本发明涉及植物多酚提取技术领域领域，具体涉及一种提高香蕉多酚提取率的复合酶制剂及提取方法
背景技术：
目前，植物提取工艺主要是通过有效降解植物细胞壁，并配合物理化学等方式破坏细胞结构层，使得植物中的活性成分，如生物碱、黄酮、皂苷、多糖、挥发油及苯丙素类等物质可以较好的溶出，可以提高活性物质的提取。而现有技术中采用的降解酶主要有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶、淀粉酶等组成。降解酶对所有植物的提取都适用，但是从植物中提取不同的活性成分，由于该成分存在的状态，以及与其他物质的结合情况不一样，提取时所需的生物酶系也不一样，因此，在现有的生物酶上进行改进，可较好的提高植物活性物质的提取率。生香蕉含有丰富的香蕉多酚化合物，香蕉多酚具有抗氧化、清除自由基和抗衰老等功能，在医疗、食品、日用化学品等方面具有重要应用价值。现阶段多酚的提取方法主要是浸提法和萃取法，主要工艺为从植物中提取得到提取液，再采用金属离子络合沉淀，再采用酸解沉淀，再用乙酸乙酯萃取，并经真空浓缩干燥得到多酚物质。为了提高多酚的纯度，目前还进行柱层析或超滤，操作麻烦。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种提高香蕉多酚提取率的复合酶制剂及提取方法，采用香蕉枯萎病菌酶解剂在酶解前置于球磨机中利用较硬的沸石打磨进行机械破壁，再添加酸液，使酶制剂中壳聚糖包埋层溶解，释放出酶进行酶解，香蕉枯萎病菌酶解剂与淀粉酶、蛋白酶、超声波辅助对生香蕉再次进行破壁降解制备得到的香蕉多酚提取率高，本发明采用沉淀提取多酚、膜滤法进行除杂，不需经专门的洗脱除处理处理即可得到，纯度高的香蕉多酚。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种提高香蕉多酚提取率的复合酶制剂，其由质量份的如下组分组成：淀粉酶10～20份、蛋白酶1～5份以及香蕉枯萎病菌酶解剂30～50份；所述香蕉枯萎病菌酶解剂由如下方法制备得到：将生香蕉皮干燥，磨成粉末后与麸皮混合，添加水至混合物的水分百分含量为25％以上，添加香蕉枯萎病病菌，于20～32℃培养10～24d，沉淀过滤，取得滤液；采用质量比为10～20:3～8的壳聚糖和沸石与5～10倍质量的滤液中混合，在转速为100～200r/min下搅拌20～30min后，于常温下干燥制粒，即得所述香蕉枯萎病菌酶解剂。
其中，所述的沸石的粒径<0.18mm。
其中，所述生香蕉皮粉末与麸皮的质量之比为2～5:1。
本发明中，所述香蕉枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cubense)，能产生纤维素酶、果胶酶等降解酶，对香蕉细胞具有降解破坏的作用，其酶可对香蕉进行降解，提高香蕉多酚的提取率。
本发明的另一目的在于保护一种提高香蕉多酚提取率的提取方法，包括以下步骤：
(1)原料粉碎：将洗净的生香蕉放入干燥箱中，于55～65℃下烘干10～12h，粉碎，过35～45目筛，得到粉末，备用；
(2)酶解：将所述复合酶制剂添加入生香蕉粉末中，再加入水，搅拌均匀，再置于球磨机中打磨1～2h，再加入酸液混合搅拌均匀，并用超声波处理6～9min，停止超声，于42～54℃下水浴保温3～5h，得酶解液；所述酸液的ph值为6.0～6.5；所述水加入量，以及质量百分数计，为生香蕉粉末的5～10％，所述酸液加入量，以及质量百分数计，为生香蕉粉末的60～70％；
(3)二次沉淀：向上述酶解液中加入所述酶解液重量2～3倍的氯化锌溶液，并将ph调整为5.5～6.5，静置20～25h后，于2800～3000r/min下离心5～8min，过滤分离出滤液，得一次沉淀；再采用碳酸氢钠溶液将滤液ph调整为7.5～8，静置10～15h后，于2800～3000r/min下离心5～8min，过滤，得二次沉淀；将所述一次沉淀和二次沉淀混合，得混合沉淀；所述氯化锌溶液的质量浓度为10～15％；
(4)萃取：将上述混合沉淀用酸溶解成液体，并向所述液体中添加等量的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的体积浓度为70～85％，得萃取液；
(5)超滤、浓缩和干燥：用截留分子量为1～3万的pes膜对上述的萃取液进行超滤，膜面流速为3.0～3.5m/s，操作温度为24～35℃，跨膜压力为0.5～1mpa，超滤后于50～65℃下讲滤液进行浓缩，并经真空干燥，得到生香蕉多酚粉末。
其中，步骤(2)中，所述酸液为柠檬酸或醋酸。
其中，所述复合酶制剂的添加量为所述生香蕉粉末质量的0.1～0.5％。
其中，所述复合酶制剂中，淀粉酶酶活力不低于50u/mg、蛋白酶不低于120u/mg，香蕉枯萎病菌酶解剂不低于200u/mg。
其中，步骤(2)中，所述的超声波的功率为250～300w，频率为20～35khz。
其中，步骤(4)中，所述酸为1～2mol/l的稀硫酸或3～4mol/l的稀盐酸。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用对香蕉具有高降解活性的香蕉枯萎病病菌的发酵滤液制成香蕉枯萎病菌酶解剂，发酵时采用生香蕉皮以及麸皮作为发酵底物，有利于诱导降解酶的产生。香蕉枯萎病菌酶解剂制备过程中，采用壳聚糖和沸石对酶进行包埋处理制成香蕉枯萎病菌酶解剂，再将其应用香蕉酶解时，先将复合酶制剂与香蕉粉末置于球磨机中打磨，香蕉枯萎病菌酶解剂的沸石具有较大的硬度，在球磨机的打磨下，沸石可对香蕉粉末再次进行机械细胞破壁，提高香蕉多分的提取率。本发明置于球磨机中打磨后添加酸液酶解，在酸性条件下，壳聚糖包埋层易于溶解，释放出酶，再联合超声波辅助对生香蕉进行破壁提取，在充分的破壁以及酶解下，香蕉多酚易于溶出，提高香蕉多酚的提取率。
(2)本发明的酶解步骤中，超声波可提高酶活力，而香蕉枯萎病菌酶解剂含有适宜降解香蕉的酶系，其与淀粉酶、蛋白酶协同增效，加快酶反应速度，提高了生香蕉细胞的破碎和溶解程度，使多酚物质能最大程度的释放、渗出，且香蕉枯萎病菌酶解剂与蛋白酶以及淀粉酶还将细胞中的蛋白质和果胶溶解成小分子物质，降低了蛋白质和果胶的含量，降解淀粉多糖，使其较好的溶解出多酚物质，进而减少了多酚类物质与蛋白质、多糖的结合，进一步提高了游离多酚物质的含量。
(3)本发明沉淀步骤中，采用氯化锌在酸性条件下沉淀，再调整ph值在碱性条件下沉淀，可使多酚沉淀完全，提高了得率和纯度；在超滤、浓缩和干燥步骤中，用pes膜对萃取液进行超滤，可进一步去除杂质，本发明的提取工艺也不用专门进行多酚脱色处理，香蕉枯萎病菌酶解剂中含有的沸石具有吸附除杂作用，岂可提高多酚的纯度。
(4)经检测，本发明方法的生香蕉多酚得率为36.5-40.7mg/g，纯度为95％以上。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。
实施例1
一种提高香蕉多酚提取率的复合酶制剂，其由质量份的如下组分组成：淀粉酶20份、蛋白酶1份以及香蕉枯萎病菌酶解剂50份；所述香蕉枯萎病菌酶解剂由如下方法制备得到：将生香蕉皮干燥，磨成粉末后与麸皮混合，添加水至混合物的水分百分含量为25％，添加香蕉枯萎病病菌，于20℃培养24d，沉淀过滤，取得滤液；采用质量比为10:8的壳聚糖和沸石与5倍质量的滤液中混合，在转速为200r/min下搅拌20min后，于常温下干燥制粒，即得所述香蕉枯萎病菌酶解剂。所述的沸石的粒径0.18mm。所述生香蕉皮粉末与麸皮的质量之比为5:1。
一种提高香蕉多酚提取率的提取方法，包括以下步骤：
(1)原料粉碎：将洗净的生香蕉放入干燥箱中，于55℃下烘干12h，粉碎，过35目筛，得到粉末，备用；
(2)酶解：将所述复合酶制剂添加入生香蕉粉末中，再加入水，搅拌均匀，再置于球磨机中打磨2h，再加入酸液混合搅拌均匀，并用超声波处理6min，停止超声，于54℃下水浴保温3h，得酶解液；所述酸液的ph值为6.5；所述水加入量，以及质量百分数计，为生香蕉粉末的5％，所述酸液加入量，以及质量百分数计，为生香蕉粉末的70％；所述酸液为柠檬酸；所述复合酶制剂的添加量为所述生香蕉粉末质量的0.1％。复合酶制剂中，淀粉酶酶活力为50u/mg、蛋白酶为120u/mg，香蕉枯萎病菌酶解剂为200不低于u/mg。所述的超声波的功率为300w，频率为20khz。
(3)二次沉淀：向上述酶解液中加入所述酶解液重量3倍的氯化锌溶液，并将ph调整为5.5，静置20～25h后，于3000r/min下离心5min，过滤分离出滤液，得一次沉淀；再采用碳酸氢钠溶液将滤液ph调整为8，静置10～15h后，于2800r/min下离心8min，过滤，得二次沉淀；将所述一次沉淀和二次沉淀混合，得混合沉淀；所述氯化锌溶液的质量浓度为10％；
(4)萃取：将上述混合沉淀用酸溶解成液体，并向所述液体中添加等量的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的体积浓度为85％，得萃取液；所述酸为1mol/l的稀硫酸。
(5)超滤、浓缩和干燥：用截留分子量为1万的pes膜对上述的萃取液进行超滤，膜面流速为3.5m/s，操作温度为24℃，跨膜压力为1mpa，超滤后于50℃下讲滤液进行浓缩，并经真空干燥，得到生香蕉多酚粉末。
实施例2
一种提高香蕉多酚提取率的复合酶制剂，其由质量份的如下组分组成：淀粉酶10份、蛋白酶5份以及香蕉枯萎病菌酶解剂30份；所述香蕉枯萎病菌酶解剂由如下方法制备得到：将生香蕉皮干燥，磨成粉末后与麸皮混合，添加水至混合物的水分百分含量为30％，添加香蕉枯萎病病菌，于32℃培养10d，沉淀过滤，取得滤液；采用质量比为20:3的壳聚糖和沸石与10倍质量的滤液中混合，在转速为100r/min下搅拌30min后，于常温下干燥制粒，即得所述香蕉枯萎病菌酶解剂。所述的沸石的粒径为0.15mm。所述生香蕉皮粉末与麸皮的质量之比为2:1。
一种提高香蕉多酚提取率的提取方法，包括以下步骤：
(1)原料粉碎：将洗净的生香蕉放入干燥箱中，于65℃下烘干10h，粉碎，过45目筛，得到粉末，备用；
(2)酶解：将所述复合酶制剂添加入生香蕉粉末中，再加入水，搅拌均匀，再置于球磨机中打磨1h，再加入酸液混合搅拌均匀，并用超声波处理9min，停止超声，于42℃下水浴保温5h，得酶解液；所述酸液的ph值为6.0；所述水加入量，以及质量百分数计，为生香蕉粉末的10％，所述酸液加入量，以及质量百分数计，为生香蕉粉末的60％；所述酸液为醋酸；所述复合酶制剂的添加量为所述生香蕉粉末质量的0.5％。复合酶制剂中，淀粉酶酶活力为55u/mg、蛋白酶为130u/mg，香蕉枯萎病菌酶解剂为250u/mg。所述的超声波的功率为250w，频率为35khz。
(3)二次沉淀：向上述酶解液中加入所述酶解液重量2倍的氯化锌溶液，并将ph调整为6.5，静置20h后，于3000r/min下离心5min，过滤分离出滤液，得一次沉淀；再采用碳酸氢钠溶液将滤液ph调整为8，静置10h后，于3000r/min下离心5min，过滤，得二次沉淀；将所述一次沉淀和二次沉淀混合，得混合沉淀；所述氯化锌溶液的质量浓度为15％；
(4)萃取：将上述混合沉淀用酸溶解成液体，并向所述液体中添加等量的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的体积浓度为70％，得萃取液；所述酸为3mol/l的稀盐酸。
(5)超滤、浓缩和干燥：用截留分子量为3万的pes膜对上述的萃取液进行超滤，膜面流速为3.0m/s，操作温度为35℃，跨膜压力为0.5mpa，超滤后于65℃下讲滤液进行浓缩，并经真空干燥，得到生香蕉多酚粉末。
实施例3
一种提高香蕉多酚提取率的复合酶制剂，其由质量份的如下组分组成：淀粉酶25份、蛋白酶3份以及香蕉枯萎病菌酶解剂40份；所述香蕉枯萎病菌酶解剂由如下方法制备得到：将生香蕉皮干燥，磨成粉末后与麸皮混合，添加水至混合物的水分百分含量为36％，添加香蕉枯萎病病菌，于26℃培养20d，沉淀过滤，取得滤液；采用质量比为15:7的壳聚糖和沸石与8倍质量的滤液中混合，在转速为150r/min下搅拌25min后，于常温下干燥制粒，即得所述香蕉枯萎病菌酶解剂。所述的沸石的粒径0.10mm。所述生香蕉皮粉末与麸皮的质量之比为3:1。
一种提高香蕉多酚提取率的提取方法，包括以下步骤：
(1)原料粉碎：将洗净的生香蕉放入干燥箱中，于62℃下烘干11h，粉碎，过40目筛，得到粉末，备用；
(2)酶解：将所述复合酶制剂添加入生香蕉粉末中，再加入水，搅拌均匀，再置于球磨机中打磨2h，再加入酸液混合搅拌均匀，并用超声波处理8min，停止超声，于45℃下水浴保温4h，得酶解液；所述酸液的ph值为6.2；所述水加入量，以及质量百分数计，为生香蕉粉末的8％，所述酸液加入量，以及质量百分数计，为生香蕉粉末的65％；所述酸液为柠檬酸或醋酸；所述复合酶制剂的添加量为所述生香蕉粉末质量的0.3％。复合酶制剂中，淀粉酶酶活力为65u/mg、蛋白酶为130u/mg，香蕉枯萎病菌酶解剂为260u/mg。所述的超声波的功率为280w，频率为30khz。
(3)二次沉淀：向上述酶解液中加入所述酶解液重量3倍的氯化锌溶液，并将ph调整为6.0，静置23h后，于2900r/min下离心7min，过滤分离出滤液，得一次沉淀；再采用碳酸氢钠溶液将滤液ph调整为7.8，静置12h后，于2900r/min下离心7min，过滤，得二次沉淀；将所述一次沉淀和二次沉淀混合，得混合沉淀；所述氯化锌溶液的质量浓度为12％；
(4)萃取：将上述混合沉淀用酸溶解成液体，并向所述液体中添加等量的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的体积浓度为80％，得萃取液；所述酸为1.5mol/l的稀硫酸或.5mol/l的稀盐酸。
(5)超滤、浓缩和干燥：用截留分子量为2万的pes膜对上述的萃取液进行超滤，膜面流速为3.2m/s，操作温度为30℃，跨膜压力为0.8mpa，超滤后于60℃下讲滤液进行浓缩，并经真空干燥，得到生香蕉多酚粉末。
对照组1
对照组1与实施例1基本相同，区别在于，对照组1的香蕉多酚提取方法不采用复合酶制剂。
对照组2
对照组2与实施例1基本相同，区别在于，对照组2的复合酶制剂未添加淀粉酶和蛋白酶。
对照组3
对照组3与实施例1基本相同，区别在于，对照组3复合酶制剂未含有香蕉枯萎病菌酶解剂。
对照组4
对照组4与实施例1基本相同，区别在于，对照组4香蕉枯萎病菌酶解剂在制备时，不采用壳聚糖和沸石进行包埋制粒。
对照组5
对照组5与实施例1基本相同，区别在于，对照组5香蕉枯萎病菌酶解剂在制备时仅采用壳聚糖包埋制粒，不含有沸石。
为了说明本发明生香蕉多酚提取效果，依照实施例1～实施例3以及对照组1～对照组3的香蕉多酚提取工艺提取香蕉多酚，各组使用的生香蕉均来自生长在广西南宁市坛洛镇所产的生香蕉，提取结束后，取各组的终产品进行检测，其中，多酚得率用酒石酸亚铁比色法测定；多酚纯度用高效液相色谱法测定。检测结果见表1：
表1
由表1中的实施例1～实施例3可知，本发明方法最终得到的生香蕉多酚得率为36.5-40.7mg/g，纯度为95％以上。从实施例1与对照组1～对照组3的对比可知，提取率实施例1＞对照组3＞对照组2＞对照组1，说明本发明采用淀粉酶和蛋白酶与香蕉枯萎病菌酶解剂复合，香蕉酶解制剂以及淀粉酶和蛋白酶协同增效，加快酶反应速度，提高了生香蕉细胞的破碎和溶解程度，使多酚物质能最大程度的渗出，提高了游离多酚物质的含量，从而提高香蕉多酚提取率，且香蕉枯萎病菌酶解剂的酶解影响最大。从实施例1与对照组4、对照组5的对比可知，提取率实施例1＞对照组4、对照组5，纯度实施例1＞对照组4、对照组5说明本发明采用沸石进行球磨机中打磨后，可泡坏香蕉中的细胞，促进多酚物质的溶出，提高提取率，同时沸石的吸附作用还可提高多酚的纯度。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。