一种抗幽门螺旋杆菌活性的聚酮化合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于抗幽门螺旋杆菌活性的聚酮化合物技术领域。

背景技术：

幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori)是一种能长期定植于胃粘膜的微需氧、螺旋状的革兰氏阴性细菌，其感染率已达到全球人口的50％以上，中国也是一个感染率较高的国家，据统计感染率为40-90％。幽门螺旋杆菌是慢性胃炎，链球菌疾病，胃癌和粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的发病机制中重要致病因子。世界卫生组织/国际癌症研究机构已将幽门螺旋杆菌列为人类ⅰ类致癌原。因此研发高效、低毒的幽门螺旋杆菌药物迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明的第一目的是提供一种抗幽门螺旋杆菌活性的化合物，其结构式如式ⅰ所示：

本发明的第二目的是提供一株木贼镰刀菌(fusariumequiseti)菌株shsl21，其已于2019年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏中心登记入册编号为cgmccno.18550。

本发明的第三目的是提供一种化合物的制备方法，包括如下步骤：

活化菌株shsl21；

固体发酵菌株shsl21；

用乙酸乙酯浸提固体发酵物得粗提物；

用减压硅胶柱层析得到洗脱液；

用反向硅胶色谱分离得反向洗脱液；

用凝胶色谱分离得凝胶洗脱液；

用反相hplc分离得hplc洗脱液。

本发明提供的菌株和化合物，具有较好的抗幽门螺旋杆菌(h.pyloribhks159)活性，适宜于抗幽门螺旋杆菌先导化合物研究或制备抗幽门螺旋杆菌药物。

附图说明

图1为化合物的¹h核磁共振图谱。

图2为化合物的¹³c核磁共振图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置3次重复实验，结果取平均值。

实施例1

菌株shsl21的分离和鉴定

一、菌株shsl21的采集与分离

2015年从广西防城港市北仑河口桐花树的花上分离到一株菌，命名为菌株shsl21。

菌株shsl21为一种红树林内生真菌。

二、菌株shsl21的鉴定

1、分子鉴定

菌株shsl21的18sribosomalrna部分序列见序列表的序列1，如genbankaccessionno.mn443741的序列相似性最高，相似性为99％。

根据以上鉴定结果，菌株shsl21属于木贼镰刀菌(fusariumequiseti)。

三、菌株shsl21的保藏

菌株shsl21，属于木贼镰刀菌(fusariumequiseti)，已于2019年9月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为cgmccno.18550。

实施例2

化合物的制备

pda培养基：将马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g和水1000ml混匀，121℃高压蒸汽灭菌30min。

种子培养基：将葡萄糖4.0g、麦芽汁10.0g、酵母提取物4.0g和水1000ml混匀，将ph调节到6.5，每个250ml三角瓶中加入50ml并121℃灭菌30min。

大米培养基：将80g大米和120ml水加入500ml三角瓶中，浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌30min。

1菌株shsl21的固体发酵

1.1菌株shsl21的活化

将菌株shsl21在pda平板上培养5d，待菌落长满平板后，将5个1cm²大小的菌块连同培养基接种到含有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，在摇床上培养(25℃、200rpm)7d后作为种子培养液。

1.2菌株shsl21的固体发酵

将5ml种子培养液接种于装有大米培养基的三角瓶中，25℃无菌培养30d。

2化合物的提取

2.1在步骤1.2得到的三角瓶(含固体发酵物)中加入1.0l乙酸乙酯，室温浸提24h，收集第一次上清液。

2.2在步骤2.1的三角瓶中再次加入1.0l乙酸乙酯，室温浸提24h，收集第二次上清液。

2.3在步骤2.2的三角瓶中再次加入1.0l乙酸乙酯，室温浸提24h，收集第三次上清液。

2.4在步骤2.3的三角瓶中再次加入1.0l乙酸乙酯，室温浸提24h，收集第四次上清液。

2.5将步骤2.1的第一次上清液、步骤2.2的第二次上清液、步骤2.3的第三次上清液和步骤2.4的第四次上清液合并，减压蒸馏至干燥，得到14.0g粗提物。

3、化合物的分离纯化

3.1减压硅胶柱层析得到洗脱液

将步骤2.5得到的粗提物进行减压硅胶柱层析。

柱子型号为：8×30cm；

填充物为：薄层层析硅胶h和柱层层析硅胶(精制型)；

洗脱过程为：

(1)依次用1000ml洗脱液a(由6体积份石油醚和4体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱；

(2)1000ml洗脱液b(由5体积份石油醚和5体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱；

(3)1000ml洗脱液c(由4体积份石油醚和6体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱；

(4)1000ml洗脱液d(由3体积份石油醚和7体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱；

(5)1000ml洗脱液e(由2体积份石油醚和8体积份乙酸乙酯组成)进行洗脱；

流速为50ml/min，收集洗脱液a-e的过柱后洗脱液。

3.2将层析洗脱液进行反向硅胶色谱分离得反向洗脱液

所述反向硅胶色谱分离的参数具体如下：

柱子型号为：3×60cm；

填充物为：c18；

流动相为500ml洗脱液(由6体积份甲醇和4体积份水组成)，流速为0.5ml/min；

收集过柱后反向洗脱液。

3.3将反向洗脱液进行凝胶色谱分离得凝胶洗脱液

所述凝胶色谱分离的参数具体如下：

柱子型号为：3×60cm；

填充物为：sephadexlh-20；

流动相为百分含量为100％甲醇有机溶剂，流速为0.5ml/min；

收集保留体积为80-100ml的过柱后得凝胶洗脱液。

3.4将凝胶洗脱液进行反相hplc分离得hplc洗脱液

所述反相hplc分离的参数具体如下：

柱子型号为：kramosilc18柱(10μm；10×250mm)；

洗脱过程为：用体积百分含量为57-59％的甲醇水溶液洗脱30min，流速为2ml/min。

收集保留时间为20.6-21.0min(峰值的保留时间tr为20.8min)的过柱后洗脱液。

3.5将步骤3.4收集的hplc洗脱液减压蒸馏至干燥，得到5.5mg产物。

4化合物的确认

将步骤3.5的产物进行有机质谱和核磁共振谱分析。

产物的表征数据如下：

黄色针状；

分子式：c14h20o6；分子量：284；

¹h核磁共振图谱见图1，¹³c核磁共振图谱见图2；

依据以上表征数据上述化合物的理化数据和图谱，步骤3.5的产物为式(i)所示的化合物。

实施例3

式(i)所示化合物对抗幽门螺旋杆菌(h.pyloribhks159)的抑制作用

采用微量稀释法检测式(i)所示化合物对抗幽门螺旋杆菌(h.pyloribhks159)的最低抑菌浓度(mic，100μl体系)。

将甲硝唑(aladdin公司)作为化合物的阳性对照，进行平行实验。

本实施例所用细菌为：抗幽门螺旋杆菌(h.pyloribhks159)。

实验具体步骤如下：

1.制备mic板

第1孔先加脑心浸出液培养基(bhi)(具体成分包括：蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉、氯化钠、葡萄糖、磷酸氢二钠，ph＝7.4)173.6μl，再加6.4μl待测化合物，倍比稀释至第7孔；第8孔不加，保留90μl培养基，作为加菌不加待测化合物对照。

2.制备菌液

取固体平板上对数期生长的抗幽门螺旋杆菌(h.pyloribhks159)，用bhi培养基制作成菌悬液，调整浓度od600为0.3(1×10⁸cfu/ml)，稀释10倍，为1×10⁷cfu/ml，备用。

3.接种菌液

取10μl加至第1-8孔(每孔菌液浓度约为1.0×10⁶cfu/ml)。培养72h判断结果。第1孔至第7孔化合物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1μg/ml。

4.结果判断

以在小孔内完全抑制细菌生长的最低式(i)所示化合物浓度为mic。

当阳性对照孔第8孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。

当在微量稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高式(i)所示化合物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。

式(i)所示化合物对抗幽门螺旋杆菌(h.pyloribhks159)的抑菌作用需重复3次试验。

式(i)所示化合物对抗幽门螺旋杆菌(h.pyloribhks159)的mic值为8μg/ml。

甲硝唑对抗幽门螺旋杆菌(h.pyloribhks159)的mic值为大于16μg/ml。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种抗幽门螺旋杆菌活性的聚酮化合物及其制备方法和应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>481

<212>dna

<213>镰刀菌(fusariumequiseti)

<400>1

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