本发明涉及一种同种微生物不同菌株某种性质的比较方法，特别是一种简单比较山羊支原体山羊肺炎亚种菌株毒力的方法。
背景技术：
山羊传染性胸膜肺炎(ccpp)是一种严重危害养羊业的动物疫病，目前该病主要在亚洲和非洲流行，是oie法定报告疫病。该病病原为山羊支原体山羊肺炎亚种，主要感染山羊和野山羊，引起发烧、咳嗽和呼吸困难等临床症状。研究和制备山羊支原体山羊肺炎亚种疫苗即需要对不同菌株的毒力进行比较，以得到免疫效果最佳的结果。在山羊支原体山羊肺炎亚种致病机理、毒力基因挖掘研究中也常常需要测定其毒力。
目前，山羊支原体山羊肺炎亚种的毒力测定主要依赖实验动物山羊，通过山羊感染试验，测定菌株的致病性和比较菌株的毒力。通过筛选强毒力、免疫原性强的菌株作为疫苗候选菌株。在山羊支原体山羊肺炎亚种毒力基因挖掘和鉴定研究中也常常需要测定突变株和野生株的毒力。然而，实验动物山羊存在价格较为昂贵、饲养要求较高、试验操作复杂、工作量大等缺点。因此，很有必要建立一种简便的比较山羊支原体山羊肺炎亚种菌株毒力的方法。
技术实现要素：
本发明的目的提供一种简单比较分析不同山羊支原体山羊肺炎亚种菌株毒力的方法。
一种简单比较山羊支原体山羊肺炎亚种菌株毒力的方法，其特征在于将等浓度的经复苏的山羊支原体山羊肺炎亚种接种于鸡胚上，再将接种后的鸡胚置于恒温箱内培养，定时检测鸡胚状态及死亡情况，统计各个菌株的鸡胚致死率，以此进行比较判定。
本发明所述的方法可用于比较山羊支原体山羊肺炎亚种菌株毒力，其具体做法是：
(1)spf鸡胚准备：准备7～8日龄的健康spf鸡胚，要求鸡胚发育良好、血管清晰、活力旺盛，弃去无精蛋、死胚及弱胚。
(2)菌液准备：复苏各待比较分析的山羊支原体山羊肺炎亚种菌株，37℃恒温培养箱培养，待培养基的颜色变黄(或ph值降至6.8及以下时)，新鲜菌液8000rpm离心15min，用生理盐水重悬，调整活菌滴度107ccu/ml。
(3)鸡胚的接种与观测：将制备好的山羊支原体山羊肺炎亚种菌液接种鸡胚卵黄囊，每个菌株接种10枚spf鸡胚，0.2ml/枚。阴性对照组鸡胚卵黄囊接种生理盐水，0.2ml/枚，10枚；空白对照组鸡胚未做任何处理，10枚；接种后，孵化箱继续培养至鸡胚21日龄，每天观察鸡胚1次，观察鸡胚状态、死亡情况并记录。
(4)统计分析与结果判定：统计每个菌株的鸡胚致死率并进行比较后判定。本发明的方法可在山羊支原体山羊肺炎亚种疫苗筛选或制备中的应用。本发明方法也可在山羊支原体山羊肺炎亚种毒力基因挖掘和鉴定研究中的应用。
本发明的有益效果为：本发明的方法具有操作简单、成本低、无需复杂动物饲养条件、实验动物易得、耗时短、重复性好等优点，大大减少动物试验工作量，避免了现有技术实验动物山羊存在价格较为昂贵、个体差异较大且饲养要求较高、试验操作复杂、试验周期长、工作量大等不足。因此，本方法可用于区分不同山羊支原体山羊肺炎亚种分离株的毒力，也可用于在疫苗研发中筛选毒株，以及山羊支原体山羊肺炎亚种毒力基因挖掘和鉴定研究。
具体实施方式
实施例1：
本发明以下结合实施例解说。
本发明的比较山羊支原体山羊肺炎亚种菌株毒力的方法，步骤如下：
(1)spf鸡胚准备：准备7～8日龄的健康spf鸡胚，spf种蛋购自山东昊泰实验动物繁育有限公司，于孵化箱孵化(温度37.0～37.5℃，湿度50％)。挑取发育良好、血管清晰、活力旺盛的鸡胚用于接种，弃去无精蛋、死胚及弱胚。
(2)山羊支原体山羊肺炎亚种菌液准备：复苏山羊支原体山羊肺炎亚种f38株(英国典型菌种保藏中心nctc，编号nctc10192)、m1801菌株(中国农业科学院兰州兽医研究所保存)，分别接种改良thiaucourt’s培养基(mtb培养基)，37℃恒温培养箱培养，待培养基的颜色变黄(或ph值降至6.8及以下时)，新鲜菌液8000rpm离心15min，用生理盐水重悬，调整活菌滴度为107ccu/ml。
(3)鸡胚的接种与观测，统计结果判定：将等浓度的制备好的山羊支原体山羊肺炎亚种菌液接种鸡胚卵黄囊，每个菌株接种10枚spf鸡胚，0.2ml/枚，同时设阴性对照组(接种生理盐水，0.2ml/枚，10枚)和空白对照组(未做任何处理，10枚)，接种后，孵化箱继续孵化，每天观察鸡胚，观察鸡胚存活状态，是否有血管游离或间隙模糊，观察鸡胚死亡情况并记录。阴性对照和空白对照鸡胚均无死亡。统计每个菌株的鸡胚致死率并进行比较。剖检死亡鸡胚并观察，死亡鸡胚主要表现为充血出血，阴性对照组和空白对照组未出现明显病变。收集死亡鸡胚尿囊液，接种改良thiaucourt's培养基，通过观察培养基颜色变化确定支原体生长情况；对死亡鸡胚尿囊液进行山羊支原体山羊肺炎亚种pcr鉴定。
山羊支原体山羊肺炎亚种pcr鉴定方法：
seqidno.1上游引物：5’-atcatttttaatcccttcaag-3’，
seqidno.2下游引物/5’-tactatgagtaattataatatatgcaa-3’；
pcr体系：pcrmix12.5μl、ddh2o8.5μl、上游引物/下游引物各1μl、尿囊液dna2μl；pcr反应条件：95℃预变性5min，(95℃30s，47℃30s，72℃25s)，35个循环，72℃10min，4℃保存。pcr扩增目的片段316bp。
结果见表1：
可以看出，山羊支原体山羊肺炎亚种f38株鸡胚死亡时间在7d以内，鸡胚致死率为30％(3/10)；而接种m1801株的鸡胚在接种4d后全部死亡，鸡胚致死率为100％(10/10)。山羊支原体山羊肺炎亚种m1801株鸡胚致死率明显高于f38株。死亡鸡胚尿囊液接种改良thiaucourt's培养基，颜色均变黄；死亡鸡胚尿囊液进行pcr鉴定，均可检测到山羊支原体山羊肺炎亚种病原。结果表明，山羊支原体山羊肺炎亚种可感染致死鸡胚；从鸡胚致死结果看，山羊支原体山羊肺炎亚种m1801株的毒力强于f38株，这与实验动物山羊毒力观测结果一致。本发明的方法具有操作简单、成本低、无需复杂动物饲养条件、实验动物更易得、耗时短、重复性好、工作量小等优点。
表1
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>一种比较山羊支原体山羊肺炎亚种菌株毒力的方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列上游引物(pr)
<400>1
atcatttttaatcccttcaag21
<210>2
<211>27
<212>dna
<213>人工序列下游引物(pf)
<400>2
tactatgagtaattataatatatgcaa27