三重检测副溶血弧菌的PCR引物组、试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种三重检测副溶血弧菌的pcr引物组、试剂盒及其检测方法。

背景技术：

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌，是海水和江河口环境中的固有微生物。它能通过食物和水引起人类的疾病，同时也对生长在海水和江河口环境中的动物有致病性，包括养殖的动物。副溶血性弧菌广泛存在于各种海产品中，鱼体带菌率约为20％～90％。一般情况下，海产品体内外均带菌，但当海产品作为食品被捕捞后，体外菌体迅速死亡，体内的副溶血性弧菌会很快感染整个海产品。

中国水产品出口国主要集中在日本、美国、欧盟和韩国，仅这四大市场就占到了总出口量的85％左右。而这四个国家对进口水产品的安全要求中都明确规定副溶血性弧菌等致病菌一律不得检出。对原产自中国的进口水产品强制性要求进行副溶血性弧菌检测，检测结果为阳性时产品将被就地销毁，这给我国水产品的出口设置了贸易壁垒。

目前副溶血性弧菌的分子生物学检测方法主要有pcr技术，包括常规pcr、多重pcr、实时荧光定量pcr等，这些方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时、对标本的纯度要求低、不需要分离细菌等特点。但是，目前现有的用于检测副溶血弧菌的引物组，只适用于特定的副溶血性弧菌血清型，不能检测全部的副溶血性弧菌，而且在检测过程中，其他种类的弧菌也可能会造成干扰。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，更加准确高效的检测出副溶血性弧菌，本发明提供了一种三重检测副溶血弧菌的引物组，包含三对引物，分别是ahpnd引物上下游引物对分别是seqidno:1，seqidno:2；para引物上下游引物对分别是seqidno:3，seqidno:4；弧菌管家基因引物上下游引物对分别是seqidno:5，seqidno:6。具体序列如下：

本发明还提供一种三重检测副溶血弧菌的试剂盒，含有以下试剂：

a液:

pcr反应液含2xtaqpcrmix12.5ul、所述的三对引物，其中引物对浓度均为10um；

b液：ddh2o100ul，作为阴性对照。

利用上述的引物和试剂盒，本发明还提供一种检测副溶血弧菌三重pcr检测方法，包括下列步骤：

(一)待测样本的核酸提取

提取待测样本的dna，-20℃保存。

(二)pcr扩增反应体系

将10×pcr缓冲液、dntps、taqdna聚合酶、检测引物组以及步骤(一)提取的样本dna模板加入灭菌pcr反应管中，添加灭菌双蒸水至总体积25μl，同时设置阳性、阴性对照，使用pcr仪进行扩增反应。

反应体系如下：

pcr总反应体系为25ul，其中premix12.5ul，vibrio-para-syrb-for31.2ul，vibrio-para-syrb-rev31.2ul，vibriouniversefor0.4ul，vibriouniverserev0.4ul，vibrioahpndfor1ul，vibrioahpndrev1ul，模板1ul，ddh2o6.3ul；

扩增循环参数：94℃，1min；[94℃，10s；60℃,50s]35*；72℃，10min。在含genefinder2％的琼脂糖凝胶中电泳，110v，30分钟，分析实验结果。

本发明的有益效果：

本发明公开了一种检测副溶血弧菌的三重检测技术，副溶血弧菌有非常多种的血清型，现有技术的检测引物并不能检测出所有的副溶血弧菌，在实际检测中，容易漏检，而且其他种类的弧菌也会造成干扰。本发明提供的三重检测副溶血弧菌的引物和试剂盒，可以将副溶血弧菌和其他弧菌区分，并且准确度和特异性更强。

附图说明

图1para引物特异性鉴定副溶血弧菌pcr结果。

图2是弧菌管家基因引物特异性鉴定弧菌pcr结果。

图3是para引物/弧菌管家基因引物二重检测弧菌pcr结果。

图4是以u-for、u-rev、a-for、a-rev和p-for、p-rev为引物的三重pcr特异性检测电泳图。

图5是三重检测副溶血弧菌的方法的灵敏度结果图。

图6是弧菌管家基因引物检测副溶血弧菌的方法的灵敏度结果图。

图7是ahpnd引物检测副溶血弧菌的方法的灵敏度结果图。

图8是para引物检测副溶血弧菌的方法的灵敏度结果图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

实施例1

本实施例提供一组三重检测副溶血弧菌的引物，包含三对引物，分别是ahpnd引物上下游引物对分别是seqidno:1，seqidno:2；para引物上下游引物对分别是seqidno:3，seqidno:4；弧菌管家基因引物上下游引物对分别是seqidno:5，seqidno:6。具体序列如下：

利用上述引物，还提供一种三重检测副溶血弧菌的试剂盒，含有以下试剂：

a液:

pcr反应液含2xtaqpcrmix12.5ul、所述的三对引物，其中引物对浓度均为10um；

b液：ddh2o100ul，作为阴性对照。

利用上述的引物和试剂盒，一种检测副溶血弧菌三重pcr检测方法，包括下列步骤：

(一)待测样本的核酸提取

提取待测样本的dna，-20℃保存。

(二)pcr扩增反应体系

将10×pcr缓冲液、dntps、taqdna聚合酶、检测引物组以及步骤(一)提取的样本dna模板加入灭菌pcr反应管中，添加灭菌双蒸水至总体积25μl，同时设置阳性、阴性对照，使用pcr仪进行扩增反应。

反应体系如下：

pcr总反应体系为25ul，其中premix12.5ul，vibrio-para-syrb-for31.2ul，vibrio-para-syrb-rev31.2ul，vibriouniversefor0.4ul，vibriouniverserev0.4ul，vibrioahpndfor1ul，vibrioahpndrev1ul，模板1ul，ddh2o6.3ul；

扩增循环参数：94℃，1min；[94℃，10s；60℃,50s]35*；72℃，10min。在含genefinder2％的琼脂糖凝胶中电泳，110v，30分钟，分析实验结果。

实施例2单引物pcr体系对菌种鉴定

(一)利用6种芽孢杆菌、2种杀鲑气单胞菌和7种副溶血弧菌及其它8种弧菌的dna作为模板。对para引物特异性鉴定副溶血弧菌进行特异性评价。

扩增条件是：

95℃,5min,[95℃,30s；55℃,30s；72℃,40s]*35,72℃,10min。

图1是para引物特异性鉴定副溶血弧菌pcr结果。图中：m:dl2000marker；1～2:地衣芽孢杆菌；3～4：短小芽孢杆菌；5～6：枯草芽孢杆菌；7～8：坚强芽孢杆菌；9～10：蜡样芽孢杆菌；11～12：解淀粉芽孢杆菌；13～14：杀鲑；15～16：杀鲑；17～18：副溶血-126；19～20：副溶血-128；21～22：副溶血-137；23～24：副溶血-154；25～26：副溶血-201；27～28：副溶血-237；29～30：副溶血-自保存；31～32：欧文；33～34：坎贝氏；35～36：坎贝氏；37～38：巴西弧菌；39～40：海弧菌/强壮弧菌；41～42：coralliilvticus；43～44：塔氏弧菌；45～46：空白对照。

结果显示，7种副溶血弧菌均出现特异性条带，而其他菌均未出现特异性条带。结论：只有副溶血弧菌可扩增，引物特异。

(二)对弧菌管家基因引物特异性鉴定弧菌进行特异性评价。

扩增条件是：

95℃,5min,[95℃,30s；55℃,30s；72℃,40s]35*,72℃,10min

结果显示，14种弧菌均出现特异性条带，而其他菌均未出现特异性条带，见图2。图中：m:dl2000marker；1～2:地衣芽孢杆菌；3～4：短小芽孢杆菌；5～6：枯草芽孢杆菌；7～8：坚强芽孢杆菌；9～10：蜡样芽孢杆菌；11～12：解淀粉芽孢杆菌；13～14：杀鲑；15～16：杀鲑；17～18：副溶血-126；19～20：副溶血-128；21～22：副溶血-137；23～24：副溶血-154；25～26：副溶血-201；27～28：副溶血-237；29～30：副溶血-自保存；31～32：欧文；33～34：坎贝氏；35～36：坎贝氏；37～38：巴西弧菌；39～40：海弧菌/强壮弧菌；41～42：coralliilvticus；43～44：塔氏弧菌；45～46：空白对照。

结论：证明para3引物实验中使用的其他弧菌(欧文/坎贝氏/巴西弧菌/海弧菌/coralliilvticus/塔氏弧菌)是弧菌。

实施例3双引物pcr体系对菌种鉴定

利用6种芽孢杆菌、2种杀鲑气单胞菌和6种副溶血弧菌及其它6种弧菌的dna作为模板。对para引物/弧菌管家基因引物二重检测鉴定副溶血弧菌/弧菌进行特异性评价，结果显示，12种弧菌均出现弧菌特异性条带，6种副溶血弧菌均出现副溶血特异性条带，而其他菌均未出现特异性条带，见图3。图中：m:dl2000marker；1～2:地衣芽孢杆菌；3～4：短小芽孢杆菌；5～6：枯草芽孢杆菌；7～8：坚强芽孢杆菌；9～10：蜡样芽孢杆菌；11～12：解淀粉芽孢杆菌；13～14：杀鲑；15～16：杀鲑；17～18：副溶血-126；19～20：副溶血-128；21～22：副溶血-137；23～24：副溶血-154；25～26：副溶血-201；27～28：副溶血-237；29～30：欧文；31～32：坎贝氏；33～34：巴西弧菌；35～36：海弧菌/强壮弧菌；37～38：coralliilvticus；39～40：塔氏弧菌；41～42：空白对照。

说明：使用2重引物检测芽孢/杀鲑为弧菌阴性，检测多种副溶血为弧菌阳性/副溶血弧菌阳性，检测非副溶血弧菌的其他弧菌为弧菌阳性/副溶血弧菌阴性。检测结果准确快色。模板浓度低至4-10ug/ul也可以进行准确检测。

结论：副溶血弧菌2重引物检测鉴定副溶血弧菌的方法快速直观准确的判定出弧菌和副溶血弧菌。

实施例4三引物pcr体系对菌种鉴定

利用6种芽孢杆菌、2种杀鲑气单胞菌和7种副溶血弧菌及其它7种弧菌的dna作为模板。对ahpnd/para引物/弧菌管家基因引物三重检测鉴定ahpnd/副溶血弧菌/弧菌进行特异性评价。见图4。

图中：泳道1：dl2000marker；泳道2-7：20140722001-1(126)vibrioparahaemolyticu，20140723005(128)vibrioparahaemolyticus，20140829008-1(137)vibrioparahaemolyticus，20150710009-1(154)vibrioparahaemolyticus，20151116002-3(201)vibrioparahaemolyticus，20160303005-1(237)vibrioparahaemolyticus；泳道8：20190801021-vibriobrasiliensis；泳道9：20190801044-vibriopelagius；泳道10：20190801075-vibriocoralliilyticus；泳道11：vibriocampbelli；泳道12：vibrioparahaemolyticus；泳道13：bacilluslicheniformis-05；泳道14：bacillusaustralimaris-12；泳道15：bacillussubtilis-23；泳道16：bacillusfirmus-24；泳道17：bacilluscereus-65；泳道18：bacillusamyloliquefaciens-j；泳道19：dl2000marker；泳道20：杀鲑；泳道21：杀鲑；泳道22：阴性对照。

结果显示，14种弧菌均出现弧菌特异性条带，7种副溶血弧菌均出现副溶血特异性条带，其中7种副溶血弧菌都有ahpnd，而其它弧菌不含有ahpnd。

实施例5本发明提供的引物的灵敏度测试

具体结果见图5-8。