本发明属于免疫技术领域，特别涉及一种单增李斯特菌免疫磁珠洗液。
背景技术：
单增李斯特菌(l.monocytogenes)是一种能够入侵真核细胞并增殖的革兰氏阳性菌，且类似球形的杆菌。感染单增李斯特菌出现轻微流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产或死婴、脑膜炎、败血症直至死亡。单增李斯特菌引起的脑膜炎致死率可高达70％，败血症的死亡率达50％，围产期或新生儿感染的死亡率超过80％。
众多检测技术中，免疫磁珠法效果显著。免疫磁珠法是一种具有特异性的分离富集技术，在多个领域如dna提取、蛋白纯化、细胞筛选、食源性致病微生物富集等，都有重要的应用价值。高品质的抗体资源对免疫磁珠特异性富集至关重要，但实际应用中，不同的食品基质如肉沫会干扰富集过程，造成免疫磁珠的回收率降低从而降低富集效果。因此在免疫富集操作过程中，需要使用免疫磁珠洗液清除食品杂质。但常规免疫磁珠洗液在实际应用中并没有起到很好的效果，肉沫等复杂食品样品富集时，会损失大量免疫磁珠，从而降低了目标菌的检出率。因此，需要对免疫磁珠洗液的组分进行优化，提高洗液的清洗效果。除此之外，在实际检测中，很多样品的目标菌含量极低，按照国标法增菌后目标菌含量依然很低，导致检出率不高，而且免疫磁珠洗液中还增加了特异性增菌成分，在清洗过程中还可以起到持续增菌的效果。
根据现有技术的缺陷，研制一种单增李斯特菌免疫磁珠洗液成为亟需解决的问题。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于提供一种单增李斯特菌免疫磁珠洗液，以降低食品基质的干扰并提高单增李斯特菌的检出率。
为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一个方面，提出了一种单增李斯特菌免疫磁珠洗液。根据本发明的实施例，所述单增李斯特菌免疫磁珠洗液，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有表面活性剂、蛋白质、水溶性糖、无机盐、特异性抑菌剂，其中特异性抑菌剂可以抑制样品中的非目标菌生长。根据本发明的实施例效果，可提高了洗液的清洗效果，并且有效降低了食品基质的干扰，而且具有特异持续性增菌的功效，尤其是目标菌含量极低的样品增菌效果显著，从而提高了单增李斯特菌的检出率。
根据本发明的实施例，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有0.3～1.4g/l表面活性剂、3.5～5.5g/l无机盐、4.0～27g/l蛋白质、5.0～20.0g/l水溶性糖、4.5～6.5mg/l特异性抑菌剂。
根据本发明的实施例，所述表面活性剂选自tween-20、tritonx-100、ohodasurfon-870中的至少一种；
所述蛋白质选自胰蛋白胨、牛血清白蛋白、乳白蛋白中的至少一种；
所述水溶性糖选自乳糖、葡萄糖的至少一种；
所述无机盐选自nacl、kcl的至少一种；
所述特异性抑菌剂为头孢他啶、多粘菌素b的至少一种。
根据本发明的实施例，所述洗液的ph＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有5～9g/l乳糖、7～11g/l葡萄糖、4～6g/l胰蛋白胨、6～9g/l牛血清白蛋白、8～12g/l乳白蛋白、2.0～3.0mg/l头孢他啶、2.5～3.5mg/l多粘菌素b、3.5～5.5g/lnacl、0.60～0.70g/ltween-20、0.20～0.30g/ltritonx-100和0.30～0.40g/lohodasurfon-870。发明人发现，质量比在上述范围内时，增菌和清洗效果更显著。为了进一步效果，发明人进行了进一步优化，惊喜地发现，配比效果大大增强，在上述范围内时，增菌和清洗效果更佳显著。
根据本发明的实施例，所述洗液的ph＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有5g/l乳糖、7g/l葡萄糖、4g/l胰蛋白胨、6g/l牛血清白蛋白、8g/l乳白蛋白、2.0mg/l头孢他啶、2.5mg/l多粘菌素b、3.5g/lnacl、0.6g/ltween-20、0.20g/ltritonx-100、0.30g/lohodasurfon-870。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。
根据本发明的实施例，所述洗液的ph＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有7g/l乳糖、9g/l葡萄糖、5g/l胰蛋白胨、8g/l牛血清白蛋白、10g/l乳白蛋白、2.5mg/l头孢他啶、3.0mg/l多粘菌素b、4.5g/lnacl、0.65g/ltween-20、0.25g/ltritonx-100和0.35g/lohodasurfon-870。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。
根据本发明的实施例，所述洗液的ph＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有9g/l乳糖、11g/l葡萄糖、6g/l胰蛋白胨、9g/l牛血清白蛋白、12g/l乳白蛋白、3.0mg/l头孢他啶、3.5mg/l多粘菌素b、5.5g/lnacl、0.70g/ltween-20、0.30g/ltritonx-100和0.40g/lohodasurfon-870。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。
根据本发明的实施例，缓冲液为pbs缓冲液或tris-hcl缓冲液。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。
本发明第二方面，本发明提出了前面所述免疫磁珠洗液的制备方法，按前面任一项所述的配方称取各原料，混合即得免疫磁珠洗液。
本发明第三方面，本发明提出了前面所述免疫磁珠洗液的使用方法，包括以下步骤：将免疫磁珠与样品混匀孵育，静置磁分离，去上清；加入前面任一项所述免疫磁珠洗液孵育，静置磁分离，去上清。
根据本发明的实施例，所述免疫磁珠与样品的体积比为：20μl：1ml。
根据本发明的实施例，所述孵育条件为35～37℃孵育10～15min。
根据本发明的实施例，所述静置磁分离1～2min。
根据本发明的实施例，所述免疫磁珠洗液体积为1～2ml。
本发明第四方面，本发明提出了前面任一项所述免疫磁珠洗液作为单增李斯特菌检测试剂的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的单增李斯特菌免疫磁珠洗液组分以特定比例混合，除了提高了清洗效果，并且特异持续增菌，提高了单增李斯特菌的检出率，而且有效降低了食品基质的干扰，提高了免疫磁珠的准确率、灵敏度，确保了免疫磁珠法的准确性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。
ohodasurfon-870是一种表面活性剂，购于扬州施惠尔生物科技有限公司，货号spbhs17。胰蛋白胨(货号t819615)，购自于麦克林公司。头孢他啶(货号c9731)、多粘菌素b(货号:p8350)，购自于北京索莱宝科技有限公司；其他材料、试剂，如无特殊说明，均为商业途径购得。
单增李斯特菌免疫磁珠制备方法：
1)取1mg羧基磁珠放ep管中，加入1ml超纯水中超声30s，离心去上清取沉淀，清洗，最后重悬于100μl超纯水中；
2)缓慢加入mix&go活化剂(货号a-smpn100，购于sigma)100μl，置于混匀仪上室温活化1h；
3)活化后加1mlmest(25mm，ph6.0)缓冲液洗涤2遍，重悬于100μlmes缓冲液中；
4)缓慢加入抗单增李斯特菌抗体(购自于abcam，货号ab35132)50～80μg，置于混匀仪上室温偶联2h；
5)用tbst缓冲液洗涤磁珠，加入1ml封闭液(含1％bsa的pbs溶液)，置于混匀仪上封闭2h；
6)封闭完成后，用tbst缓冲液洗涤磁珠，得到本发明后续实验的单增李斯特菌免疫磁珠。
实施例1～8
实施例1～8的单增李斯特菌免疫磁珠洗液按照表1的配方1～8对原料称取，使用pbs缓冲液(0.1m,ph7.4)配制成相对应的溶液；混合，搅拌混匀，使得洗液的ph＝7.0～7.5，即得单增李斯特菌免疫磁珠洗液。
常规洗液配方为含0.5g/ltween-20的pbs(0.1m，ph7.4)溶液。
表1免疫磁珠洗液不同配方组分
对本发明实施例的免疫磁珠洗液做进一步效果检测。
免疫磁珠洗液的单因素分析
单增李斯特菌免疫磁珠洗液组分：乳白蛋白、ohodasurfon-870单因素水平按表2设置，其他组分使用pbs缓冲液(0.1m,ph7.4)分别配制为7g/l乳糖、9g/l葡萄糖、5g/l胰蛋白胨、8g/l牛血清白蛋白、2.5mg/l头孢他啶、3.0mg/l多粘菌素b、4.5g/lnacl、0.65g/ltween-20、0.25g/ltritonx-100。
将单增李斯特菌按照以下组别设置：0.5cfu/g、1.0cfu/g、2.5cfu/g、5.0cfu/g、10.0cfu/g、15.0cfu/g、20.0cfu/g，分别对猪肉进行人工感染。
依据国标gb4789.4-2016的实验步骤，对感染后的猪肉样品增菌，分别取增菌液1ml、20μl的免疫磁珠加到1ml猪肉样品中混匀后，37℃孵育10min，放入磁力架中静置1～2min，去除上清；加入1ml本发明制备的免疫磁珠洗液混匀后，37℃孵育15min,放入磁力架中静置1～2min后去除上清取沉淀，沉淀洗涤两次。
使用lamp试剂盒(货号kjd05l，广东环凯微生物科技有限公司)说明书或其他定量方法鉴定单增李斯特菌的含量。
表2单增李斯特菌免疫磁珠洗液组分的单因素实验
结果如表2所示，免疫磁珠洗液中乳白蛋白的适宜浓度为2.0～20g/l，单增李斯特菌的检出量为1～10cfu/g，灵敏度极高；cfu/gohodasurfon-870的适宜浓度为0.1～0.6g/l，单增李斯特菌的检出量为5～20cfu/g，灵敏度极高。
对本发明实施例的免疫磁珠洗液做进一步效果检测。
免疫磁珠洗液的灵敏度实验
按照0.5cfu/g、1.0cfu/g、2.5cfu/g、5.0cfu/g、10.0cfu/g、20cfu/g、30cfu/g、50cfu/g八个水平对猪肉样品进行人工污染,依据国标gb4789.4-2016对样品增菌，分别取增菌液1ml，20μl免疫磁珠加入1ml样品中混匀后，37℃孵育10min，放入磁力架中静置1～2min，去除上清；加入1ml免疫磁珠洗液混匀后，37℃孵育15min,放入磁力架中静置1～2min后去除上清，重复洗涤操作进行两次。
最后用lamp试剂盒或其他定量方法进行结果鉴定。
结果如表3所示。使用本发明制备的磁珠洗液能够显著地提高了检测单增李斯特菌的灵敏度，其中配方5(实施例5)阳性检出率最多，效果最好。
表3单增李斯特菌免疫磁珠洗液对检出率的影响
实际样品验证
从三个农贸市场各采集45份猪肉样品，按照国标gb4789.4-2016对样品增菌，分别取增菌液1ml，20μl免疫磁珠加入1ml样品中混匀后，37℃孵育10min，放入磁力架中静置1～2min，去除上清；加入1ml本发明实施例的免疫磁珠洗液混匀后，37℃孵育15min,放入磁力架中静置1～2min后去除上清，重复洗涤操作进行两次，最后用lamp试剂盒进行结果鉴定。
表4免疫磁珠洗液对阳性检出率的影响
从表4中所示的结果可以看出，使用配方4、5、6的洗液检出的阳性样品明显高于常规洗液，其中配方5(实施例5)的检出率最高，本发明实施例5制备的免疫磁珠洗液更有利于提高阳性样品的检出率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。