一种用于检测鼠疫耶尔森菌的荧光PCR试剂及方法与流程

本发明涉及病原微生物检测技术，具体地说涉及鼠疫耶尔森菌的核酸检测。
背景技术：
：鼠疫是我国传染病防治法规定的甲类传染病，其病原体为鼠疫耶尔森菌(yersiniapestis)。鼠疫依发病部位不同可分为腺鼠疫、败血型鼠疫、肺鼠疫、肠鼠疫、脑膜炎型鼠疫、眼鼠疫、皮肤鼠疫等，其中以腺鼠疫最常见。鼠疫的主要传播途径有：(1)蚤类叮咬。鼠疫的最主要传染源是啮齿类动物，鼠疫耶尔森菌可通过蚤类叮咬传染给人类和其他动物。人类鼠疫的首发病例多由寄生于家鼠的印鼠客蚤(xenopsyllacheopis)叮咬所致。鼠疫耶尔森菌经皮肤进入人体，沿淋巴循环和血循环扩散，引起腺体坏死和败血症，即腺鼠疫和败血型鼠疫。(2)接触传播。鼠疫耶尔森菌可以通过伤口，包括如手指的倒刺等细小的伤口等进入人体，然后经淋巴管或血液引起腺鼠疫或败血型鼠疫。(3)飞沫传播。鼠疫患者呼吸道中的鼠疫耶尔森菌可经呼吸、咳嗽飞沫进行传播，吸入一定数量的鼠疫耶尔森菌后，可引起肺鼠疫。(4)食物传播。鼠疫耶尔森菌可通过食物，主要是未煮熟的鼠疫病死动物，感染消化道，引发肠鼠疫。对鼠疫的实验室检验除了血常规、尿常规、便常规、影像学、免疫学等之外，还离不开对鼠疫耶尔森菌的核酸检测。鼠疫耶尔森菌分类学属于变形菌门、γ-变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科、耶尔森菌属、鼠疫耶尔森菌。鼠疫耶尔森菌也称“鼠疫杆菌”，呈革兰氏阴性、短小杆状。基因组由一条环状染色体(约4.65mb)和3个质粒(pcd1、ppcp1、pmt1)组成，其中ppcp1和pmt1是鼠疫耶尔森菌特有的质粒。基于荧光pcr技术的核酸检测是鼠疫耶尔森菌检测的重要手段，需对患者淋巴结穿刺液、血液、痰液，咽部或眼分泌物、吐泻物、脑脊液、管状骨骨髓或其它脏器标本中检测鼠疫耶尔森菌。出于特异性和灵敏度的考虑，现有的鼠疫耶尔森菌荧光pcr检测试剂多以ppcp1质粒上的编码plasminogenactivator的pla基因和pmt1质粒上编码f1capsuleantigen的caf1基因作为检测靶标。研究表明ppcp1质粒在鼠疫耶尔森菌细胞中有150-200个拷贝，但2％的鼠疫耶尔森菌不含ppcp1质粒；pmt1质粒在鼠疫耶尔森菌细胞中有两个拷贝，但也有2％的鼠疫耶尔森菌不含pmt1质粒。这意味着以pla基因和caf1基因为靶标检测鼠疫耶尔森菌存在一定的漏检风险。鼠疫的防疫和临床诊断需要一种更准确可靠，特别是能防止漏检风险的鼠疫耶尔森菌荧光pcr检测试剂。技术实现要素：本发明的目的是提供一种更准确可靠的鼠疫耶尔森菌pcr检测试剂。本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：1.引物、探针设计及反应体系建立本发明所述的鼠疫耶尔森菌荧光pcr检测试剂以鼠疫耶尔森菌染色体上编码dnaadeninemethylase的dam基因和ppcp1质粒上的pla基因作为检测靶标。dam基因由于在染色体上，不容易丢失，在不同的菌株间具有良好的包容性；pla基因在质粒上，有丢失风险，但在大部分菌株中具有高达150-200个拷贝数。同时以dam基因和pla基因作为检测靶标既对大部分菌株有较高的检测灵敏度，又确保个别菌株不会由于pla基因缺失而漏检。本发明用于检测鼠疫耶尔森菌dam基因和pla基因引物探针分别基于genbank数据库最新的鼠疫耶尔森菌核酸信息设计、筛选而得出，序列如下：检测dam基因的正向引物序列为5’-atccagccgaaaaccagttgt-3’，反向引物的序列为5’-ggcgcggaaattagtcatca-3’，探针的序列为5’-tcgcgccagcagaaccaaatcc-3’。探针的5’端用荧光报告基团fam修饰，荧光报告基团还可选用joe、hex、vic、tet、rox和cy5中的任意一种；3’端用荧光淬灭基团bhq1修饰，荧光淬灭基团还可以选用bhq2、bhq3、tamra和eclipse中的任意一种。该引物、探针的序列在已知鼠疫耶尔森菌核酸序列中高度保守，且对其它物种具有排他性。检测pla基因的正向引物的序列为5’-gttaataccaaatatatcccctgacagc-3’，反向引物的序列为5’-ttcttcctgtttctgcgtcataaag-3’，探针的序列为5’-tacagttgcagcctcca-3’。探针的5’端用荧光报告基团joe修饰，荧光报告基团还可选用fam、hex、vic、tet、rox和cy5中的任意一种；3’端用mgb基团修饰。该引物、探针的序列在已知鼠疫耶尔森菌pla基因序列中高度保守，且对其它物种具有排他性。本发明的鼠疫耶尔森菌荧光pcr检测试剂的反应体积为25μl，其成分组成如表1所示，可配成2x(即12.5μl/反应)的预混液保存于-20℃，使用时加水和待测核酸样本至25μl的反应体积即可上机检测。表1.鼠疫耶尔森菌荧光pcr检测试剂成分成分单份含量单份优选含量200mmtris-hcl缓冲液(ph8.3)2.5μl2.5μl氯化钾0.5-3μmol1.55μmol氯化镁0.02-0.2μmol0.075μmoldntps3-8nmol5nmoltaqdna聚合酶2u2udam基因正向引物2-20pmol10pmoldam基因反向引物2-20pmol10pmoldam基因探针1-10pmol5pmolpla基因正向引物2-20pmol10pmolpla基因反向引物2-20pmol10pmolpla基因探针1-10pmol5pmol冻干赋形剂(仅用于试剂冻干)2.25mg2.25mg2.试剂冻干本发明所述的鼠疫耶尔森菌荧光pcr检测试剂可以是常规的液体剂型，优选地，也可以通过冷冻干燥技术制成冻干型试剂。冻干所得的冻干型试剂的优点是：常温下稳定，无需冷链运输和保存，从而避免了常规液体荧光pcr检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险。本发明提供的鼠疫耶尔森菌冻干型荧光pcr检测试剂按表1的成分冻干而成，可将1份或多份试剂冻干在容器中，优选地，可按1份/管冻干在可直接上机的pcr管或由pcr管组合成的多连管或反应板中。冻干所得的鼠疫耶尔森菌冻干型荧光pcr检测试剂为白色颗粒状，可在遮光、防潮条件下常温保存。单份试剂所含干物质的体积约相当于2μl，使用时直接加总体积为23μl的水和待测核酸样本即可配成25μl的反应体系，优选地，可直接加23μl适当浓度的核酸样本。试剂加水和核酸样本后经慢速震荡可加速溶解，溶解后即可上机检测。3.反应程序及结果判定本发明所述的鼠疫耶尔森菌荧光pcr检测试剂的反应程序按表2设置，根据探针荧光报告基团设置荧光信号。表2.鼠疫耶尔森菌荧光pcr检测试剂反应程序检测结束后，结果按以下标准进行分析：1)检测结果按表3进行质量控制。表3.质量控制(对照)结果判定方法2)样本检测结果按表4依次判定。表4.样本检测结果判定方法本发明的有益效果：本发明提供的鼠疫耶尔森菌荧光pcr检测试剂同时以鼠疫耶尔森菌染色体上的dam基因和ppcp1质粒上的pla基因作为检测靶标，对大部分菌株有较高的检测灵敏度，又确保个别菌株不会因pla基因缺失而被漏检。该试剂所用的引物、探针序列是基于最新的鼠疫耶尔森菌核酸序列信息设计筛选所得，具有良好的包容性、特异性和反应性能，能保证检测的准确性。优选地，本发明运用冷冻干燥技术将鼠疫耶尔森菌荧光pcr检测试剂制成冻干型试剂，常温下稳定，无需冷链运输和保存，从而避免了常规液体荧光pcr检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险，适应长途运输和冷链条件差的地区的使用需要。附图说明图1显示本发明所述的鼠疫耶尔森菌dam基因的检测目标序列以及特异引物和探针的位置。图2显示本发明所述的鼠疫耶尔森菌pla基因的检测目标序列以及特异引物和探针的位置。图3显示冻干于pcr八连管中的鼠疫耶尔森菌荧光pcr检测试剂的形态，可见其形态为白色颗粒。图4显示本发明所述的鼠疫耶尔森菌荧光pcr检测试剂对dam基因和pla基因阳性参考品的检测结果及重复性。图5显示本发明所述的鼠疫耶尔森菌荧光pcr检测试剂对dam基因阳性参考品的扩增效率和不同浓度间的线性关系。图6显示本发明所述的鼠疫耶尔森菌荧光pcr检测试剂对pla基因阳性参考品的扩增效率和不同浓度间的线性关系。具体实施方式以下实施例仅为对本发明的进一步说明，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。实施例1：本实施例提供一种用于检测鼠疫耶尔森菌核酸的荧光pcr引物及探针的设计方案。本发明通过文献研究和genbank核酸数据库分析，选取图1所示的dam基因核酸序列和图2所示的pla基因核酸序列同时作为鼠疫耶尔森菌的检测目标序列。pla基因所在的ppcp1质粒在鼠疫耶尔森菌细胞中有高拷贝数，因而对大部分鼠疫耶尔森菌菌株有较高的检测灵敏度；考虑到一些鼠疫耶尔森菌菌株不含ppcp1质粒，同时以染色体上的dam基因作为检测目标可防止因质粒缺失而被漏检。利用软件primerexpressv3.0设计出以下用于扩增目标序列的引物和用于检测目标序列的探针序列：检测鼠疫耶尔森菌dam基因的正向引物的序列为5’-atccagccgaaaaccagttgt-3’(tm＝59.5℃),反向引物的序列为5’-ggcgcggaaattagtcatca-3’(tm＝59.6℃),探针的序列为5’-tcgcgccagcagaaccaaatcc-3’(tm＝69.1℃)。探针的5’端用荧光报告基团fam修饰，3’端用荧光淬灭基团bhq1修饰。扩增子长度为82bp,该序列通过blast检查确定和同源性最高的yersiniahibernica的序列具有足够的差异，特别是在反向引物的3’端的差异，有效保证对鼠疫耶尔森菌的检测特异性，有效防止对yersiniahibernica的错检。引物、探针序列在已知鼠疫耶尔森菌dam基因中高度保守，即具有良好的包容性，有利于防止漏检(图1)。检测鼠疫耶尔森菌pla基因的正向引物的序列为5’-gttaataccaaatatatcccctgacagc-3’(tm＝59.4℃)，反向引物的序列为5’-ttcttcctgtttctgcgtcataaag-3’(tm＝59.8℃)，探针的序列为5’-tacagttgcagcctcca-3’(tm＝70℃)。探针的5’端用荧光报告基团joe修饰，3’端用mgb基团修饰。扩增子长度为104bp，该序列通过blast检查确定和同源性最高的e.coli、citrobacterkoseri、raoultellaelectrica和enterobactercloacae的序列具有足够的差异，特别是在正、反向引物的3’端的差异，有效保证对鼠疫耶尔森菌的检测特异性，有效防止对e.coli、citrobacterkoseri、raoultellaelectrica和enterobactercloacae的错检。引物、探针序列在已知鼠疫耶尔森菌pla基因中高度保守，即具有良好的包容性，有利于防止漏检(图2)。上述鼠疫耶尔森菌dam基因和pla基因的正向引物、反向引物和探针的gc含量均在合理范围内；引物之间的tm差别微小，有利于引物的同时退火；探针的tm比引物高8℃以上，差别足够大，有利于探针早于引物完成退火。引物和探针的自身结构均维持较好，不会形成阻碍pcr反应的selfdimer、pairdimer和hairpin结构。较短的扩增子也有利于提高pcr反应效率。上述的引物和探针由华大基因合成，用te缓冲液配成100um的保存液和10um的工作液于-20℃保存。实施例2：本实施例演示鼠疫耶尔森菌荧光pcr试剂的制备。本发明提供的鼠疫耶尔森菌荧光pcr试剂按25μl反应体积进行设计和制备，成分见表1，各成分(氯化钾、氯化镁、dntps、taqdna聚合酶、引物和探针)进行梯度用量优化，最终确定表1所示的用量，然后按表1中所述的成分及含量配制成2x(即12.5μl)鼠疫耶尔森菌荧光pcr液体检测试剂。在液体试剂的基础上加上冻干赋形剂(表1)，按每管一个反应的分量分装于pcr八连管中后进行冷冻干燥，得到的鼠疫耶尔森菌冻干型荧光pcr检测试剂为白色颗粒(图3)。向一份冻干试剂中加入23μl无核酸酶水，慢速震荡5-10s，试剂即完全溶解，用移液枪测量得体积为25μl，可知原试剂干物质体积相当于2μl。为防止试剂受潮和曝光，鼠疫耶尔森菌冻干型荧光pcr检测试剂先和硅胶干燥剂一起作真空处理，再包装于铝箔袋中，在常温中保存。实施例3：本实施例演示用本发明所述的鼠疫耶尔森菌冻干型荧光pcr检测试剂对鼠疫耶尔森菌核酸dam基因和pla基因阳性参考品的检测效果。对鼠疫耶尔森菌dam基因和pla基因阳性参考品等量混合后进行10倍梯度稀释，每个浓度取23μl加到1份按实施例2制备的鼠疫耶尔森菌冻干型荧光pcr检测试剂中；23μl无核酸酶水作为阴性对照。所得的25μl反应混合液经慢速震荡溶解、离心后在荧光pcr仪上机检测，反应程序按表2设置。每个处理做3个重复。检测结果如图4所示，本发明所述的鼠疫耶尔森菌冻干型荧光pcr检测试剂对不低于10个拷贝的鼠疫耶尔森菌dam基因和pla基因阳性参考品的检测结果均显阳性，重复之间ct的差异系数(cv)＜5％，阴性对照品没有扩增信号；模板浓度的常用对数及其ct之间呈良好的线性关系(对dam和pla的r2值分别为0.99和0.992)，dam基因和pla基因阳性参考品的扩增效率分别达97.402％和96.339％(图5、6)。可见，本发明提供的鼠疫耶尔森菌冻干型荧光pcr检测试剂的检测效果良好，同时具有多项优点：(1)可常温保存，无传统液体试剂对保存温度(-20℃)的要求；(2)使用前无需解冻，完全避免了反复冻融对试剂活性的影响；(3)已按单份分装，使用时无需配液、分装步骤，减少了试剂损耗和试剂污染的风险。序列表<110><160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>artificialsequence<400>1atccagccgaaaaccagttgt21<210>2<211>20<212>dna<213>artificialsequence<400>2ggcgcggaaattagtcatca20<210>3<211>22<212>dna<213>artificialsequence<400>3tcgcgccagcagaaccaaatcc22<210>4<211>28<212>dna<213>artificialsequence<400>4gttaataccaaatatatcccctgacagc28<210>5<211>25<212>dna<213>artificialsequence<400>5ttcttcctgtttctgcgtcataaag25<210>6<211>17<212>dna<213>artificialsequence<400>6tacagttgcagcctcca17当前第1页12