一种鉴别龙血树品种的PCR方法与流程

本发明涉及基因克隆与分子鉴定技术领域，更具体地说是涉及一种鉴别龙血树品种的pcr方法。

背景技术：

百合科(liliaceae)龙血树属(dracaenavand.exl.)植物主要分布于亚洲和非洲的热带和亚热带地区，其寿命可达数千年。根据《中国植物志》记载全球约有40余种龙血树，在中国云南、广东、广西、海南和台湾等地分布有8种，分别为剑叶龙血树[d.cochinchinensis(lour)s.c.chen]、海南龙血树[d.cambodiana]、长花龙血树[d.angustifoliaroxbv]、细枝龙血树[d.marginata]、矮龙血树[d.thalioides]、深脉龙血树[d.impressivenia]、河口龙血树[d.hokouensis]和勐腊龙血树[d.menglaensis]。

利用剑叶龙血树和海南龙血树分泌的红色树脂可提炼一种传统名贵中药-龙血竭(dragon’sblood)，现代药理研究表明，龙血竭具有抗炎、镇痛、抗氧化、增强免疫力、促进血液循环、调节机体新陈代谢等多种活性，其良好的临床疗效引起了国内外学者的关注和重视，李时珍在《本草纲目》中誉其为“活血圣药”；岩棕分泌的树脂亦可作为提炼龙血竭的原料。野生龙血树需生长数十年才能用来生产龙血竭，是国家重点保护的濒危植物；国内现有的龙血竭原材料主要来自老挝、越南、柬埔寨等东南亚国家的野生龙血树，但是其基源植物种类不易分辨。

因此，如何提供一种鉴别龙血树树种的方法，从而鉴别龙血竭的直接来源是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明根据龙血树pal基因序列设计同源克隆引物，克隆剑叶龙血树、海南龙血树和岩棕等3种龙血竭基源植物的pal基因序列，分析3种龙血树pal的差异，发现了3种龙血树的分子鉴定方法，为不同来源的龙血竭原料鉴定提供了参考。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鉴别龙血树品种的pcr方法，包括下述步骤：

1)提取基因组dna和总rna；分别对3种龙血树的基因组提取dna和rna；

2)反转录：将步骤1)得到的总rna反转录得到cdna；

3)基因克隆：利用pal-f和pal-r引物对步骤1)得到的3种基因组dna和cdna进行扩增，电泳并回收目的基因；

4)转化、测序：将步骤3)得到的目的基因转化至大肠杆菌dh5α，将阳性克隆进行测序；

5)比对：根据测序结果，比对三种pal基因序列的差异；

其中，pal-f：5’-gcctaaacaagacaggtacgcc-3’，如seqidno.1所示；

pal-r:5’-gcaagggtcgtcaatgtaggtg-3’，如seqidno.2所示。

作为本发明优选的技术方案，步骤1)中，以plantgenomicdnakit试剂盒提取剑叶龙血树、海南龙血树和岩棕的基因组dna。

作为本发明优选的技术方案，步骤1)中，以rnapreppureplantkit试剂盒提取剑叶龙血树、海南龙血树和岩棕的茎干中的总rna。

作为本发明优选的技术方案，步骤2)中，以recertacidfirststandcdnasynthssiskit试剂盒合成cdna。

作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，扩增程序为：

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种鉴定龙血树品种的方法，植物pal基因在进化上相对保守，cds长度一般为2100bp左右，包含1个内含子和2个外显子，不同物种间pal蛋白的氨基酸序列存在丰富变异，但整体上保守性极高，相似度可达80％以上。龙血竭原料为红色块状物质，来自3种龙血树属植物，无法通过外观鉴定其基源植物，pal基因的这种变异性和保守性为同属植物不同种的鉴定提供了潜在可能。根据龙血树pal基因序列(ncbi登录号：jn377585，该片段768bp，是pal基因的部分序列)设计同源克隆引物，克隆剑叶龙血树、海南龙血树和岩棕等3种龙血竭基源植物的pal基因序列，分析3种龙血树pal的差异，发现了3种龙血树的分子鉴定方法，为不同来源的龙血竭原料鉴定提供参考。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的对三种龙血树dna和cdna进行扩增凝胶电泳图，其中，a代表dna扩增的电泳图，b代表cdna扩增的电泳图；a和b中，1均代表剑叶龙血树基因电泳条带，2代表海南龙血树基因电泳条带，3代表岩棕基因电泳条带；

图2附图为本发明提供的三种龙血树pal基因序列比对结果图，其中，jy-pal代表剑叶龙血树pal基因序列，hn-pal代表海南龙血树pal基因序列，az-pal代表岩棕pal基因序列；

图3附图为根据三种龙血树基因序列推导出来的氨基酸残基结果图；

图4附图为对三种龙血树pal基因进行扩增的凝胶电泳图；

图5附图为引物的灵敏度试验结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

使用植物基因组dna提取试剂盒plantgenomicdnakit(tiangen)提取剑叶龙血树、海南龙血树和岩棕的基因组dna；采用植物总rna快速提取试剂盒rnapreppureplantkit(tiangen)提取3种龙血树茎干的总rna；利用微量紫外检测仪nanodroponec(thermo)检测dna和rna样品浓度。采用反转录试剂盒revertaidfirststrandcdnasynthesiskit(thermo)合成cdna。

实施例2龙血树pal基因的克隆

根据在ncbi数据库中搜索得到的登录号为jn377585的龙血树pal序列，利用primerpremier5.0生物软件设计同源克隆引物：pal-f：5’-gcctaaacaagacaggtacgcc-3’，如seqidno.1所示；pal-r:5’-gcaagggtcgtcaatgtaggtg-3’，如seqidno.2所示。使用高保真dna聚合酶(thermo-fisnerscientific)在pcr扩增仪(longgenea600)上扩增3种龙血树pal基因。pcr扩增程序为：98℃2min；98℃15s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。扩增完成后进行1.0％琼脂糖凝胶电泳分离检测，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒tiangelmidipurificationkit(tiangen)回收目的条带，结果见图1；由图1可知：利用同源克隆引物进行pcr扩增，在剑叶龙血树、海南龙血树和岩棕的基因组dna和cdna中均扩增到一条约700bp条带，条带清晰且无杂带，说明设计的引物具有高度特异性。该引物在3种不同龙血树中扩增的电泳条带大小一致，推测该pal基因片段在龙血树属植物中具一定保守性。基因组dna和cdna扩增条带一致，暗示在该段pal基因序列中无内含子序列。

将回收的目的基因连接至pgem-teasy(promegacorporation)载体上，转化大肠杆菌dh5α，过程为：

1.事先将精确水浴锅打开并将温度调节至42℃，将连接产物加入到100μl感受态细胞中，快速充分混匀，然后立即置于冰上冰浴30min。

2.冰浴完成后置于精确水浴锅中42℃热激1.5min，然后立即冰上放置2min，加入200μl预热至37℃的lb液体培养基。

3.在振荡培养箱中37℃低速(100r/min)振荡培养40min。

4.在每个lb固体培养基平板(加入相应的抗生素，氨苄青霉素50μg/ml)加入200μl菌液，0.1miptg4μl和20ml的x-gal40μl均匀涂于平板上。

5.37℃培养箱中过夜培养12-16h。

挑选阳性克隆送至华大基因测序；海南龙血树的测序结果如seqidno.3所示；剑叶龙血树的测序结果如seqidno.4所示；岩棕的测序结果如seqidno.5所示。

利用ncbi数据库在线比对表明均为pal基因序列。利用生物软件分析发现，这3个pal基因片段均编码239个氨基酸残基，同时在该段序列中未发现内含子序列。利用dnaman软件对龙血树pal基因序列进行比对，分析发现4个龙血树pal基因高度一致，达99.69％，碱基序列仅存在7处突变，分别为104bp处g/a替换、222bp处c/g替换、408bp处t/c替换、589bp处g/a替换、598bp处g/t替换、633bp处g/t替换、661bp处c/g替换，如图2所示。

通过推导的氨基酸序列比对发现，仅222bp处c/g替换和408bp处t/c替换因简并密码子而并未因为氨基酸残基变化，其它5处碱基替换均导致氨基酸残基改变，结果见图3；

实施例33种龙血竭基源植物分子鉴定

由实施例2可知，3种龙血树pal片段存在5处碱基突变(图2)，为弄清这些突变在同种龙血树中是否为稳定遗传，每种龙血树随机选取10株，利用引物pal-f和pal-r进行pal基因克隆并测序(如图4)。序列比较发现，剑叶龙血树、海南龙血树和岩棕10个重复pal基因序列与上述结果完全相同，说明这些碱基突变为稳定遗传。利用该结果可以对3种龙血竭基源植物进行分子鉴定(表1)，利用特异引物pal-f和pal-r进行pcr扩增并测序，在表1所示碱基位置为gcggg是剑叶龙血树、ctggc是海南龙血树、gtttg是岩棕。

表1龙血树分子鉴定

实施例4灵敏度试验

使用特异引物pal-f：5’-gcctaaacaagacaggtacgcc-3’和pal-r:5’-gcaagggtcgtcaatgtaggtg-3’，使用高保真dna聚合酶(thermo-fisnerscientific)在pcr扩增仪(longgenea600)上扩增龙血树pal基因，dna浓度梯度为0ng/μl、0.05ng/μl、0.1ng/μl、0.15ng/μl、0.2ng/μl、0.25ng/μl、0.5ng/μl、1ng/μl、2ng/μl、3ng/μl、4ng/μl、5ng/μl、7.5ng/μl、10ng/μl。pcr扩增程序为：98℃2min；98℃15s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。扩增完成后进行1.0％琼脂糖凝胶电泳分离检测，结果见图5。

由图5可知，本申请的引物不仅特异性良好，而且，灵敏度高。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>中国医学科学院药用植物研究所云南分所

<120>一种鉴别龙血树品种的方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcctaaacaagacaggtacgcc22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcaagggtcgtcaatgtaggtg22

<210>3

<211>658

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<210>4

<211>778

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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