcagataccgcacccgctccgt180cccgttgaagaaatgacactcaaacttatcctgcttcaagaaacgtgctgtggggacacg240aaggatccggtcacaggggcggcctccggggaagacactaacagagacgccaccatccgg300ggctccctgggcggggtgctggcactggaaccttaactg339<210>12<211>365<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaag60gagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcac120tgactctctctgcctattggtctattttcccacccttaggctgctggtggtctacccttg180gacccagaggttctttgagtcctttggggatctgtccactcctgatgctgttatgggcaa240ccctaaggtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgcctttagtgatggcctggctca300cctggacaacctcaagggcacctttgccacactgagtgagctgcactgtgacaagctgca360cgtgg365当前第1页12