一种耐高氨氮HN-AD的菌株分离方法与流程

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种耐高氨氮hn-ad的菌株分离方法。

背景技术：

垃圾渗滤液是指来源于垃圾填埋场中垃圾本身含有的水分、进入填埋场的雨雪水及其他水分，扣除垃圾、覆土层的饱和持水量，并经历垃圾层和覆土层而形成的一种高浓度有机废水。而垃圾渗滤液是典型的高氨氮废水(氨氮浓度可高达数千mg/l)，因其成分复杂、污染物浓度高，引起的地表水、地下水、土壤污染等问题已受到全球关注。

目前，国内外处理垃圾渗滤液(高氨氮废水)的主要方法分为物化法、生物法、物化-生物联合法，对于污泥脱水液、厌氧消化液、焦化废液等可生化性差、氨氮浓度极高的废水，通常采用折点加氯、气提吹脱和离子交换等物化法进行处理；对于氨氮浓度在500-1500mg/l左右的废水，常采用物化-生物等多工艺联合进行处理，但物化法作为前端处理此类废水时普遍存在运行费用昂贵的缺点。传统生物脱氮技术易受游离氨影响，处理废水的氨氮浓度不宜超过300mg/l，虽然游离氨的控制技术已比较成熟，但脱氮过程中大量碱度的消耗及曝气等电耗同样导致处理成本高昂，所以目前利用传统微生物进行高氨氮废水的处理仍然存在瓶颈。

近年来，有研究者发现了特殊的hn-ad细菌，这类细菌具有同步硝化和反硝化的特性，在好氧条件下可在一个反应器中实现氨氮和总氮同步脱除，解决了硝化和反硝化过程的矛盾。通过对hn-ad菌属耐受高氨氮机制的解析，发现上述菌株具备高氨氮脱除的特性与其代谢通路和生存环境具有密切关系。一方面，hn-ad菌可实现氨氮、no3--n、no2--n三氮的同步脱除，不仅缩短了脱氮周期，而且降低了no2--n积累对菌体产生的毒害作用；另一方面，hn-ad菌属于异养需氧型微生物，氧气和基质的供应不仅加速了细胞的增殖分化，使其快速将氨氮同化为细胞成分，而且使细胞保持了较高的脱氮酶活性，从酶活层面加速了高氨氮的脱除。

然而采用传统的分离方法所获得的hn-ad菌株通常对氨氮的耐受性能差，其氨氮浓度大都在500mg/l以下，不仅菌株的驯化和分离周期总体偏长，而且菌株在高浓度氨氮条件下无法保持高效稳定的脱氮性能。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种耐高氨氮hn-ad的菌株分离方法，以克服现有分离技术存在的问题。本发明借助反应器快速进行耐高氨氮的hn-ad菌株驯化分离，缩短菌种分离周期，并使其在高氨氮条件下保证稳定的氨氮去除效果。

本发明的技术方案是：

种耐高氨氮hn-ad的菌株分离方法，有以下步骤：

1)取垃圾渗滤液作为菌种，富集，得到富集菌种；

2)菌种驯化

2.1低氨氮浓度驯化

富集菌种接入反应器的模拟废水中，设置初始氨氮浓度为100mg/l开始驯化，待反应器中的模拟废水的氨氮全部去除(氨氮浓度低于10mg/l)后(用纳氏试剂分光光度法检测反应器中的氨氮浓度，氨氮去除率≥95％时判断为全部去除)待中的氨氮低于10mg/l后，更换反应器中的模拟废水，提高模拟废水氨氮浓度至200mg/l，重复，至菌种氨氮耐受浓度为300mg/l，氨氮去除率≥90％，得到低氨氮浓度驯化的菌液；

2.2中氨氮浓度驯化

取步骤2.1所述的低氨氮浓度驯化的菌液，至新的反应器中，将所述菌液的氨氮浓度从300mg/l逐渐提高到700mg/l，氨氮去除率≥80％，得到中氨氮浓度驯化的菌液；

2.3高氨氮浓度驯化

取中氨氮浓度驯化的菌液，至新的反应器中，将所述菌液的氨氮浓度从700mg/l逐级提高到1100mg/l，氨氮去除率≥70％，驯化结束，得到耐高氨氮hn-ad的混合菌液；

3)梯度稀释

取步骤2.3所述的混合菌液按10-1-10-7进行梯度稀释，涂布在固体培养基上(平板直径为：15-20cm)，于25-35℃培养，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一固体培养基上，分区、划线(每个分区只挑取一次菌落，均匀划线3～5条)，分别于25-35℃培养，至生成的菌落为不同形态的单一菌落(独立且不与其他菌落相连的菌落)，得到耐高氨氮hn-ad的菌株。

步骤1)所述垃圾渗滤液的初始氨氮浓度为1800-2000mg/l。

步骤1)所述富集的方法是，取垃圾渗滤液接种于异养硝化培养基，充分摇匀，30℃、170r/min条件下培养，2d后4℃保存，按接种量为5％，将富集菌液接种于异养硝化培养基上，相同条件富集传代3次。

步骤2)低氨氮浓度驯化中去除氨氮的时间为2～3天；中氨氮浓度驯化中去除氨氮的时间为4～5天；高氨氮浓度驯化中去除氨氮的时间为6～7天。

步骤2.1所述模拟废水的碳氮比为10-20：1，ph为7.0-11.0。

步骤2.1所述反应器由恒温加热搅拌器、容器、气泵组成。

所述分离培养基由c6h5o7na311.47-45.87g/l，(nh4)2so43.77-7.54g/l，微量元素50ml/l组成；加水混合灭菌溶解制得，碳氮比为10-20:1。

所述固体培养基由c6h5o7na311.47-45.87g/l，(nh4)2so43.77-7.54g/l，15-20g/l琼脂粉，微量元素50ml/l组成；加水混合灭菌溶解制得，碳氮比为10-20:1。

所述异养硝化培养基由c6h5o7na31.43-31.53g/l，(nh4)2so40.47-5.19g/l，微量元素50.0ml/l，加水混合灭菌溶解制得，碳氮比为10-20:1。

所述微量元素组成为：mgso4.7h2o2g/l，mnso4.h2o0.1g/l，cacl21.5g/l，feso4.7h2o0.1g/l，k2hpo45.0g/l。

本发明所述方法得到的具有hn-ad功能的纯菌株醋酸钙-不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)tnj-1不仅能耐受高氨氮，而且具备异养硝化-好氧反硝化功能，所述菌株在高氨氮条件下可以高效脱除氨氮、总氮，较好克服了前述传统生物处理中存在的问题，并且大大的缩短了驯化和分离的周期，保证了脱氮性能的稳定。

采用本发明所述方法从填埋场垃圾渗滤液中分离得到了纯菌株，dna测序委托重庆擎科生物公司完成，其16srdna序列如seqidno:1所述，后将其命名为醋酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)tnj-1。该菌株的保藏编号为：cctccno：m2019726，分类命名为醋酸钙不动杆菌tnj-1(acinetobactercalcoaceticustnj-1)，保藏日期：2019年9月17日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

采用该方法获得的纯菌株醋酸钙不动杆菌tnj-1(acinetobactercalcoaceticustnj-1)在处理高氨氮废水时，具有一体化程度高、工艺流程简洁、运行管理难度低等优点，且菌株生长繁殖快、耐受能力强，易于形成优势菌，可实现处理效果好，经济效益高的脱氮目标，有助于解决高氨氮废水生物脱氮的难题，具有广阔的应用前景。

采用本发明得纯菌株有以下优点：能以葡萄糖、柠檬酸钠、琥珀酸钠等多种有机物为碳源和硫酸铵、氯化铵为氮源生长，克服了传统硝化细菌生长缓慢、世代周期长、生物量浓度较低、环境适应性弱等缺点；可在完全好氧条件下实现氨氮、no3--n、no2--n三氮的同步脱除，解决了传统生物脱氮工艺好氧厌氧结合的两段式生物脱氮限制；对氨氮具有高耐受性，可高效去除废水中的氨氮，并且脱氮性能稳定。

本方法采用由恒温加热搅拌器、玻璃容器、气泵等组成的反应器，满足了脱氮菌种对于溶解氧和营养物质的需求，便于氨氮浓度、ph、温度、溶解氧等参数的调节。该反应器不仅能持续不断的为脱氮菌提供空气，维持相对稳定的溶氧条件，还能能自动控制温度；每24h检测氨氮浓度后，补充氨氮与其他营养物质，使氨氮始终维持在一个相对稳定的水平。相比传统的采用锥形瓶等常规器皿进行hn-ad菌种驯化，本发明在保证脱氮效果的基础上，使得脱氮性能稳定的菌种持续保持了活性，为后序菌种的分离奠定了基础。相较于传统微生物2-3个月的驯化周期，采用本发明所述方法，驯化方式节省了近一半时间，而且反应器培养条件与真实废水处理条件相似，相较于锥形瓶所提供的环境而言，大大增加了菌种实际应用的可能性。

相对于常见的细菌划线分离平板多数直径为10cm，本发明所述方法采用了梯度稀释，选取了直径为20cm的平板进行涂布和四分区划线，相同的菌液量涂布和划线的面积越大，产生单菌落的可能性越大。此方法不仅保证了平板菌种浓度的最大比例稀释，加速了hn-ad纯菌株的分离，而且进一步节省了重复多次划平板进行分离的时间。

附图说明

图1为本发明所述方法所使用的反应器；其中，其中，1为气泵，2为恒温加热搅拌器，3为气爆器，4为温度探头，5为容器；

图2为采用本发明所述方法获得的混合菌种在驯化阶段对氨氮的去除曲线；

图3为采用本发明所述方法获得的纯菌株醋酸钙-不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)tnj-1对不同浓度氨氮的去除曲线；

图4为采用本发明所述方法获得的纯菌株纯菌株醋酸钙-不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)tnj-1对不同浓度no3--n、no2--n的去除曲线。

具体实施方式

1.实验材料

固体培养基的组成：c6h5o7na321.50g/l，(nh4)2so44.71g/l，琼脂粉20.0g/l，微量元素50ml/l，加水混合灭菌溶解制得，碳氮比为15:1。

分离培养基的组成：c6h5o7na317.21g/l，(nh4)2so43.77g/l，微量元素50ml/l，加水混合灭菌溶解制得，碳氮比为15:1。

异养硝化培养基的组成：c6h5o7na314.33g/l，(nh4)2so44.71g/l，微量元素50ml/l；加水混合灭菌溶解制得，碳氮比为10:1。

微量元素组成为：mgso4.7h2o2g/l，mnso4.h2o0.1g/l，cacl21.5g/l，feso4.7h2o0.1g/l，k2hpo45.0g/l，溶剂为蒸馏水。

本发明所述试剂均为市售分析纯产品。

本实施例垃圾渗滤液取自重庆市长寿区马家沟城市生活垃圾填埋场(重庆市长寿区马家沟)。

2.本发明所述方法的步骤

(1)菌种富集：

取5ml垃圾渗滤液接种于装有100ml灭菌后的异养硝化培养基的250ml三角瓶中，充分摇匀，30℃、170r/min条件下培养，2d后4℃冰箱保存，然后按接种量为5％，将富集菌液接种于装有100ml异养硝化培养基的250ml三角瓶中，上述相同条件下传代培养，共富集传代3次，得到富集菌种。

所述垃圾渗滤液的初始氨氮浓度为1800-2000mg/l。

(2)菌种驯化：

低氨氮浓度驯化阶段，取步骤(1)所述的富集菌种接入装有1l模拟废水的反应器(参见图1)中，设置初始氨氮浓度为100mg/l开始驯化，待反应器中的氨氮全部去除(氨氮浓度低于10mg/l)后更换反应器中的废水，提高模拟废水中的氨氮浓度至200mg/l，重复以上操作，至菌种氨氮耐受浓度提升至300mg/l，可以保证氨氮去除率≥90％；所述模拟废水的碳氮比为10-20：1，ph为7.0-11.0。

随后进行中等氨氮浓度驯化阶段，待菌种低氨氮浓度驯化阶段结束(氨氮浓度低于30mg/l)后，从反应器中按7％的接种量将菌液接种至新的反应器中，将模拟废水的氨氮浓度从300mg/l逐级提高到700mg/l，可以保证氨氮去除率≥80％；

最后是高氨氮浓度驯化阶段，待菌种中等氨氮浓度驯化阶段结束(氨氮浓度低于140mg/l)后，从反应器中按10％的接种量将菌液接种至新的反应器中，将模拟废水的氨氮浓度从700mg/l逐级提高到1100mg/l，保证氨氮去除率≥70％，即得到了耐高氨氮hn-ad的混合菌液。

低氨氮浓度驯化中去除氨氮的时间为2～3天；中氨氮浓度驯化中去除氨氮的时间为4～5天；高氨氮浓度驯化中去除氨氮的时间为6～7天。

菌种驯化所有阶段控制ph值在7.5-8，温度30-32℃，溶解氧控制在3-5mg/l。

参见图1，所述反应器由气泵1，恒温加热搅拌器2，容器5等组成；其中气泵1与气爆器3依次通过导气管连接，气爆器位于容器5中，温度探头4与为恒温加热搅拌器2电连接。

(3)梯度稀释：

用已冷却的无菌蒸馏水对上述耐高氨氮hn-ad的混合菌液进行10倍系列稀释，制成稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀释液，将稀释液涂布在固体培养基上，于30℃-32℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行四分区反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌种，即得到了耐高氨氮hn-ad的菌株。

3.菌种鉴定

提取上述所述的耐高氨氮hn-ad菌株的dna片段作为目的片段，使用qiaquickgenomicdnabufferset进行pcr扩增目的片段。取5μl进行3％琼脂糖凝胶电泳，使用切胶回收目的片段进行dna测序。dna的测序委托重庆擎科生物公司完成。以seqforward、seqreverse、seqinternal为引物进行dna测序，得到醋酸钙-不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)tnj-1，其dna序列如seqidno:1所示：

cgccctctttgcagttaggctagctacttctggtgcaacaaactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcattctgatccgcgattactagcgattccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccggactacgatcggctttttgagattagcatcacatcgctgtgtagcaaccctttgtaccgaccattgtagcacgtgtgtagccctggccgtaagggccatgatgacttgacgtcgtccccgccttcctccagtttgtcactggcagtatccttaaagttcccgacattactcgctggcaaataaggaaaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtatgtaagttcccgaaggcaccaatccatctctggaaagttcttactatgtcaaggccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttagtcttgcgaccgtactccccaggcggtctacttatcgcgttagctgcgccactaaagcctcaaaggccccaacggctagtagacatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccatgctttcgcacctcagcgtcagtgttaggccagatggctgccttcgccatcggtattcctccagatctctacgcatttcaccgctacacctggaattctaccatcctctcccacactctagctaaccagtatcgaatgcaattcccaagttaagctcggggatttcacatttgacttaattagccgcctacgcgcgctttacgcccagtaaatccgattaacgcttgcaccctctgtattaccgcggctgctggcacagagttagccggtgcttattctgcgagtaacgtccactatctctaggtattaactaaagtagcctcctcctcgcttaaagtgctttacaaccataaggccttcttcacacacgcggcatggctggatcagggttccccccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggcggatcatcctctcagacccgctacagatcgtcgccttggtaggcctttaccccaccaactagctaatccgacttaggctcatctattagcgcaaggtccgaagatcccctgctttctcccgtaggacgtatgcggtattagcatccctttcgagatgttgtcccccactaataggcagattcctaagcattactcacccgtccgccgctaagatcagtagcaagctacctctctccgctcg

16srrna扩增采用广谱引物f27(seqidno:2-agagtttgatcatggctcag)和r1492(seqidno:3-tacggttaccttgttacgactt)。

实施例1耐高氨氮兼具hn-ad功能的菌株分离方法获得的混合菌种在驯化阶段对氨氮和总氮的去除能力测定实验

配置氨氮浓度为1000mg/l的异养硝化培养基，取100ml异养硝化培养基于250ml锥形瓶中，将其在121℃条件下高温蒸汽灭菌30min，待冷却后用移液枪向瓶中加入2ml驯化完成的混合菌液(耐高氨氮hn-ad的混合菌液)(od600nm为1-2)，采用封口膜密封，放入摇床设定在30℃、170r/min条件下培养，然后每隔24h测定菌液的od600nm值确定菌体生长情况，同时测定异养硝化培养基中氨氮和总氮的含量，确定氨氮的去除效果，由图2可知，混合菌种在4天内基本完全去除1000mg/l氨氮，去除率最高达96％以上。

实施例2纯菌株醋酸钙-不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)tnj-1对不同浓度氨氮的去除效果实验

分别配置氨氮浓度为800mg/l、1000mg/l、1200mg/l、1400mg/l、1600mg/l的分离培养基，分别取100ml不同氨氮浓度的分离培养基于250ml锥形瓶中，将其在121℃条件下高温蒸汽灭菌30min，待冷却后用移液枪向瓶中加入2ml醋酸钙-不动杆菌菌液(od600nm为1-2)，采用封口膜密封，放入摇床设定在30℃、170r/min条件下分离培养基培养，然后每隔24h测定菌液的od600nm值确定菌体生长情况，同时测定分离培养基中氨氮的含量，确定氨氮的去除效果，由图3可知，当氨氮浓度小于1000mg/l时，氨氮去除率在90％-100％之间，醋酸钙-不动杆菌最大氨氮耐受浓度可达1600mg/l，氨氮去除率为31.5％，这主要是由于高浓度氨氮分离培养基中含有大量的游离氨，抑制菌株的活性。

实施例3纯菌株醋酸钙-不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)tnj-1对不同浓度no3--n、no2--n的去除效果实验

分别配置no3--n、no2--n浓度为400mg/l的异养硝化培养基，分别取100ml不同no3—n、no2--n浓度的异养硝化培养基于250ml锥形瓶中，将其在121℃条件下高温蒸汽灭菌30min，待冷却后用移液枪向瓶中加入2ml醋酸钙-不动杆菌菌液(od600nm为1-2)，采用封口膜密封，放入摇床设定在30℃、170r/min条件下培养，然后每隔24h测定菌液的od600nm值确定菌体生长情况，同时测定异养硝化培养基中no3--n、no2--n、tn的含量，确定其去除效果，由图4可知，当no3—n浓度为400mg/l时，no3--n去除率75.41％，tn去除率为82.18％，当no2--n浓度分别为400mg/l为，no2--n去除率为30.91％，tn去除率为69.71，no2--n去除率偏低，这主要是由于no2--n积累对菌体具有毒害作用，使其生长受到阻碍甚至死亡。

上述例子仅是本发明的几个典型实例，显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>重庆理工大学

<120>一种耐高氨氮hn-ad的菌株分离方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1395

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgccctctttgcagttaggctagctacttctggtgcaacaaactcccatggtgtgacggg60

cggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcattctgatccgcgattactagcg120

attccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccggactacgatcggctttttgag180

attagcatcacatcgctgtgtagcaaccctttgtaccgaccattgtagcacgtgtgtagc240

cctggccgtaagggccatgatgacttgacgtcgtccccgccttcctccagtttgtcactg300

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tgtaagttcccgaaggcaccaatccatctctggaaagttcttactatgtcaaggccaggt480

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