识别TTTV、TTV双PAM位点的Cas12a蛋白、植物基因组定向编辑载体及方法与流程

本发明属于基因工程领域，涉及识别tttv、ttv双pam位点的cas12a蛋白、植物基因组crispr-cas12a定向编辑载体及植物基因组编辑方法。

背景技术：

基因组定向编辑技术是生物学研究的前沿与热点领域，通过对基因组特定区域进行缺失、置换、敲入或核苷酸修正等方式来实现基因组精确定向编辑。基因组编辑技术主要有：锌指核酸酶(zincfingernucleases,zfn)，它实现了基因的靶向操作，并得到了广泛的应用。但锌指核酸酶组装针对特定dna序列的zfns，所需的工作量大，花费也十分昂贵，而且特异性和效率不高；类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，talen)，相比锌指核酸酶，它设计更简单、特异性更高、效果更为明显。其缺点是模块组装过程繁琐，成本很高；2013年初发展起来的crispr-cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crispr-associated9)技术(sander&joung)。crispr-cas9系统因其设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势而被广泛应用于动、植物及微生物基因功能解析、新种质创制及遗传改良中。尽管crispr-cas9被认为是遗传研究领域的革命性技术，但研究者依然没有放弃crispr技术的改进及拓展工作。野生型spcas9核酸酶介导的序列特异dna剪切需要识别5’-ngg-3’pam位点，使得spcas9核酸酶在目标基因组中的有效编辑区间受到明显限制。同时，spcas9基因组编辑系统存在潜在的非特异剪切活性即“脱靶”，会对编辑对象产生不确定的生物学效应。为此，研究人员从其它不同细菌中获得cas9核酸酶用于基因编辑工具，如sacas9、stcas9、nmcas9(cebrian-serrano&davies,2017)。同时，研究者开发出识别不同pam序列的cas9变异体xcas9-ng、spcas9-ng、vqr-cas9(ngapam)、eqr-cas9(ngagpam)、vrer-cas9(ngcgpam)、sakkh-cas9(nnnrrtpam)。随后研究者开发出了能在植物中应用的cas9变异体。

继crispr-cas9系统之后，研究者发展了新的ⅱ型crispr-cas系统—crispr-cas12a(crispr-cpf1)系统，与crispr-cas9不同，因其具备“t/a”富集区的pam识别位点、向导rna为结构简单的单一crrna分子(且可自剪切加工成熟)、产生粘性末端、删除片断比较大(大多为6-13bp)等特性或优点，被认为可以实现更简便、更精准、更多元的基因组定向遗传修饰。目前所应用的crispr-cas12a主要有lbcas12a、ascas12a和fncas12a。已有研究表明：在动物细胞中，在“tttv”4碱基pam识别位点，lbcas12a的编辑活性较低，ascas12a和fncas12a在“tttv”4碱基pam位点的编辑活性较高，但在“ttv”3碱基pam位点，lbcas12a和ascas12a无活性，fncas12a的活性很低。在植物中报道有lbcas12a、fncas12a和ascas12a有编辑活性。lbcas12a在水稻基因组中具有较高活性，但lbcas12a核酸酶需要严格识别“tttv”4碱基pam位点，限制了其在目标基因组中crrna设计的有效范围，且在除水稻外的其他植物中的编辑活性较低甚至无活性。fncas12a主要pam识别位点为4碱基的“tttv”，在3碱基的“ttv”的活性较低甚至在某些位点无编辑活性。鉴于目前crispr-cas12a来源缺乏多样性，且易产生脱靶效应，在ttvpam位点的编辑效率不高。所以筛选、开发可以同时识别tttvpam和ttvpam位点的高效新crispr-cas12a植物基因组定向编辑系统具有重要意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是建立能够高效识别tttv和ttv双pam位点的新的crispr-cas12a植物基因组定向编辑技术。

本发明解决上述技术问题的技术手段是提供了一种新的具有核酸酶cas12a蛋白。该核酸酶cas12a蛋白氨基酸序列为seqidno.1所示。

本发明还提供了上述的cas12a蛋白的编码基因。

进一步的，上述的cas12a蛋白的编码基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明还提供了含有上述的编码基因的表达载体。

其中，上述的表达载体含有cas12a蛋白表达单元，结构为zmubi1-nls-morcas12a-nls-athsp。

其中，所述的zmubi1为玉米ubi1启动子。该玉米ubi1启动子的核苷酸序列为seqidno.3中1-2003所示。所述的nls为核定位序列。左侧nls的编码核苷酸序列为seqidno.3中2004-2054所示，右侧nls的编码核苷酸序列为seqidno.3中5808-5858所示。所述的athsp为拟南芥hsp终止子。该athsp编码核苷酸序列为seqidno.3中5873-6122所示。

进一步的，所述的表达载体中的cas12a蛋白表达单元核苷酸序列如seqidno.3所示。

其中，上述的表达载体含有crrna克隆及转录单元，可共表达cas12a蛋白和crrna。

进一步的，所述grna克隆及转录单元的结构为osubi1-hhribozyme-crrnascaffold-ccdb-hdvribozyme-pinii。

其中，所述的osubi1为水稻osubi1启动子，核苷酸序列为seqidno.4中1-1539所示。所述的hhribozyme为hh核酶，核苷酸序列为seqidno.4中1540-1582所示，所述的crrnascaffold为crrna骨架，序列可为seqidno.4中或seqidno.5中的1583-1603所示；所述的ccdb为大肠杆菌致死基因，编码核苷酸序列为seqidno.4中1611-2235所示。所述的athsp为拟南芥hsp终止子，核苷酸序列为seqidno.4中2319-2627所示。所述的hdvribozyme为hdv核酶，核苷酸序列为seqidno.4中2243-2310所示。所述的pinii为pinii基因终止子，核苷酸序列为seqidno.4中2319-2627所示。

更进一步的，所述的表达载体中所述的crrna克隆及转录单元的核苷酸序列为seqidno.4或者为seqidno.5所述。

其中，上述的表达载体还含有潮霉素抗性筛选基因。

本发明还提供了上述的表达载体在构建crispr-cas12a基因编辑系统中的用途。

本发明也提供了一种crispr-cas12a基因编辑的方法。该方法使用上述的表达载体为crispr-cas12a基因编辑系统提供cas12a蛋白活性。

进一步的，该方法包括以下步骤：

a、骨架载体构建：上述的表达载体作为crispr-cas12a骨架载体；

b、定向基因编辑载体构建：针对待编辑的目标基因设计基因编辑位点及crrna，人工合成crrna的引物对，将引物对退火形成带粘性末端的双链dna，将双链dna替换crispr-cas12a骨架载体中的ccdb元件，获得定向编辑表达载体；

c、定向基因编辑及检测：使用步骤b得到定向编辑表达载体转化原生质体，检测原生质体的基因定向编辑情况，将成功定向编辑的原生质体培养得到定向基因编辑植株；

或者；

使用步骤b得到定向编辑表达载体转入根癌农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将上述载体导入目标植物，获得定向基因编辑植株。

进一步的，上述方法的步骤b中可以以下具体步骤进行：

a)、明确待编辑的植物基因组的目标dna区域，分析其中的具有本发明cas12a核酸酶蛋白能识别的pam位点特征区域，选择pam结构3’端相邻的23bpdna序列作为特异性修饰靶序列；所述的pam位点特征5’-ttv-3’和/或5’-tttv-3’,v表示a、g、c中的任一种；

b)、按照选定的特异性修饰靶序列，分别合成具有5’-agat-nx-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-ggcc-nx-3’特征的反向寡核苷酸链，n表示a、g、c、t中的任一种，x为整数，且18≤x≤25，优选x＝23，其中所述正向寡核苷酸链中的nx和反向寡核苷酸中的nx具有反向互补特征；通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；

c)、将双链dna替换crispr-cas12a骨架载体中的ccdb元件，获得定向编辑表达载体。

本发明的有益效果在于：本发明得到了一种新的cas12a蛋白，该cas12a蛋白具有识别tttv、ttv双pam位点的能力。经过cas12a蛋白基因密码子优化，得到了适用于植物crispr-cas12a基因编辑的蛋白编码基因。在此基础上，还提供了一种新的高效的crispr-cas12a植物基因组定向修饰骨架载体，可以针对植物进行简单、快捷、高效的基因组定向修饰。实验表明，本发明crispr-cas12a骨架载体不仅在检测的所有tttvpam位点有高效的编辑效率，而且在检测的所有ttvpam位点也均有高效的编辑活性，是一种新的具有双pam位点高效编辑能力的系统，具有很好的应用前景。

附图说明

图1morcas12a的同源基因克隆电泳图。m表示dna分子marker，1泳道表示样品pcr产物电泳，箭头表示pcr扩增产物

图2本发明实施例使用的morcas12a植物基因组定向修饰骨架载体的结构示意图。

a.由pzmubii启动的nls-morcas12a-nls表达单元和posubii启动的四种crrna-scafford的骨架载体:morcas12a-crrna-scafford1,morcas12a-crrna-scafford2,morcas12a-crrna-scafford3,morcas12a-crrna-scafford4的统一结构图；

b.由pzmubii启动的nls-morcas12a-nls表达单元和posu6启动的四种crrna-scafford的骨架载体:morcas12a-crrna-scafford5,morcas12a-crrna-scafford6,morcas12a-crrna-scafford7,morcas12a-crrna-scafford8的统一结构图。

图3在原生质体中体现的，morcas12对三个tttvpam位点的编辑活性实验结果分析。

图4在原生质体中体现的，morcas12对三个ttvpam位点的编辑活性实验结果分析。

具体实施方式

为了获得性能更优的，能满足本领域多种需求的crispr-cas12a系统，发明人在本申请之前进行了大量新cas12a的寻找和验证工作。在含有人体来源的微生物样本中，通过同源基因克隆的方式，获得了一些可能的cas12编码基因，并进行了初步的功能验证。其中，发现了一个新的基因，其编码的蛋白具有典型的crispr-cas12a蛋白的活性。更出人意料的是，该基因所编码的蛋白不仅仅对tttvpam位点有高效的编辑效率，而且对所有ttvpam位点也有高效的编辑活性。经过进一步的研究，确认其与莫拉氏菌细菌moraxellabovoculi.crispcas12a蛋白序列(ncbi中编号为：wp_046697655.1)相似度为99.84％，与moraxellacapraecrispcas12a蛋白序列(ncbi中编号为：wp_036388671.1)相似度为95.57％，与moraxellaboviscrispcas12a蛋白序列(ncbi中编号为：wp_115369192.1)相似度为95.18％。故将此crispr-cas12a基因命名为moraxellaspcrispr-cas12a(简称morcrispr-cas12a)。

进一步的，本发明根据植物的基因组结构及表达特性，构建基于该morcrispr-cas12a基因的植物基因组定向修饰骨架载体，以期实现基于morcrispr-cas12a的基因编辑系统在植物基因组定向修饰中的有效应用。

本发明提供的crispr-cas12a作为基因编辑工具的骨架载体主要由两部分组成，一部分是表达起切割dna作用的cas12a蛋白，另一部分表达起向导即定向作用的crrna。决定编辑能力的主要有两大主要因素：一是cas12a蛋白切割能力及其在细胞内表达量；二是crrnascaffold及其表达量。

首先，为确保morcas12a蛋白表达量。本发明参考文献(tangx等,.acrispr-cpf1systemforefficientgenomeeditingandtranscriptionalrepressioninplants.natplants，2017,3:17103.)中公开的玉米ubi1启动子能高效启动crispr-cpf1的表达，实现基因编辑的记载。构建了zmubi1启动子启动的morcas12核酸酶蛋白表达单元

(zmubi1-nls-morcas12a-nls-athsp)。首先根据植物基因密码子特性对morcrispr-cas12基因进行密码子优化，然后合成5’端和3’端含nls(核定位序列)编码序列的morcas12a核酸酶蛋白(即nls-morcas12a-nls)，其编码核苷酸序列如seqidno.3中2004-3858所示。然后通过gibsonassembly技术将nls-morcas12a-nls单元、来自玉米的组成型启动子zmubi1元件(dna序列如seqidno.3中1-2003所示)和拟南芥athsp终止子元件(dna序列如seqidno.3中5873-6122所示)组装成morcas12核酸酶蛋白表达单元。

其次，crrna转录表达克隆单元中的crrnascaffold也有可能对编辑效果起重要作用。本发明参考文献(tangx等,.acrispr-cpf1systemforefficientgenomeeditingandtranscriptionalrepressioninplants.natplants，2017,3:17103.)中关于玉米ubi1启动子能启动crrna的表达的记载。采用水稻ubi1启动子启动crrna转录。因crrnascaffold结构对编辑活性具有重要影响，故本发明选择了四种不同的crrnascaffold：scaffold1来源morcas12a核酸酶；scaffold2即4n96来源文献(tengfet.al.enhancedmammaliangenomeeditingbynewcas12aorthologswithoptimizedcrrnascaffolds,genomebiol.2019feb5；20(1):15；scaffold3来源lbcas12a核酸酶；scaffold4来源fncas12a核酸酶。分别组装得到crrna转录表达克隆单元，其结构为osubi1-hhribozyme-crrnascaffold-ccdb-hdvribozyme-pinii)。

在本发明的实施例部分中列举了以下的具体构建方式：通过gibsonassembly技术将水稻osubi1启动子(核苷酸序列如seqidno.4中1-1539所示)、合成序列hhribozyme-crrnascaffold-ccdb-hdvribozyme单元(核苷酸序列如seqidno.4或seqidno.5中1540-2318所示)和pinii终止子(核苷酸序列如seqidno.4中2319-2627所示)组装成crrna转录表达克隆单元osubi1-hhribozyme-crrnascaffold-ccdb-hdvribozyme-pinii。

其中，hhribozyme-crrnascaffold-ccdb-hdvribozyme单元还设计有bsai-ccdb-bsai序列，具有如seqidno.4中1611-2235所示的核苷酸序列。其作用是作为多克隆位点以对morcrispr-cas12a定向修饰骨架载体进行酶切，以便克隆目标向导crrna特异性靶序列(protospacer)至骨架载体上。

同时，本发明的实施例还根据文献(endoa等,efficienttargetedmutagenesisofriceandtobaccogenomesusingcpf1fromfrancisellanovicida.scirep,2016,6:38169)报道osu6启动子能够有效启动crrna，重新设计并构建包含morcas12a核酸酶蛋白表达单元zmubi1-nls-morcas12a-nls-athsp单元和osu6启动子启动crrna转录表达单元osu6-crrnascaffold-ccdb-ploy(t)的morcrispr-cas12a的定向编辑骨架载体。

具体构建过程如下：首先，准备如前所述的morcas12a核酸酶蛋白表达单元zmubi1-nls-morcas12a-nls-athsp。

其次，构建osu6启动子启动crrna转录表达单元osu6-crrnascaffold-ccdb-ploy(t)：通过gibsonassembly技术将水稻osu6启动子(序列参见已公布的骨架载体pzhy988)、合成四种不同的crrnascaffold单元(同前所述)组装成crrna转录表达克隆单元。。

上述的各个骨架载体中的bsai-ccdb-bsai序列，核苷酸序列如seqidno.4中1611-2235所示。ploy(t)为10个t。

最后，通过goldengate技术将上述新morcrispr-cas12a植物基因组定向功能单元即morcas12核酸酶蛋白表达单元和crrna转录表达克隆单元克隆入骨架载体ptrans_210d(序列如等，amultipurposetoolkittoenableadvancedgenomeengineeringinplants.plantcell,2017,29(6):1196-1217)，然后转化细菌感受态，单克隆pcr验证，提取重组质粒，sanger测序验证获得细菌(卡那霉素抗性)和植物(潮霉素抗性)双元表达的morcrispr-cas12a植物基因组定向编辑骨架载体。

使用本发明cas12a蛋白及crispr-cas12a植物基因组定向编辑骨架载体，结合本领域已经报到的具体基因组编辑方法，即可方便的在植物中进行针对tttvpam位点和/或ttvpam位点的定向基因组编辑。以下通过实施例的具体描述对本发明进行更进一步的说明。

实施例1morcrispr-cas12a的同源克隆

以含有人源性微生物的样品为模板，用简并引物进行pcr扩增，琼脂糖电泳显示(图1)：得到了大约4000bp(目标条带)、800bp和300bp的非特异性条带。将目的条带切胶回收，ta克隆，转化感受态细胞，挑取单菌落，pcr鉴定和测序，最终筛选得到一个新的crispr-cas12基因，具有典型的crispr-cas12a蛋白的活性。在ncbi中进行序列比对显示，它与莫拉氏菌细菌moraxellabovoculi.crispcas12a蛋白序列(ncbi中编号为：wp_046697655.1)相似度为99.84％，与moraxellacapraecrispcas12a蛋白序列(ncbi中编号为：wp_036388671.1)相似度为95.57％，与moraxellaboviscrispcas12a蛋白序列(ncbi中编号为：wp_115369192.1)相似度为95.18％。故将此crispr-cas12a基因命名为moraxellaspcrispr-cas12a(即morcrispr-cas12a)。

实施例2morcrispr-cas12a植物基因组定向修饰骨架载体的构建

1.采用不同模块组装的方式进行构建新morcrispr-cas12a基因编辑骨架载体。

首先，设计模块1(mod_a)为5’端和3’端含nls编码序列的morcas12核酸酶蛋白表达单元(zmubi1-nls-morcas12a-nls-athsp)，其中morcas12a经密码子优化后并交由生物公司合成，nls-morcas12a-nls序列如seqidno.3中2004-3858所示，然后通过gibsonassembly技术将nls-morcas12a-nls单元、来自玉米的组成型启动子zmubi1元件(核苷酸序列如seqidno.3中1-2003所示)和拟南芥athsp终止子元件(编码核苷酸序列为seqidno.3中5873-6122所示)组装成模块1。其次，设计模块2(mod_b)为crrna转录表达克隆单元osubi1-hhribozyme-crrnascaffold-ccdb-hdvribozyme-pinii。通过gibsonassembly技术将水稻osubi1启动子(核苷酸序列如seqidno.4中1-1539所示)、合成序列如核苷酸序列如seqidno.4或seqidno.5中1540-2318所示和pinii终止子(核苷酸序列如seqidno.4中2319-2627所示)组装成模块2。最后，通过goldengate方法将模块1，模块2组装进入ptrans_210d(序列如等，amultipurposetoolkittoenableadvancedgenomeengineeringinplants.plantcell,2017,29(6):1196-1217)。同理，分别将scaffold3(序列如seqidno.6所示)和scaffold4(序列如seqidno.7)所示组装进入表达单元。通过转化细菌感受态，单克隆pcr验证，提取重组质粒，sanger测序验证，最后获得新morcrispr-cas12a基因编辑骨架载体morcas12a-scaffold1,morcas12a-scaffold2,morcas12a-scaffold3,morcas12a-scaffold4(图2a)。

2.同时，根据文献(endoa,masafumim,kayah,tokis.efficienttargetedmutagenesisofriceandtobaccogenomesusingcpf1fromfrancisellanovicida.scirep.2016,6:38169)的方法，设计并构建包含morcas12a核酸酶蛋白表达单元(zmubi1-nls-morcas12a-nls-athsp单元(序列与模块1相同)和模块3(mod_c)osu6启动子启动crrna转录表达单元osu6-dr-crrnascaffold-ccdb-dr-ploy(t)。通过gibsonassembly技术将水稻osu6启动子(序列参见http://www.addgene.org/search/advanced/？q＝pzhy988)、合成如前所述的四种crrnascaffold核苷酸序列组装成crrna转录表达克隆单元。最后，通过goldengate方法将模块1，模块3组装进入ptrans_210d。通过转化细菌感受态，单克隆pcr验证，提取重组质粒，sanger测序验证，最后获得新morcrispr-cas12a基因编辑骨架载体morcas12a-scaffold5,morcas12a-scaffold6,morcas12a-scaffold7,morcas12a-scaffold8(图2b)。

实施例3基于morcrispr-cas12a系统的构建水稻内源基因定向修饰

1.水稻内源基因向导crrna设计

为了测试所构建的crispr-cas12a系统的编辑活性，扫描水稻基因组，得到pam位点分别为ttv，tttv的相同crrna位点(见表1)来设计crrna。依据设计的crrna位点核酸序列，人工合成对应的正、反向寡核苷酸链，具体序列如下(大写碱基序列代表所设计的位点特异性向导crrna位点；小写碱基序列代表与骨架载体互补的粘性末端)(见表1)

表1.crrna设计位点、序列

2.cas12a+crrna重组表达载体构建

分别将crrna01-f/r,crrna02-f/r,crrna03-f/r等比例混合，沸水浴10min，而后自然降温退火，形成具有粘性末端的双链dna，作为构建重组载体的插入片段。于200ulpcr管中加入不同crispr-cas12a植物基因组定向修饰骨架载体、粘末端插入片段、bsai内切酶、t4dna连接酶，在“37℃5min→16℃10min(15个循环)→37℃10min→80℃10min→4℃10min”进行酶切连接，取反应产物进行大肠杆菌转化。通过卡那霉素抗性筛选、菌落pcr及酶切鉴定阳性转化子，最终通过经测序验证得到新的重组表达载体：

morcas12a-scaffold1-crrna01、morcas12a-scaffold1-crrna02、

morcas12a-scaffold1-crrna03、morcas12a-scaffold2-crrna01、

morcas12a-scaffold2-crrna02、morcas12a-scaffold2-crrna03、

morcas12a-scaffold3-crrna01、morcas12a-scaffold3-crrna02、

morcas12a-scaffold3-crrna03、morcas12a-scaffold4-crrna01、

morcas12a-scaffold4-crrna02、morcas12a-scaffold4-crrna03、

morcas12a-scaffold5-crrna01、morcas12a-scaffold5-crrna02、

morcas12a-scaffold5-crrna03、morcas12a-scaffold6-crrna01、

morcas12a-scaffold6-crrna02、morcas12a-scaffold6-crrna03、

morcas12a-scaffold7-crrna01、morcas12a-scaffold7-crrna02、

morcas12a-scaffold7-crrna03、morcas12a-scaffold8-crrna01、

morcas12a-scaffold8-crrna02、morcas12a-scaffold8-crrna03。

3.crispr-cas12a重组表达载体的水稻原生质体转化

使用上述的crispr-cas12a重组表达载体进行水稻日本晴原生质体分离及转化的具体过程参考文献(tangx,zhengx,qiy,zhangd,chengy,tanga,voytasdf,zhangy.2006.asingletranscriptcrispr-cas9systemforefficientgenomeeditinginplants.molplant,9(7):1088-1091.)中公开的方法进行。

4.定向修饰结果检测

水稻原生质体转化后，25℃暗培养48小时，收集转化细胞，ctab方法提取水稻原生质体基因组dna，以该dna为模板，进行pcr扩增及限制性内切酶验证分析，所用pcr引物和限制性内切酶见表2。具体实验方法流程参考文献(zhongz,zhangy,youq,tangx,renq,lius,yangl,wangy,liux,liub,zhangt,zhengx,ley,zhangy,qiy.2018.molecularplant.plantgenomeeditingusingfncpf1andlbcpf1nucleasesatredefinedandalteredpamsites.molplant,11:999-1002)中公开的实验方法。通过pcr酶切电泳后，用软件(imagelab3.0,bio-rad)算出各条带的值，突变效率为抗性条带值所占酶切条带值与抗性条带值的和的百分比。

表2pcr-rz引物序列、产物及内切酶信息

由图3可知：在所选取tttvpam位点中,morcas12a-scaffold1、morcas12a-scaffold2、morcas12a-scaffold3、morcas12a-scaffold4在所检测的crrna01,crrna02,crrna03三个位点均具有较高编辑活性，morcas12a-scaffold1、morcas12a-scaffold2的活性最好，最高接近60％，最低也超过30％，与对照lbcas12a(使用的骨架载体参见tangx等,.acrispr-cpf1systemforefficientgenomeeditingandtranscriptionalrepressioninplants.natplants，2017,3:17103)的活性相当。而morcas12a-scaffold5、morcas12a-scaffold6、morcas12a-scaffold7、morcas12a-scaffold8在三个位点的编辑活性均低于15％，fncas12a(使用的骨架载体参见zhongz,zhangy,youq,tangx,renq,lius,yangl,wangy,liux,liub,zhangt,zhengx,ley,zhangy,qiy.2018.molecularplant.plantgenomeeditingusingfncpf1andlbcpf1nucleasesatredefinedandalteredpamsites.molplant,11:999-1002)的活性在所检测的位点均低于本发明的morcas12a基因编辑系统和lbcas12a，尤其在crrna03位点的编辑活性低于10％。

由图4可知：在所选取ttvpam位点中,morcas12a-scaffold1、morcas12a-scaffold2在所检测的crrna01,crrna02,crrna03三个位点均具有很高编辑活性，平均活性超过40％，而morcas12a-scaffold3、morcas12a-scaffold4、morcas12a-scaffold5、morcas12a-scaffold6、morcas12a-scaffold7、morcas12a-scaffold8在三个位点的编辑活性均低于25％，lbcas12a在所有位点均未有编辑活性，fncas12a在crrna01,crrna02位点具有较高编辑活性，但在crrna03位点的编辑活性很低。总之，本发明的morcas12a基因编辑系统在ttvpam识别位点的编辑活性最优。

综上所述，本发明的crispr-cas12a基因编辑系统(尤其是morcas12a-scaffold1、morcas12a-scaffold2)不仅能够在tttvpam识别位点的保持高的编辑活性，而且在ttvpam识别位点同样具有高的编辑活性。拓宽了植物基因组编辑位点的选择，提供了一种高效的植物基因组编辑工具。