罗伊氏乳杆菌LR-CO21及其应用的制作方法

本发明涉及益生菌
技术领域：
，具体而言，涉及一种罗伊氏乳杆菌lr-co21及其应用。
背景技术：
：猪大肠杆菌病、猪传染性胃肠炎等疾病是影响养殖业经济效益的重要疾病，其中，猪大肠杆菌病是由病原性大肠杆菌引起的肠道传染性疾病，猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus，tgev)引起的一种以腹泻、呕吐和脱水为特征的传染性疾病。目前，针对上述疾病的防控主要是通过接种疫苗、使用抗生素、药物或益生菌剂等方法。但是，疫苗接种浪费人力成本，使用抗生素或药物容易造成病原体的耐药性以及抗生素或药物的残留，而通过益生菌调节肠道菌群、调节黏膜与免疫系统功能，促进营养吸收，从而促进仔猪的健康成为相对安全的疾病防控手段，乳酸菌作为重要的益生菌被广泛应用，其中，罗伊氏乳杆菌能够产生一种广谱抗菌物质罗伊氏素，被越来越广泛地应用。但是，目前常用的罗伊氏乳杆菌综合性能欠佳，例如：产酸能力、抗逆性、抑菌性能等方面不能同时表现优异，而且其在肠道内定植效果差，定植后难以高效抑制tgev感染，作为益生菌应用其综合性能较差。因此，提供一种在肠道内定植效果好，定植后能有效抑制tgev感染，同时兼具优异的抗逆性、抑菌性、免疫调节性能、抗氧化性等综合性能较好的罗伊氏乳杆菌，具有极高的实用价值和经济价值。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一株罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为cctccno.m2019601。该菌株在肠道内能够高效定植，黏附性好，定植后能够提高仔猪抵抗病毒侵染或细菌感染的能力，尤其能高效抑制tgev的感染，提高免疫力，同时兼具良好的抗逆性、产酸能力、并且能够高效抑制有害细菌繁殖。本发明目的之二在于提供上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21在提高仔猪抗传染病能力中应用的方法。该方法操作简单，能够有效实现罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21在肠道内的高效定植，提高仔猪抗传染病的能力。本发明目的之三在于提供活性成分包含上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的菌剂。本发明的目的之四在于提供上述菌剂在制备饲料添加剂中的应用，活性成分包含罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的菌剂在制备饲料添加剂中的应用能够使制得的饲料添加剂具有更高效提高猪的免疫力的功效。本发明的目的之五在于提供上述菌剂在制备兽用药品中的应用，将包含罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的菌剂在制备兽用药品中应用，得到的兽用药品能治疗或辅助治疗猪的一些肠道疾病，调节肠道菌群，提高免疫力。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：第一方面，提供了一株罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为cctccno.m2019601。第二方面，提供了上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21在提高仔猪抗传染病能力中应用的方法。优选地，在本发明方案基础上，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21在提高仔猪抗传染病能力中应用的方法，方法包括如下步骤：给仔猪饲喂菌液浓度为(5±1)×1010cfu/ml罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的菌液，饲喂次数为每日2-3次，饲喂体积为2-3ml，饲喂天数为3-10天；传染病包括猪大肠杆菌病和猪传染性胃肠炎。优选地，在本发明方案基础上，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21在提高仔猪抗传染病能力中应用的方法，方法包括如下步骤：给仔猪饲喂菌液浓度为(5±1)×1010cfu/ml罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的菌液，饲喂次数为每日2次，饲喂体积为2ml，饲喂天数为7天。优选地，在本发明方案基础上，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21在提高仔猪抗传染病能力中应用的方法，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的菌液的制备包括如下步骤：将罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21发酵培养15-30h，经离心收集菌体后，用生理盐水重悬，得到罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的菌液；优选地，发酵培养为24h。优选地，在本发明方案基础上，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21在提高仔猪抗传染病能力中应用的方法，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21于液体培养基中活化2-3代以后再进行发酵培养，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21发酵培养的接种体积比为菌液体积/液体培养基体积为1:100。第三方面，提供了一种菌剂，其活性成分包括上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21。优选地，在本发明方案的基础上，菌剂为固体菌剂；优选地，菌剂为干粉菌剂；优选地，干粉菌剂由罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的发酵液经真空冷冻干燥制得；优选地，干粉菌剂由罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的发酵液和菌体耐热保护剂混合后经真空冷冻干燥制得。第四方面，提供了上述菌剂在制备饲料添加剂中的应用。第五方面，提供了上述菌剂在制备兽用药品中的应用。与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明的一株罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21，该菌株在普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为cctccno.m2019601，该菌株黏附性好，通过caco-2与益生菌共培养的模型体外测定罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的黏附性，本发明提供的罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21对caco-2细胞的黏附率达到26.22％，并且通过将该菌株回归仔猪体内的定植试验结果表明，该菌株在仔猪各肠段均具有较强的定植能力，且在空肠和回肠的定植最好，由于其在肠道内能够高效定植，植性能好，不易被排出体外，因此，其总的定植量相对较大，定植后能发挥出更强的益生菌作用，综合提高仔猪免疫能力，提高仔猪抵抗病毒侵染或细菌感染的能力；此外，通过cck-8检测，该罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21定植后能有效抑制tgev的感染。此外，该菌株同时还兼具综合性能好，抗逆性强、产酸能力强以及能够较好的抑制有害细菌繁殖的特点。(2)本发明提供的上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21在提高仔猪抗传染病能力中应用的方法。该方法操作简单，能够有效实现罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21在肠道内的高效定植，进而提高仔猪抗传染病的能力，其中，对仔猪抵抗tgev感染的能力具有极大的提高。本发明提供了活性成分包含上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的菌剂。本发明提供的上述菌剂在制备饲料添加剂中的应用，能够使饲料添加剂具有更高效提高猪的免疫力，提高抵抗病毒或细菌感染的能力的作用。此外，本发明提供的上述菌剂在制备兽用药品中的应用，得到的兽用药品，能治疗或辅助治疗猪的一些肠道疾病，调节肠道菌群，提高免疫力。附图说明图1为本发明具体实施方式中12株乳酸杆菌基因组16srdnapcr结果；图2为本发明具体实施方式中12株罗伊氏乳杆菌的生长曲线图；图3为本发明具体实施方式中12株罗伊氏乳杆菌的产酸趋势图；图4为本发明具体实施方式的抑菌性能测定中12株菌发酵后制得的无细胞上清对f4+产肠毒素大肠杆菌eteccvcc230的抑菌结果图；图5为本发明具体实施方式的抑菌性能测定中12株菌发酵后制得的无细胞上清对金黄色葡萄球菌cvcc546的抑菌结果图；图6为本发明具体实施方式的抑菌性能测定中12株菌发酵后制得的无细胞上清对鼠伤寒沙门氏菌sl1344的抑菌结果图；图7为本发明具体实施方式的抑菌性能测定中12株菌发酵后制得的无细胞上清对鸡白痢沙门氏菌cvcc578的抑菌结果图；图8为本发明具体实施方式的体外黏附试验中12株罗伊氏乳杆菌体外粘附能力测定结果图；图9为本发明具体实施方式的胞外多糖产量的测定中配比建立苯酚硫酸法测定胞外多糖产量的标准曲线图；图10为本发明具体实施方式的胞外多糖产量的测定中12株罗伊氏乳杆菌的胞外多糖产量测定结果图；图11为本发明具体实施方式的抗氧化能力测定中12株罗伊氏乳杆菌抗氧化能力计算结果图；图12为本发明具体实施方式的细胞表面特性试验中12株罗伊氏乳杆菌表面疏水率图；图13为本发明具体实施方式的细胞表面特性试验中12株罗伊氏乳杆菌的自聚合能力图；图14为本发明具体实施方式的体内定植试验中流式分析检测荧光染料cfda-se标记阳性率试验中无标记对照图；图15为本发明具体实施方式的体内定植试验中流式分析检测荧光染料cfda-se标记阳性率试验中标记菌株图；图16为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色十二指肠感染组；图17为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色十二指肠对照组；图18为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色十二指肠饲喂组；图19为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色空肠感染组；图20为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色空肠对照组；图21为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色空肠饲喂组；图22为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色回肠感染组；图23为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色回肠对照组；图24为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色回肠饲喂组；图25为本发明试验例中19t-faeg质粒拷贝数标准曲线图；图26为本发明试验例中实时荧光定量pcr检测仔猪十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠中的f4+产肠毒素etec数量结果图；图27为本发明试验例中仔猪免疫器官指数的分析胸腺指数图；图28为本发明试验例中仔猪免疫器官指数的分析脾脏指数图；图29为本发明试验例中elisa检测试剂盒检测各组仔猪血清中的igg含量图；图30为本发明试验例中elisa检测试剂盒检测各组仔猪肠粘膜中siga含量图；图31为本发明试验例中elisa检测试剂盒检测感染后血清中促炎因子il-1β的含量图；图32为本发明试验例中实时荧光定量pcr检测感染后小肠组织中促炎因子il-1β的mrna转录水平图；图33为本发明试验例中elisa检测试剂盒检测感染后血清中促炎因子il-6的含量图；图34为本发明试验例中实时荧光定量pcr检测感染后小肠组织中促炎因子il-6的mrna转录水平图；图35为本发明感染后elisa检测试剂盒检测血清中抗炎因子il-10的含量图；图36为本发明试验例中实时荧光定量pcr检测感染后小肠组织中抗炎因子il-10的mrna转录水平图；图37为本发明试验例中elisa检测试剂盒检测感染后血清中促炎因子il-12的含量图；图38为本发明试验例中实时荧光定量pcr检测感染后小肠组织中促炎因子il-12的mrna转录水平图；图39为本发明试验例中荧光定量pcr检测感染后仔猪肠黏膜组织中紧密连接蛋白claudin-1的mrna相对表达量图；图40为本发明试验例中荧光定量pcr检测感染后仔猪肠黏膜组织中紧密连接蛋白occludin的mrna相对表达量图；图41为本发明试验例中荧光定量pcr检测感染后仔猪肠黏膜组织中紧密连接蛋白zo-1的mrna相对表达量图；图42为本发明试验例中荧光定量pcr检测感染后仔猪肠黏膜组织中tlr4的mrna相对表达量图；图43为本发明试验例中荧光定量pcr检测感染后仔猪肠黏膜组织中nf-κb的mrna相对表达量图；图44为本发明试验例中荧光定量pcr检测感染后仔猪肠黏膜组织中myd88的mrna相对表达量图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。第一方面，提供了一株罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为cctccno.m2019601。本发明提供的罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21已于2019年8月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心；邮编：430072，保藏编号为cctccno.m2019601。罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21，即lactobacillusreuterilr-co21，也简称为lr-co21。第二方面，提供了上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21在提高仔猪抗传染病能力中应用的方法。罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21菌株，经生物学特性分析，适宜作为益生菌用以提高猪的免疫力，抗传染病能力，该菌株在肠道内的定植能力显著高于现有技术中的其它罗伊氏乳杆菌，由于其定植性能好，不易被排出体外，因此在其定植以后各种益生作用发挥的更为充分，效果更为明显，显示了优良的益生菌性能，尤其是在其定植后能够高效抑制tgev(transmissiblegastroenteritisvirus，tgev)对机体的侵染，同时该菌株兼具其它乳酸杆菌益生菌的优势，即lr-co21的综合生物学性能好，典型但费限制性的生物学性能例如表现为：第一、黏附性作用；第二、维持肠道菌群平衡，促进营养物质吸收；抑制有害细菌生长；第三、调节免疫机能；第四、lr-co21代谢产物所发挥的作用，典型但非限制性的代谢产物例如包括：有机酸、过氧化氢、胞外多糖或罗伊氏菌素等；其发挥的性能和作用包括抗氧化性、抑制有害细菌等。lr-co21体外黏附性较强，体外粘附caco-2细胞(人结肠腺癌细胞)，黏附率高达26.22％；利用微生物黏着碳烃化合物法(bacterialadherencetohydrocarbons，bath)测定od600后计算lr-co21菌株的表面疏水率为56.28％，lr-co21菌悬液经37℃静置2h后测定od600，计算该lr-co21菌株的自聚合率为29.11％，表面疏水率和自聚合力是判定细菌黏附性的重要指标，进一步证实lr-co21具有良好的黏附性，能够更好地在肠道内定植；以荧光染料cfda-se标记lr-co21，以流式分析检测标记阳性率结果进一步证实，lr-co21在饲喂后第4d在仔猪各肠段均可定植；第7-10d可检测到在仔猪十二指肠、空肠、回肠、盲肠定植效果较好；第14d在小肠内仍有较强的定植能力，以空肠段定植效果最显著，以上实验数据充分证明该菌株具有极强的黏附性，定植能力优异。lr-co21的代谢产物在其作为益生菌的应用中也发挥了重要作用，lr-co21菌株的胞外多糖产量较高，胞外多糖是菌体生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类糖类化合物，可以增强免疫反应，可以起到抑菌作用，还能清除自由基；以lr-co21发酵培养24h后的发酵液各1l经离心、沉淀、透析处理后以苯酚硫酸法进行胞外多糖(exopolysaccharides，eps)产量的测定，lr-co21菌株胞外多糖产量为303mg/l；lr-co21菌株发酵培养24h的无细胞上清液对dpph(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazylradical2，2-diphenyl-1-(2，4，6-trinitrophenyl)hydrazyl)自由基进行清除率为59.82％；lr-co21菌株抵抗仔猪感染大肠杆菌f4+产肠毒素大肠杆菌etec(enterotoxigenicescherichiacoli，etec)的效果显示，lr-co21菌株作为益生菌可以显著降低仔猪腹泻率，进而有利于营养物质的吸收，由此可见，lr-co21菌株在增强免疫反应，抑菌以及清除自由基方面性能优异。饲喂lr-co21还能够提高仔猪胸腺和脾脏指数，能够促进仔猪免疫器官发育，调节免疫机能。对感染f4+产肠毒素大肠杆菌etec的仔猪免疫球蛋白的影响检测结果显示，对感染f4+产肠毒素大肠杆菌etec的仔猪饲喂lr-co21发酵菌液相对于未饲喂发酵菌液，能极显著上调血清中igg及空肠肠黏液中的siga的含量(p<0.01)，显著上调十二指肠、回肠肠黏液中的siga的含量(p<0.05)；elisa检测试剂盒检测血清中的促炎因子il-1β、il-6、il-12及抗炎因子il-10含量，实时荧光定量pcr检测小肠组织mrna转录水平，对感染f4+产肠毒素大肠杆菌etec的仔猪饲喂lr-co21相对于未饲喂，其极显著下调仔猪血清中促炎因子il-1β、il-6及il-12的含量；极显著上调抗炎因子il-10的含量(p<0.01)。抗炎因子il-10mrna相对表达量在十二指肠、回肠组织中显著上调(p<0.05)；il-1β的mrna相对表达量在空肠中极显著下调(p<0.01)，在十二指肠和回肠中显著下调(p<0.05)；il-6的mrna相对表达量在回肠中极显著下调(p<0.01)，在十二指肠和空肠中显著下调(p<0.05)；il-12的mrna相对表达量在仔猪十二指肠、空肠、回肠肠组织中均极显著下调(p<0.01)。饲喂组相对于感染组仔猪，小肠组织中各细胞因子的变化水平总体趋势与血清中检测结果相一致，均可上调抗炎因子il-10，下调促炎因子il-1β、il-6及il-12。对nf-κb信号通路相关蛋白的检测结果表明饲喂lr-co21可以极显著下调仔猪空肠、回肠肠组织中tlr4，nf-κb及myd88mrna相对表达量(p<0.01)；荧光定量pcr检测感染后仔猪肠黏膜组织中紧密连接蛋白claudin-1、occludin和zo-1，的mrna相对表达含量。饲喂组较感染组极显著上调紧密连接蛋白claudin-1、occludin及zo-1在小肠组织中mrna的相对表达量(p<0.01)；以上数据均表明，lr-co21具有较强的免疫调节功能，能够促进免疫反应，提高免疫力。lr-co21还能维持肠道菌群平衡，抑制有害细菌生长；饲喂lr-co21菌株的仔猪，肠道内乳酸菌和双歧杆菌等益生菌显著上调；lr-co21发酵培养24h后制得的无细胞上清液具有较好的抑菌效果，对f4+产肠毒素大肠杆菌(etec)、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用；饲喂lr-co21菌株以后，荧光定量pcr定量分析f4+产肠毒素大肠杆菌etec在仔猪肠道的含量，结果显示，感染仔猪饲喂lr-co21以后，f4+产肠毒素大肠杆菌etec在仔猪肠道的含量显著降低，因此，lr-co21菌株在维持肠道菌群平衡，抑制有害细菌生长方面均表现出良好的益生菌性能。lr-co21的抗逆性非常好，lr-co21菌株经耐酸耐胆盐试验显示，其可耐受猪胆盐的浓度为0.3％，可耐受酸的程度为ph为2，；lr-co21对人工胃肠液的耐受性较好，人工胃液处理2h后具有存活率可以达到67.24％。；lr-co21菌株在经60℃处理15min后存活率35.64％，其具有较好的耐高温性能；药敏性试验表明lr-co21对多粘菌素b、环丙沙星、左氟沙星、米诺霉素、呋喃妥因、大观霉素、苯唑西林、复方新诺明、四环素和诺氟沙星菌不敏感，其对于常用抗生素不敏感，作为益生菌不易被一些抗生素所清除，由此可见，lr-co21菌株耐胆盐、耐酸、耐热性能好，同时对多种抗生素均不敏感，这些特性使该菌株在生产实践中的应用成为可能。用活化三代od600＝1.0±0.02的lr-co21菌液，以菌液体积/液体培养基体积比为1:100的比例扩大培养至mrs培养基，37℃液体静置发酵培养24h后；培养液的ph可由初始5.75±0.1降低至4±0.1，证明lr-co21菌株具有较强的产酸能力，良好的产酸能力表明lr-co21菌株具有较好的抑菌效果。对肠黏膜具有保护作用，促进营养物质吸收，对感染f4+产肠毒素大肠杆菌etec的仔猪小肠黏膜组织形态的影响检测结果证实，感染f4+产肠毒素大肠杆菌etec的仔猪饲喂lr-co21菌株后相比未饲喂lr-co21菌株，饲喂lr-co21菌株能显著增加十二指肠、空肠和回肠绒毛长度及绒毛长度/隐窝深度的比值，对肠黏膜的保护，有利于营养物质的吸收，进一步有利于生长发育和免疫机能的发挥。综上所述，口服饲喂上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21菌株能够提高仔猪抗传染病能力，显示了lr-co21菌株作为益生菌的良好的生物学特性，该菌株具有良好的黏附性，在肠道内定植效果好，并且能够高效抑制tgev感染，此外，该菌株兼具良好的益生菌生物学特性，服用后能够提高免疫力、维持肠道菌群平衡，抑制有害菌生长繁殖、清除氧化自由基，同时兼具良好的抗氧化性，良好的抗逆性，有极高的实际应用价值。在一种优选的实施方式中，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21在提高仔猪抗传染病能力中应用的方法，方法包括如下步骤：给仔猪饲喂菌液浓度为(5±1)×1010cfu/ml罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的菌液，饲喂次数为每日2-3次，饲喂体积为2-3ml，饲喂天数为3-10天；传染病包括猪大肠杆菌病或猪传染性胃肠炎。猪大肠杆菌病是由病原性大肠杆菌引起的仔猪一组肠道传染性疾病。常见的有仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病三种，以发生肠炎、肠毒血症为特征。感染f4+产肠毒素大肠杆菌etec会引发猪的大肠杆菌病，而lr-co21在肠道内的定植能够有效抑制f4+产肠毒素大肠杆菌etec的繁殖，降低f4+产肠毒素大肠杆菌etec在肠道内的量，因此能有效提高仔猪抵抗猪大肠杆菌病的能力。猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒引起猪的一种高度接触性消化道传染病，由tgev感染所引起，以呕吐、水样腹泻和脱水为特征，应用lr-co21在肠道内的定植能够保护肠道内的黏膜，高效抑制tgev感染，能有效提高仔猪抵抗猪传染性胃肠炎的能力。应用适宜的菌液浓度(5±1)×1010cfu/ml，适宜的菌液体积2-3ml进行饲喂，能够更好地保证菌株的定植数量以及定植率，经多次试验摸索不会过多地将饲喂的菌株排出体外，也不会出现定植数量过少的现象，饲喂次数2-3次为宜，一次饲喂过多会造成大量菌株被排出地外，饲喂要持续3-10天，天数过少定植效果不好，饲喂天数不宜过多，因为定植充分以后继续饲喂对定植量的增加未见明显效果。在一种优选的实施方式中，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21在提高仔猪抗传染病能力中应用的方法，方法包括如下步骤：给仔猪饲喂菌液浓度为(5±1)×1010cfu/ml罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的菌液，饲喂次数为每日2次，饲喂体积为2ml，饲喂天数为7天。以每日饲喂2次为宜，不仅方便配合饲养管理，而且剂量更为合理。饲喂体积为2ml；方便操作，剂量合理。优选地，饲喂天数为7天。7天通常能够达到充分定植的效果，继续加强饲喂，不会有明显的提高定植的作用，浪费人力物力成本。在一种优选的实施方式中，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21在提高仔猪抗传染病能力中应用的方法，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的菌液的制备包括如下步骤：将罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21发酵培养15-30h，经离心收集菌体后，用生理盐水重悬，得到罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的菌液；发酵培养15-30h，典型但非限制性的发酵培养时间例如为：15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h或30h等。这个时间段通常能够达到对数生长期，处于对数生长期的菌体占比较大，此时的菌体活性往往较好，没有过多的衰退菌体，菌体的各种生物学特性表现更为优良，定植性能更好，定植后能够更迅速进入复制增殖，饲喂后，能够更好地发挥各种生物学功能，提高仔猪的免疫力，抵抗细菌和病毒侵染的能力。优选地，发酵培养为24h，一般发酵培养24h对数期菌体数量占比通常最大，因此优选发酵培养24h的菌体进行饲喂。在一种优选的实施方式中，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21在提高仔猪抗传染病能力中应用的方法，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21于液体培养基中活化2-3代以后再进行发酵培养，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21发酵培养的接种体积比为菌液体积/液体培养基体积为1:100。菌种在保藏以后，尤其是在反复冻融之后，通常会引起菌株的性能的衰退，一般要经过菌体复壮或活化，进行菌体活力的恢复，以更好地发挥其生物学性能，因此一般会进行2-3代的活化，通常应用液体培养基进行培养活化。第三方面，提供了一种菌剂，其活性成分包括上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21。包括上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的菌剂不限剂型，用于提高机体免疫力，抵抗病毒或细菌侵染。在一种优选的实施方式中，菌剂为固体菌剂；优选地，菌剂为干粉菌剂；干粉剂型的菌剂体积小，菌体数目多，方便运输和保存。优选地，干粉菌剂由罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的发酵液经真空冷冻干燥制得；为避免高温或者恶劣环境对菌体活性的影响，可以在加入菌体耐热保护剂以后，对其进行真空冷冻干燥。优选地，干粉菌剂由罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的发酵液和菌体耐热保护剂混合后经真空冷冻干燥制得。真空冷冻干燥法制得的干粉菌剂保藏时间长，真空冷冻干燥法对菌体活性影响较小。第四方面，提供了上述菌剂在制备饲料添加剂中的应用。将活性成分包含上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的菌剂作为饲料添加剂加入饲料当中可以用于提高饲养动物的免疫力，提高其抵抗病毒或细菌侵染的能力，调节肠道菌群，保护肠粘膜，促进营养物质吸收，减少发病率，提高料肉比，综合提高养殖的经济效益。第五方面，提供了上述菌剂在制备兽用药品中的应用。将活性成分包含上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)lr-co21的菌剂在制备兽用药品中应用，制成的兽用药品可以用于动物疾病的治疗或辅助治疗猪的肠道疾病，能够提高动物机体免疫力，抵抗病毒或细菌侵染，调节肠道菌群，促进营养吸收，保护肠粘膜，降低疾病感染率，尤其是降低猪传染性胃肠炎和猪大肠杆菌病的感染率。下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。lr-co21菌株的获得：菌株的分离：将三月龄健康仔猪禁食12h后麻醉致死，无菌取空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠肠段各15cm，以灭菌载玻片刮取各肠段肠黏液于2ml灭菌ep管并称重，以等体积灭菌pbs混合悬起，以此为原倍稀释度。取100μl原倍悬液加入到900μl灭菌pbs中，以此为10-1稀释度，以十倍稀释法稀释至10-8稀释度后，将10-2、10-4、10-6、10-8稀释度的肠黏液漩涡振荡混匀，各取200μl以灭菌涂布棒涂布于mrs-caco3平板，37℃静置培养24h。根据菌落状态，选择密度适中，菌落形态较多的稀释度平板，挑取溶钙圈明显、乳白色、隆起、光滑、边缘整齐的菌落挑于1ml无抗液体mrs培养基中，37℃静置培养24h后取500μl菌液于4℃保存，余下菌液室温5000rpm/min离心5min，取菌体沉淀进行革兰氏染色。于100×油镜下观察菌体形态、排列方式及纯度。以单菌落划线法纯化，观察油镜下视野内的革兰氏阳性杆菌菌体形态及排列方式一致，即可认为纯化完成。各菌株纯化后进行氧化酶实验、接触酶实验、明胶液化、靛基质实验(吲哚实验)、硝酸盐还原实验、硫化氢实验、ph4.5生长实验及运动性检查以初步判定是否为乳酸杆菌属，结果均为阴性的菌落初步判定为乳酸杆菌属。乳酸杆菌属生化反应鉴定结果见下表1，试验结果与《常见乳酸细菌生化鉴定表》比对，均符合乳酸杆菌属的生化特性。表1乳酸杆菌属生化反应鉴定结果注：“－”为阴性结果，“+”为阳性结果。将各纯化菌株挑至2ml灭菌mrs液体培养基中37℃培养24h，使用天根公司的细菌基因组提取试剂盒进行细菌基因组的提取。以纯化菌株基因组为模板进行16srdna分析，以12株乳酸杆菌的基因组为模板进行16srdna-pcr，12株乳酸杆菌基因组16srdnapcr结果见附图1。注：m：dna分子量标准dl2000；1-12对应的菌株编号分别为ce1、ce2、ce3、ce6、ce7、ce8、ce22、lr-co21、co59、j31、j32、j33；13.水对照电泳检测条带为1500bp左右，符合16srdna序列大小，且阴性对照无目的带。将12株乳酸杆菌基因组的16srdna-pcr产物测序结果经ncbi网站blast比对后可见均为罗伊氏乳杆菌，12株罗伊氏乳杆菌的16srdna序列已上传至genbank，结果如表2。12株菌株分别命名为ce1、ce2、ce3、ce6、ce7、ce8、ce22、lr-co21、co59、j31、j32及j33。表212株罗伊氏乳杆菌的genbank登录号分离株鉴定种属genebank登录号ce1lactobacillusreuterimk602697ce2lactobacillusreuterimk920154ce3lactobacillusreuterimk920158ce6lactobacilusreuterimk920160ce7lactobacillusreuterimk920161ce8lactobacillusreuteriemk920162ce22lactobacillusreuterimk920163lr-co21lactobacillusreuterimk920155co59lactobacilusreuterimk920992j31lactobacillusreuterimk921700j32lactobacilusreuterimk921816j33lactobacilusreuterimk922076菌株的生物学特性检测：生长曲线及产酸能力测定：将12株罗伊氏乳杆菌活化3代，调整od600＝1.0±0.02，以体积比为1：100的比例接种到无抗灭菌mrs中，每隔2h测定相应的od600值，监测24h，同时以ph计测定菌液的ph值，绘制各株罗伊氏乳杆菌的生长曲线及产酸趋势图，其中，12株罗伊氏乳杆菌的生长曲线图见附图2，12株罗伊氏乳杆菌的产酸趋势图见附图3，由产酸趋势曲线可知，在菌体生长对数期时产酸能力呈线性趋势，表明产酸能力最旺盛，而后产酸速率减缓直至ph值在一定范围内波动。12株罗伊氏乳杆菌在培养24h后均能将培养液的初始ph值由5.75降至4.0。抑菌性能测定：将12株罗伊氏乳杆菌活化3代，以体积比为1：100的体积比例接种到10ml灭菌mrs液体培养基，37℃培养24h后用0.45μm的滤器过滤菌液，制备无细胞上清液(cfs)。将致病菌f4+产肠毒素大肠杆菌eteccvcc230、金黄色葡萄球菌cvcc546、鼠伤寒沙门氏菌sl1344及鸡白痢沙门氏菌cvcc578培养至od600为0.5后取200μl涂布于lb琼脂平板，以6mm打孔器进行打孔，每板5个孔，3个孔放200μl罗伊氏乳杆菌无细胞上清液(cfs)，剩余2个孔分别加入等量的mrs液体培养基和青/链霉素原液(10000u/ml)37℃培养24h后取出。用毫米尺量取抑菌环直径，抑菌环边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限，12株罗伊氏乳杆菌体外抑菌试验抑菌环直径见下表3。12株菌之间的抑菌活性比较结果见附图4-7，其中，12株菌发酵后制得的无细胞上清对f4+产肠毒素大肠杆菌eteccvcc230的抑菌结果图见附图4、12株菌发酵后制得的无细胞上清对金黄色葡萄球菌cvcc546的抑菌结果图见附图5、12株菌发酵后制得的无细胞上清对鼠伤寒沙门氏菌sl1344的抑菌结果图见附图6、12株菌发酵后制得的无细胞上清对鸡白痢沙门氏菌cvcc578的抑菌结果图见附图7。12株罗伊氏乳杆菌对f4+etec、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均有一定作用的抑菌效果；仅有ce2和ce8对在对鸡白痢氏菌有抑制作用。表312株罗伊氏乳杆菌体外抑菌试验抑菌环直径(mm)体外黏附试验：将状态良好的caco-2细胞消化后滴加6孔细胞培养板中，每孔1ml，37℃，5％co2培养箱中培养；细胞长至单层时，用pbs(ph7.4)洗涤2次；每孔加入1ml菌悬液(108cfu/ml)和1mldmem(不含双抗)，37℃孵育2h；用无菌pbs洗3遍，以除去未粘附的细胞。然后加入1ml1％的triton-100消化5min，待细胞完全脱离后加入0.5mldmem终止反应。将混合物转移到2ml无菌ep管中，经系列稀释后平板计数计算粘附的细菌数。以鼠李糖乳酸杆菌lggat7469作为指示菌株，12株罗伊氏乳杆菌体外粘附caco-2细胞，以粘附之前的菌液活菌计数结果为对照，计算12株罗伊氏乳杆菌的粘附率，12株罗伊氏乳杆菌体外粘附能力测定结果图见附图8。指示菌株鼠李糖乳酸杆菌lggat7469为14.83％；lr-co21菌株体外粘附能力(26.22％)极显著高于指示菌株(p<0.01)；ce22、j31、j32、j33的粘附率(10.76％-13.25％)与指示菌株差异不显著；其余7株罗伊氏乳杆菌的粘附率均极显著低于指示菌株(p<0.01)，范围为4.33％-9.81％。胞外多糖(eps)产量的测定：配比建立苯酚硫酸法测定胞外多糖产量的标准曲线图见附图9。将12株罗伊氏乳杆菌以体积比1：100的比例接种到50ml灭菌mrs液体培养基中，37℃培养24h，8000rpm/min，4℃离心10min，收集上清，加入150ml预冷的95％乙醇4℃过夜后10000rpm/min离心10min收集沉淀，用1ml灭菌去离子水溶解沉淀。用苯酚-硫酸法测定胞外多糖的产量。参照标准曲线计算12株罗伊氏乳杆菌的胞外多糖产量，12株罗伊氏乳杆菌的胞外多糖产量测定结果图见附图10。由标准曲线可知，相关系数r＝0.999，近似于1，表明葡萄糖溶液的浓度与od490呈正相关，故此建立的标准曲线可用于后续罗伊氏乳杆菌胞外多糖产量的测定。根据测定结果可知，lr-co21号罗伊氏乳杆菌菌株胞外多糖产量为303mg/l，极显著高于其他11株(p<0.01)；ce1的产量为291mg/l，仅次于co21株且极显著高于其他10株(p<0.01)；ce22、j31产量为280mg/l；ce2、ce3、ce6、co59、j33的eps产量无显著差异(267-272mg/l)；ce7、ce8、j32的eps产量最低(231-256mg/l)。耐酸试验：将12株罗伊氏乳杆菌活化3代，调整od600至1.0±0.02，以菌液体积/液体培养基体积比为1：100的比例分别接种到无抗灭菌mrs(ph5.75)、ph2.0的mrs、ph3.0的mrs中(以1mol/l浓度的hcl调节)，37℃培养3h后以灭菌pbs进行倍比稀释，涂布于mrs琼脂平板。37℃培养24h后进行活菌计数。按以下公式计算存活率：存活率％＝(试验组活菌数/对照组活菌数)×100％。耐胆盐试验：将12株罗伊氏乳杆菌活化三代，调整od600至1.0±0.02，以菌液体积/液体培养基体积为1：100的比例分别接种到无抗灭菌mrs、含有0.1％猪胆汁盐的mrs、含有0.3％猪胆汁盐的mrs中，37℃培养3h后以灭菌pbs进行倍比稀释，涂布于mrs琼脂平板。37℃培养24h后进行活菌计数。按以下公式计算存活率：存活率％＝(猪胆汁盐中活菌数/对照组活菌数)×100％。结果见表4，12株罗伊氏乳杆菌对酸性条件及不同浓度猪胆汁盐的耐受性能，12株罗伊氏乳杆菌的胆汁盐耐受性能。除j32对胆盐不耐受外，余下11株罗伊氏乳杆菌均可耐受0.3％浓度的的猪胆盐；ce2、ce6、ce7、j33在酸性条件下具有较好的存活率。表412株罗伊氏乳杆菌对酸性条件及不同浓度猪胆汁盐的耐受性能人工胃肠液耐受试验：将12株罗伊氏乳杆菌培养至活菌数为1×108cfu/ml后，于人工胃液中孵育2h后活菌计数，同时将胃液处理后的菌悬液加入到人工肠液中孵育2h、4h、8h后分别进行活菌计数，以各时间点的活菌数与加入胃液/肠液处理前活菌数的比值为存活率，进行12株罗伊氏乳杆菌人工胃肠液耐受性能的比较。结果见表5，12株罗伊氏乳杆菌人工胃肠液耐受性结果。12株罗伊氏乳杆菌均可在人工胃液处理2h后具有良好的存活能力；ce1、ce8、lr-co21在模拟肠液处理8h后仍可存活。表512株罗伊氏乳杆菌人工胃肠液耐受性结果注：同一列内上标字母不同表示组间差异显著(p<0.05)高温耐受性实验：将12株罗伊氏乳杆菌活化3代，第3代37℃培养3h，调整od600至1.0±0.02，以菌液体积/液体培养基体积比为1：100的比例分别接种到无抗灭菌mrs中，分别于50℃、60℃水浴锅孵育5min，10min、15min后，以无菌pbs进行倍比稀释，涂布于mrs琼脂平板。以37℃培养同等时间的菌株作为对照。37℃培养24h后进行活菌计数。按以下公式计算存活率：存活率％＝(对应温度活菌数/对照组活菌数)×100％。将过夜培养的罗伊氏乳杆菌菌液分别在50℃和60℃中分别作用5min、10min、15min后进行活菌计数，以37℃的菌液作为对照，计算存活率。结果见表6，12株罗伊氏乳杆菌高温耐受性结果。由结果可知，12株罗伊氏乳杆菌均可在50℃及60℃处理条件下存活；lr-co21、co59及j32在经60℃处理15min后存活率(20.15％-35.64％)极显著高于其他9株罗伊氏乳杆菌(0.37％-10.14％)。表612株罗伊氏乳杆菌高温耐受性结果药物敏感性试验：采用杭州滨和微生物试剂有限公司的革兰氏阳性球菌药敏试剂盒(扩散法)进行药敏实验。将12株罗伊氏乳杆菌活菌数调整至1×108cfu/ml(od600＝1.0±0.02)，以金黄色葡萄球菌cvcc546作指示菌，涂板，平板在室温下干燥3-5min，用灭菌镊子夹取药敏纸片分别铺到涂布有各株罗伊氏乳杆菌的mrs琼脂平板上，轻轻压实。每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。贴好纸片后在15min内放到37℃温箱24h后取出。用毫米尺量取抑菌环直径，抑菌环边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。参照《纸片法药敏实验抑菌环直径判断标准(非苛养菌)》判读结果，按敏感(s)、中介(i)、耐药(r)报告。将12株罗伊氏乳杆菌进行15种抗生素的药敏实验，以金黄色葡萄球菌cvcc546为指示菌株，12株罗伊氏乳杆菌的药敏实验结果见表7。由结果知，lr-co21对克林霉素敏感；lr-co21对氯霉素敏感；lr-co21对青霉素g敏感。表712株罗伊氏乳杆菌的药敏实验结果注：s为敏感，r为不敏感，i介于敏感和不敏感之间。抗氧化能力测定：将12株罗伊氏乳杆菌培养24h后制备无细胞上清液(cfs)。在5ml的离心管中加入0.12mmol/ldpph1.9ml，样品(cfs)0.1ml，室温静置20min，在526nm处测定吸光值。以50％乙醇为空白对照，每组设3个重复。按以下公式计算清除率：清除率％＝1－[(a－b)/a0]×100％注：a0：未加样的dpph(1.9mldpph+0.1ml50％乙醇)的od600值；a：样品与dpph反应后(1.9mldpph+0.1ml样品)的od600值；b：样品空白(1.9ml50％乙醇+0.1ml样品)的od600值。以12株罗伊氏乳杆菌培养24h的无细胞上清液对dpph自由基进行清除能力的测定，在测定od517后计算抗氧化能力，12株罗伊氏乳杆菌抗氧化能力计算结果图见图11。由结果知，ce8对dpph自由基的清除能力(85.73％)显著高于ce2(72.32％)，并极显著高于其他10株罗伊氏乳杆菌；ce1、ce3、ce6、ce7、ce22、lr-co21、j31、j33这8株罗伊氏乳杆菌的抗氧化能力范围为55.92％至69.84％之间且差异不显著。细胞表面特性试验：(1)疏水性测定：表面疏水性采用微生物黏着碳烃化合物法(bath)进行测定。静置培养，离心，弃上清，收集菌体沉淀。菌体用灭菌的pbs(ph7.2)，并调整od600至1.0±0.02(a0)，取菌悬液与二甲苯混匀后在室温静置(此时形成两相体系)。将两相体系涡旋震荡后再静置，重新形成为两相体系(水相和有机相)。小心吸取水相，在下测定吸光度(a1)。细胞表面疏水性按如下公式计算(取三次重复实验的平均值)：hydrophobicity％＝{1-a1/a0}×100％。利用微生物黏着碳烃化合物法(bath)测定od600后计算各菌株的表面疏水率，12株罗伊氏乳杆菌表面疏水率图见图12。由结果知，ce1菌株表面疏水率最高为86.91％；其余10株罗伊氏乳杆菌菌株表面疏水率与ce1差异不显著，范围为46.97％至73.06％，由高到低分别为co59、j32、ce6、ce8、j31、ce3、ce2、j33、lr-co21和ce22；ce7菌株表面疏水率最低为41.90％。(2)自聚合能力测定：将新鲜培养的菌液在室温下离心弃上清，收集菌体。菌体用灭菌的pbs(ph7.2)溶液洗涤两次，并重悬于pbs溶液中，调整od600至0.5±0.02(a0h)。然后将的细胞悬液涡旋震荡，于37℃静置2h。小心吸取静置后的上清，测定其在的吸光度(a2h)。自聚合能力按如下公式计算(取三次重复实验的平均值)：autoaggregation％＝1-[a2h/a0h]×100％。罗伊氏乳杆菌菌悬液经37℃静置2h后测定od600，计算得到12株罗伊氏乳杆菌的自聚合能力图见图13。由结果知，12株罗伊氏乳杆菌的自聚合能力无显著差异，其能力由高到低分别为ce6、j33、ce22、lr-co21、co59、j31、j32、ce2、ce3、ce1、ce7、ce8。(3)体内定植试验：a:cfda-se标记菌体阳性率的测定：利用cfda-se(二乙酰羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯)染料进行罗伊氏乳杆菌lr-co21菌株的菌体荧光标记。用无菌的pbs按照1：800的比例将10mmcfda-se储存液稀释成工作液。培养罗伊氏乳杆菌至od600＝1.0时，5000r/min离心5min，弃去上清，加入无菌的pbs重悬菌体，再加入等量cfda-se工作液，37℃水浴作用30min；5000r/min离心5min，弃去上清，pbs重悬沉淀并洗涤菌体两次，向菌体中加入适量的pbs后，使菌液浓度为5×109cfu/ml。用0.75％的甲醛溶液固定。采用流式细胞术，测定阳性标记率。b：用于仔猪体内定植实验菌体的制备：将活化3代的lr-co21以1：100比例接种到500ml无菌液体mrs培养液中，37℃静置培养24h。无菌分装到50ml离心管中，在4℃，5000rpm/min条件下离心，收集菌体，以20ml生理盐水悬起菌体沉淀，使菌液浓度为5×109cfu/ml，以稀释成工作浓度的cfda-se染料标记菌体后，用锡纸包裹离心管，4℃避光备用。c：lr-co21菌株仔猪体内定植试验：16头3日龄新生杜长大仔猪连续灌服3d经cfda-se标记的罗伊氏乳杆菌lr-co212ml(5×109cfu/ml)，对照组灌服同等剂量的生理盐水。在灌胃后第4d、7d、10d、14d时，每组2头仔猪分别取十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠肠段，刮取肠黏液，用1ml无菌pbs重悬，经200目铜网过滤后，流式检测各肠段样品，测定lr-co21仔猪各肠段的定植率。以荧光染料cfda-se标记lr-co21，以流式分析检测标记阳性率，流式分析检测荧光染料cfda-se标记阳性率试验中无标记对照图见图14；流式分析检测荧光染料cfda-se标记阳性率试验中标记菌株图见图15，由结果知标记物的峰集中，表明绝大多数菌体均被标记上，检测结果表明标记阳性率为84.2％。在连续灌服饲喂罗伊氏乳杆菌lr-co21后第4d、7d、10d、14d，分别取仔猪各肠段肠黏液检测罗伊氏乳杆菌lr-co21在仔猪体内不同肠段的定植率，流式细胞术检测结果见图16-24，图16为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色十二指肠感染组；图17为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色十二指肠对照组；图18为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色十二指肠饲喂组；图19为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色空肠感染组；图20为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色空肠对照组；图21为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色空肠饲喂组；图22为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色回肠感染组；图23为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色回肠对照组；图24为本发明具体实施方式的体内定植试验中肠道组织切片he染色回肠饲喂组；罗伊氏乳杆菌lr-co21在仔猪体内定植能力的测定结果见表8。罗伊氏乳杆菌lr-co21在饲喂后第4d在仔猪各肠段均可定植；第7-10d可检测到在仔猪十二指肠、空肠、回肠、盲肠定植效果较好；第14d在小肠内仍有较强的定植能力，以空肠段定植效果最显著。表8罗伊氏乳杆菌lr-co21在仔猪体内定植能力的测定结果对照组喂菌后4d喂菌后7d喂菌后10d喂菌后14d十二指肠(parent％)22.9±5.4a62.3±10.3b61.9±13.1b46.6±15.9c39.9±8.8c空肠(parent％)30.6±7.3a82.9±15.4b61.5±9.9c51.5±9.2c49.1±14.7c回肠(parent％)32.4±7.6a52.3±12.2b52.2±16.2b68.5±19.4c46.6±11.2b盲肠(parent％)51.1±5.7a92.6±7.2b60.8±17.7c73.6±15.9c58.3±18.9a结肠(parent％)70.2±11.7a95.7±4.2b79.4±21.2a78.3±16.3a74±16a综上所述，罗伊氏乳杆菌lr-co21是分离各菌株中，综合性能最好的，因此，本申请在菌株分离鉴定以后，得到的lr-co21菌株是最适合作为益生菌应用于养殖行业。实施例将保藏的罗伊氏乳杆菌lr-co21液体接种活化3代，以体积比为1：100比例接种到500mlmrs培养液中，37℃静置培养24h。无菌分装到50ml离心管中，在4℃，5000rpm/min条件下离心，收集菌体，以20ml生理盐水悬起菌体沉淀，使菌液浓度为5×109cfu/ml，4℃备用。实验选取杜长大3日龄新生仔猪24头，根据体重和窝源相近的原则随机分成3组，每组8头，分别为正常对照组、饲喂罗伊氏乳杆菌+etec感染组(饲喂组)和未饲喂罗伊氏乳杆菌+etec感染组(感染组)。饲喂组每头新生仔猪灌服罗伊氏乳杆菌(5×109cfu/ml，2ml/头·天)，其余两组每日灌服等量的生理盐水。连续灌胃7d。对实施例中的连续灌胃7d的仔猪，再连续3d对感染组和饲喂组仔猪口服感染f4+产肠毒素大肠杆菌etec(1×108cfu/ml，4ml/头·天)。试验例一、罗伊氏乳杆菌lr-co21株抵抗仔猪感染f4+产肠毒素大肠杆菌etec的效果分析：(1)对新生仔猪f4+产肠毒素大肠杆菌etec腹泻的影响：测定各组仔猪感染前后的体重及观察仔猪腹泻情况，结果见表9。由结果可知，在感染前后饲喂组显著增加了仔猪日增重，并可显著降低腹泻率(p<0.05)。表9罗伊氏乳杆菌lr-co21对仔猪感染前后日增重及腹泻率的影响(2)对感染仔猪小肠黏膜组织形态的影响：感染后分别取3组仔猪的十二指肠、空肠和回肠做肠道组织切片he染色，结果见图16-24，用软件moticimage2000分析小肠绒毛长度、隐窝深度以及绒毛长度与隐窝深度的比值，结果见表10。由结果知，饲喂组与感染组仔猪相比，显著增加了仔猪十二指肠、空肠和回肠绒毛长度及绒毛长度/隐窝深度的比值(p<0.05)；3组仔猪小肠隐窝深度无显著差异。he染色结果表明感染组仔猪十二指肠绒毛组织松散，内有大量炎性细胞浸润，杯状细胞死亡较多，肠隐窝受损严重；饲喂组相比感染组仔猪症状明显减轻，但肠隐窝上皮细胞也有一定坏死。感染组空肠肠绒毛内中央乳糜管模糊不清，大量炎性细胞浸润，肠隐窝较多损坏；饲喂组炎性细胞减少但隐窝上皮细胞有少量坏死；感染组回肠肠绒毛断裂，上皮细胞坏死，隐窝数量减少，回肠基底部肌层肌肉细胞玻璃样变与基底部剥离，此病变在饲喂组稍有恢复，且绒毛断裂变少。表10罗伊氏乳杆菌对仔猪小肠绒毛及隐窝的影响注：同一行内上标字母不同表示组间差异显著(p<0.05)(3)感染仔猪肠道主要微生物菌群的影响在对各实验组仔猪结肠和盲肠内容物取样后，分析各组肠内容物的总大肠杆菌、乳酸杆菌、链球菌和双歧杆菌微生物数量的结果见表11。感染组大肠杆菌数量较对照组显著上调(p<0.05)，饲喂组与感染组大肠杆菌数量虽在同一水平(差异不显著)，但前者大肠杆菌数量低于后者；感染组肠道内容物乳酸杆菌和双歧杆菌数量较对照未感染组显著下调，饲喂组较对照组数量显著增多；3组实验组的链球菌在感染前后的数量均在同一水平。表11感染仔猪肠内容物的总大肠杆菌、乳酸杆菌、链球菌和双歧杆菌微生物数量注：微生物数量表示为log(拷贝数/克)。同一行内上标字母不同表示组间差异显著(p<0.05)(4)实时荧光定量pcr定量分析f4+产肠毒素大肠杆菌etec在仔猪肠道的含量19t-faeg质粒拷贝数标准曲线见图25，以质粒拷贝数的对数为纵坐标，以循环数阈值为横坐标作标准曲线。r2值为0.9925，表明循环数阈值与标准质粒拷贝数的对数之间存在显著的线性关系。利用实时荧光定量pcr检测仔猪十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠中的f4+产肠毒素大肠杆菌etec数量结果图见图26，结果表明，饲喂组和感染组仔猪各段肠道内f4+产肠毒素大肠杆菌etec数量均显著高于正常对照组(p<0.01)，饲喂组与感染组仔猪相比可显著降低各肠段的f4+产肠毒素大肠杆菌etec数量(p<0.01)。注：“*”代表与对照组比较，“#”代表与感染组比较。“*”及“#”代表差异显著(p<0.05)，“**”及“##”代表差异极显著(p<0.01)。(5)感染仔猪免疫器官指数的影响3组仔猪免疫器官指数的分析结果见图27-28。图27为本发明试验例中仔猪免疫器官指数的分析胸腺指数图；图28为本发明试验例中仔猪免疫器官指数的分析脾脏指数图；由结果知，感染f4+产肠毒素大肠杆菌etec后，饲喂组较感染组仔猪免疫器官胸腺和脾脏指数显著上升(p<0.05)，表明罗伊氏乳杆菌可以对仔猪免疫器官的发育产生促进作用。(6)对感染仔猪免疫球蛋白的影响利用elisa检测试剂盒检测各组仔猪血清中的igg及肠黏液中siga，结果见图29-30，图29为elisa检测试剂盒检测各组仔猪血清中的igg含量图；图30为elisa检测试剂盒检测各组仔猪肠粘膜中siga含量图。由上述结果知，在感染后，饲喂组较感染组仔猪极显著上调血清中igg及空肠肠黏液中的siga的含量(p<0.01)，显著上调十二指肠、回肠肠黏液中的siga的含量(p<0.05)。(7)感染仔猪血清中炎性细胞因子的检测利用elisa检测试剂盒检测各组仔猪血清中的促炎因子il-1β、il-6、il-12及抗炎因子il-10含量，实时荧光定量pcr检测小肠组织mrna转录水平。结果见图31-38。图31为本发明试验例中elisa检测试剂盒检测感染后血清中促炎因子il-1β的含量图；图32为本发明试验例中实时荧光定量pcr检测感染后小肠组织中促炎因子il-1β的mrna转录水平图；图33为本发明试验例中elisa检测试剂盒检测感染后血清中促炎因子il-6的含量图；图34为本发明试验例中实时荧光定量pcr检测感染后小肠组织中促炎因子il-6的mrna转录水平图；图35为本发明感染后elisa检测试剂盒检测血清中抗炎因子il-10的含量图；图36为本发明试验例中实时荧光定量pcr检测感染后小肠组织中抗炎因子il-10的mrna转录水平图；图37为本发明试验例中elisa检测试剂盒检测感染后血清中促炎因子il-12的含量图；图38为本发明试验例中实时荧光定量pcr检测感染后小肠组织中促炎因子il-12的mrna转录水平图。由elisa检测结果可知，饲喂组与感染组相比，极显著下调仔猪血清中促炎因子il-1β、il-6及il-12的含量；极显著上调抗炎因子il-10的含量(p<0.01)。抗炎因子il-10mrna相对表达量在十二指肠、回肠组织中显著上调(p<0.05)；il-1β的mrna相对表达量在空肠中极显著下调(p<0.01)，在十二指肠和回肠中显著下调(p<0.05)；il-6的mrna相对表达量在回肠中极显著下调(p<0.01)，在十二指肠和空肠中显著下调(p<0.05)；il-12的mrna相对表达量在仔猪十二指肠、空肠、回肠肠组织中均极显著下调(p<0.01)。饲喂组相对于感染组仔猪，小肠组织中各细胞因子的变化水平总体趋势与血清中检测结果相一致，均可上调抗炎因子il-10，下调促炎因子il-1β、il-6及il-12。(8)紧密连接蛋白基因及tlr4、nf-κb、myd88相对表达量的检测荧光定量pcr检测感染后仔猪肠黏膜组织中紧密连接蛋白claudin-1、occludin和zo-1，tlr4，nf-κb及myd88的mrna相对表达含量，结果见图39-41以及42-44。图39为本发明试验例中荧光定量pcr检测感染后仔猪肠黏膜组织中紧密连接蛋白claudin-1的mrna相对表达量；图40为本发明试验例中荧光定量pcr检测感染后仔猪肠黏膜组织中紧密连接蛋白occludin的mrna相对表达量图；图41为本发明试验例中荧光定量pcr检测感染后仔猪肠黏膜组织中紧密连接蛋白zo-1的mrna相对表达量图；图42为本发明试验例中荧光定量pcr检测感染后仔猪肠黏膜组织tlr4的mrna相对表达量图；图43为本发明试验例中荧光定量pcr检测感染后仔猪肠黏膜组织中nf-κb的mrna相对表达量图；图44为本发明试验例中荧光定量pcr检测感染后仔猪肠黏膜组织中myd88的mrna相对表达量图；饲喂组较感染组极显著上调紧密连接蛋白claudin-1、occludin及zo-1在小肠组织中mrna的相对表达量(p<0.01)；极显著下调仔猪空肠、回肠肠组织中tlr4，nf-κb及myd88mrna相对表达量(p<0.01)。二、12株罗伊氏乳杆菌及其培养上清的细胞毒性检测及对tgev体外感染的抑制作用分析将st细胞用0.25％胰酶消化后，将细胞按100μl/孔接种于96孔细胞培养板中，待长成细胞单层后，弃去培养液。取菌悬液及培养上清，10倍梯度稀释，不同浓度各取100μl，接入96孔板中，同一个浓度设置8个平行孔。置于37℃、5％co2培养箱中培养90min后，pbs洗涤并加细胞维持液继续培养。同时设置细胞对照以及空白对照。待病毒对照组出现60％-80％病变时，每孔加入10μlcck-8试剂，37℃避光作用3-4h后，用酶标仪测定450nm处的吸光值。计算益生菌及其培养上清的最大无毒剂量。细胞毒性＝(细胞对照组od450-处理组od450)/(细胞对照组od450-空白组od450)实验结果：根据所得结果计算出，益生菌对st细胞的最大无毒剂量为108cfu/ml，培养上清对st细胞的最大无毒剂量为益生菌在109cfu/ml浓度下培养上清的1：2的稀释液。cck-8法检测12株罗伊氏乳杆菌及培养上清对tgev的体外抑制作用将st细胞用0.25％胰酶消化后，按100μl/孔接种于96孔细胞培养板中，5％co2、37℃培养24h长成细胞单层后，进行如下实验，同一个实验组设置8个平行孔。(1)益生菌或其培养上清预处理组：益生菌或其培养上清以最大无毒剂量预先接种于st细胞共培养90min，洗涤后以100tcid50/ml的tgev感染细胞，置于37℃、5％co2培养箱中吸附90min，pbs洗涤后加细胞维持液，继续培养。(2)病毒对照组：100tcid50/ml的tgev感染st细胞，置于37℃、5％co2培养箱中吸附90min，pbs洗涤后加细胞维持液，继续培养。(3)细胞对照组：更换细胞培养液为细胞维持液。待病毒对照组出现60％-80％病变时，每孔加入10μlcck-8试剂，37℃避光作用3-4h后，用酶标仪测定450nm处的吸光值。细胞存活率＝(处理组od450-空白组od450)/(细胞对照组od450-空白组od450)病毒抑制率＝(处理组od450-病毒对照组od450)/(细胞对照组od450-病毒对照组od450)根据测定结果，绘制12株罗伊氏乳杆菌对tgev的抑制率见表13。由表13可知，12株罗伊氏乳杆菌中，lr-co21对tgev的抑制率明显高于其他罗伊氏乳杆菌。因此，其作为益生菌能够更高效地抵抗tgev对猪小肠的侵染。表1312株罗伊氏乳杆菌对tgev的抑制率分离株上清菌体ce110.54±2.83％35.73±13.57％ce25.47±1.41％30.91±8.93％ce315.72±4.54％40.55±12.69％ce615.40±5.14％35.73±10.53％ce713.43±2.71％47.15±8.35％ce826.21±5.72％42.33±18.68％ce2215.35±4.25％39.87±9.17％lr-co2145.47±13.43％69.45±9.28％co595.17±1.98％30.91±6.26％j3117.03±3.92％32.7±7.18％j3222.58±12.19％47.15±17.32％j337.29±2.38％37.75±9.16％综上所述，lr-co21菌株能够有效增强仔猪对f4+产肠毒素大肠杆菌etec感染的抵抗力，降低腹泻率，有利于生长发育与增重。有效保护肠道黏膜，调节肠道菌群，抑制有害细菌生长，同时具有调节免疫机能的作用，对仔猪免疫器官的发育产生促进作用，调节免疫；同时lr-co21对tgev的感染也具有较强的抑制作用，此外，如前文中的描述，lr-co21的综合性能较好，包括抗逆性、抑菌性等，因此其作为益生菌推广具有良好的应用前景。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。当前第1页1 2 3