一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数量的方法和应用与流程

本发明涉及微生物发酵工程领域，具体是指一种凝结芽孢杆菌13002及提高其芽孢数量的方法。

背景技术：

凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)，革兰氏阳性菌，属于芽孢杆菌属，体呈杆状，芽孢端生，无鞭毛。代谢类型为兼性厌氧型，有氧条件较无氧条件能够产更多的生物量。最适生长温度为40～50℃，最适生长ph值一般为6.6～7.0，发酵培养可产乳酸。同时，凝结芽孢杆菌是益生菌领域的潜力股，具备耐高温、耐胆盐、耐酸等抗逆性，能适应低氧的肠道环境，对于部分抗生素和某些有害菌也有一定的抑制能力。

近年来，凝结芽孢杆菌已然成为国内外研究的热点之一，研究的重点在于如何用低廉易获得的培养基获得高密度培养的凝结芽孢杆菌菌体。而国内对于凝结芽孢杆菌的研究才处于刚起步阶段。2016年5月30日，国家卫生健康委员会公告将凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)列入《可用于食品的菌种名单》，进一步将凝结芽孢杆菌的研究拓宽到食品领域的应用。

芽孢是细菌营养体在必需营养物质即将耗尽时，在细胞内形成的含水量极低、抗逆性极强的休眠体。由于芽孢极强的抗逆性，在工业机械化生产及高温干燥的过程中，可以保证微生物菌剂的活性，提高其产品质量。因为芽孢的优点，工业中关于凝结芽孢杆菌的产品形式正在从营养体细胞的形式像芽孢形式转移。

目前对凝结芽孢杆菌的研究主要集中在通过高密度培养技术获得更多的营养体细胞，而对芽孢数量的关注较少，同时在培养基和培养方式上进行芽孢数量优化的更是没有，工业中转向低成本的芽孢形式培养缺少研究。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决上述现有技术存在的不足，提供一种凝结芽孢杆菌13002及提高其芽孢数量的方法，所得凝结芽孢杆菌不产生有害代谢产物，抗氧化性高，芽孢数可达3.048×10⁹cfu/ml。本发明既符合该菌种的研究趋势，也为该菌种的深入研究及实际应用提供理论基础。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数量的方法，包括以下步骤：

(1)种子培养液的制备：将处于对数生长期的凝结芽孢杆菌菌悬液以体积比为2～10：100的比例接于种子培养基中进行活化培养；所述种子培养基为：按质量比计算，葡萄糖0.5～2.5％、细菌学蛋白胨0.5～1.5％，酵母提取粉1～3％，氯化钠0.5～1.5％，余量为水，ph为6.0～7.5；

(2)以体积比为2～10：100的比例，将种子培养液接入发酵培养基中，在40～50℃，摇床转速150～250rpm条件下，发酵培养48-60h后收集发酵培养液；所述发酵培养基的配方为：按质量比计算，葡萄糖0.5～2.5％，细菌学蛋白胨0.5～1.5％，酵母提取粉1～3％，氯化钠0.5～1.5％，硫酸锰0.01～0.03％，磷酸氢二钾0.1～0.5％，余量为麸皮水浸提液，浸提液浓度为5～15％，ph为6.0～7.5；

所述菌株为凝结芽孢杆菌(bacillussp.)13002，于2013年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，保藏编号为cgmccno.7431。

优选地，所述麸皮水浸提液的制备：将麸皮加入水中，70～80℃煮0.5～1.5h，过滤后即可。所述的5～10％麸皮水为：将50～100g麸皮加入1l的蒸馏水中，70～80℃煮0.5～1.5h，用4层纱布过滤后即为5～10％的麸皮水，冷却后于4℃冰箱储存备用。

优选地，所述发酵培养基中葡萄糖为1.5％，细菌学蛋白胨1％，酵母提取粉2％，氯化钠1％，硫酸锰0.02％，磷酸氢二钾为0.3％，余量为麸皮水浸提液，浓度为10％。

优选地，步骤(1)所述的活化培养条件为：温度40～50℃，摇床转速150～250rpm，培养时间18～24h。

优选地，所述发酵培养基的ph为7.0～7.5。

优选地，步骤(2)所述种子培养液的接种量为6～7％。

优选地，步骤(2)所述的发酵培养条件中温度为45℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为52h。

上述方法制得的凝结芽孢杆菌在制备益生菌保健品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明的工作发酵剂用两种培养基依次培养，使凝结芽孢杆菌尽量活化，并处于同步生长状态。

(2)本发明中的发酵培养基采用的磷酸二氢钾、硫酸锰、麸皮水都能保证芽孢形成所需要的生长因子，促进芽孢的大量形成。

(3)本发明中凝结芽孢杆菌13002的发酵温度在40～50℃，可以减少杂菌污染的机会。

(4)本发明所得凝结芽孢杆菌不产生有害代谢产物，且经动物实验验证抗氧化性高。

本发明对发酵培养基进行了优化，通过改变发酵培养基中的营养物质及调整发酵过程的控制参数，提高凝结芽孢杆菌发酵过程中的芽孢数量，且不产生有害代谢产物，有助于提高机体的抗氧化能力，减少脂质过氧化的发生，芽孢数可达3.048×10⁹cfu/ml。同时工艺简单，条件温和，无需特殊设备，降低生产成本，可扩大生产。

附图说明

图1为凝结芽孢杆菌在种子培养基和实施例1改良发酵培养基的芽孢数变化曲线。

图2为实施例1box-behnken优化实验拟合响应曲面交互作用影响图；(a)a:葡萄糖与b:麸皮水浓度交互作用影响等高线图，(b)a:葡萄糖与b:麸皮水浓度交互作用影响3d曲面图，(c)a:葡萄糖与c:磷酸氢二钾交互作用影响等高线图，(d)a:葡萄糖与c:磷酸氢二钾交互作用影响3d曲面图，(e)b:麸皮水浓度与c:磷酸氢二钾交互作用影响等高线图，(f)b:麸皮水浓度与c:磷酸氢二钾交互作用影响3d曲面图。

图3为实施例2中硝基还原酶检测结果图；右边试管为未接种细菌的空白组，中间试管为加入凝结芽孢杆菌13002的实验组，左边试管为加入质控菌株大肠杆菌atcc25922的实验组。

图4为实施例2中溶血活性检测结果图；(a)为凝结芽孢杆菌13002划线接种；(b)为凝结芽孢杆菌13002穿刺接种；(c)为质控菌株大肠杆菌划线接种；(d)为质控菌株大肠杆菌穿刺接种。

图5为实施例2中吲哚实验检测结果图；左边试管为空白试验，中间试管为加入凝结芽孢杆菌13002的实验组，右边试管为加入质控菌株大肠杆菌的实验组。

图6为实施例2中溶明胶实验结果图；上部试管为空白实验组，下部试管为加入凝结芽孢杆菌13002的实验组。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

实施例1：凝结芽孢杆菌提高芽孢数研究

第一步将处于对数生长期的凝结芽孢杆菌菌悬液以体积比为3：100的比例接于种子培养基中进行活化培养。所述种子培养基为：按质量比计算，葡萄糖1.5份、细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉2份，氯化钠1份，用蒸馏水定容至100份，ph为6.8。

第二步将种子培养液以6：100的比例接入发酵培养基中，在45℃，摇床转速200rpm下发酵培养52h，收集发酵液，芽孢数大于3×10⁹cfu/ml。所述的发酵培养基配方为：按质量比计算，葡萄糖1.5份，细菌学蛋白胨1份，酵母提取粉2份，氯化钠1份，硫酸锰0.02份，磷酸氢二钾0.3份，用10％的麸皮水定容至100份，ph为7.0。

通过对凝结芽孢杆菌13002培养条件的深入研究，以发酵时间对凝结芽孢杆菌芽孢数的对数值做曲线如图1，从图1可以看出，52h芽孢数达到最高值，此时芽孢数为3.29×10⁹cfu/ml。

所述第二步的发酵培养基配方及培养条件通过以下单因素优化实验、正交试验、plackett-burmen实验和box-behnken优化实验获得，具体如下：

1.发酵培养基单因素优化

1.1不同碳源的影响

用不同碳源的基础培养基在45℃、160r/min条件下培养凝结芽孢杆菌60h，测定芽孢数。所述基础培养基为：按质量比计算，细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉2.0份，加入不同碳源1.0份，用蒸馏水定容至100份，ph调至6.8。从表1可以看出，当碳源为葡萄糖或麸皮水时芽孢数较多，此两种碳源较适宜提高凝结芽孢杆菌13002的芽孢数量。

表1不同碳源对凝结芽孢杆菌芽孢数量的影响

1.2不同氮源的影响

用不同氮源的基础培养基在45℃、160r/min条件下培养凝结芽孢杆菌60h，测定芽孢数。所述基础培养基为：按质量比计算，葡萄糖1.0份，加入不同氮源2.0份，用10％麸皮水定容至100份，ph调至6.8。从表2可以看出，当碳源为酵母提取粉或蛋白胨时芽孢数较多，此两种氮源较适宜提高凝结芽孢杆菌13002的芽孢数量。

表2不同氮源对凝结芽孢杆菌芽孢数量的影响

1.3不同无机盐的影响

用不同无机盐的基础培养基在45℃、160r/min条件下培养凝结芽孢杆菌60h，测定芽孢数。所述基础培养基为：按质量比计算，葡萄糖1.0份，细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉2.0份，加入不同的无机盐0.5份，用10％麸皮水定容至100份，ph调至6.8。从表3可以看出，当无机盐为氯化钠、硫酸锰或磷酸氢二钾时芽孢数较多，此三种无机盐较适宜提高凝结芽孢杆菌13002的芽孢数量。

表3不同无机盐对凝结芽孢杆菌芽孢数量的影响

2.正交实验优化

上文在进行单因素分析时，确定了葡萄糖、麸皮水、细菌学蛋白胨、酵母提取粉、氯化钠、硫酸锰、磷酸氢二钾这七种单因素比较适宜提高凝结芽孢杆菌13002的芽孢数量。因此采用正交实验对这几个单因素进行初步优化。

2.1碳源、氮源的优化

用不同碳源、氮源的培养基在45℃、160r/min条件下培养凝结芽孢杆菌60h，测定芽孢数。所述培养基的配方及所得芽孢数量如表4所示。

表4碳源、氮源优化实验表

对试验结果分析(如表5所示)得到芽孢数最高的培养基成分组合是葡萄糖1.0份，麸皮水浓度10％，酵母提取粉2.0份，细菌学蛋白胨1.0份。

表5碳源、氮源优化结果分析表

2.2无机盐的优化

用含不同无机盐的基础培养基在45℃、160r/min条件下培养凝结芽孢杆菌60h，测定芽孢数。所述基础培养基配方如下：葡萄糖1.0份，酵母提取粉2.0份，细菌学蛋白胨1.0份，无机盐添加量如表6所示，用10％麸皮水定容至100份，ph调至6.8。

表6无机盐优化实验表

对试验结果分析(如表7所示)得到芽孢数最高的培养基中无机盐的组合是氯化钠0.6份，硫酸锰0.03份，磷酸氢二钾0.2份。

表7无机盐优化结果分析表

3.发酵培养基配方优化设计

使用designexpert8.0.6软件进行培养基优化。上文在进行单因素及正交实验分析时，选择了葡萄糖、麸皮水、细菌学蛋白胨、酵母提取粉、氯化钠、硫酸锰、磷酸氢二钾这七种因素进行分析，发现当培养基中分别含有葡萄糖1.0份，酵母提取粉2.0份，细菌学蛋白胨1.0份，氯化钠0.6份，硫酸锰0.03份，磷酸氢二钾0.2份，麸皮水浓度为10％时，获得的菌液是芽孢数量最高的。因此选择这几个浓度作为基准，进行plackett-burmen实验，最陡爬坡实验和box-behnken优化实验。

3.1plackett-burmen实验

表8plackett-burmen实验结果表

注：a-g分别指葡萄糖、麸皮水浓度、细菌学蛋白胨、酵母提取粉、氯化钠、硫酸锰、磷酸氢二钾七种因素。

利用designexpert8.0.6软件对上表中的数据进行分析，结果如下：

表9plackett-burmen实验分析表

注：a-g分别指葡萄糖、麸皮水浓度、细菌学蛋白胨、酵母提取粉、氯化钠、硫酸锰、磷酸氢二钾七种因素。

从表9可知，在促进凝结芽孢杆菌13002芽孢数量的增长上，葡萄糖、麸皮水浓度、磷酸氢二钾的贡献度较高，分别为3.83％、6.00％和16.04％，其他几个因素的贡献值均低于3％。结果表明在这七种促进因子中，加入葡萄糖、硫酸氢二钾或是改变麸皮水的浓度，更有利于促进凝结芽孢杆菌的芽孢数量增多。

根据plackett-burmen实验的结果，选择葡萄糖、麸皮水浓度、磷酸氢二钾作为研究对象，进行下一步的最陡爬坡实验。

3.2最陡爬坡实验

结果如表10所示，经设置最陡爬坡实验，改变发酵培养基中葡萄糖、麸皮水、磷酸氢二钾的浓度，测定后比较得出菌液芽孢数量最高的响应值，按质量比算，葡萄糖1.5份，麸皮水浓度7.5％，磷酸氢二钾0.3份，作为响应面设计因素的中心点。

表10最陡爬坡实验结果

3.3box-behnken优化实验

表11box-behnken实验结果表

利用box-behnken的中心组合设计实验数据进行分析，然后利用designexpert8.0.6软件进行分析。

表12box-behnken结果分析表

由表12可知，拟合模型的p＝0.0008<0.05，决定系数r²＝0.9515，说明模型与实际情况拟合良好，根据以上分析得知芽孢数量y对自变量葡萄糖(a)、麸皮水浓度(b)、磷酸氢二钾(c)的多元回归方程：

y＝2.43+0.062a+0.31b+0.36c-0.035ab-0.28ac-0.0001bc-0.36a²+0.23b²-0.43c²

该方程表达了凝结芽孢杆菌13002的芽孢数量和3个自变量之间的线性关系是显著的，即这种方法是可靠的。回归方程的一次项系数比较大，交互项系数中ac、ab的交互系数比较大，说明葡萄糖和麸皮水浓度、葡萄糖和磷酸氢二钾之间的交互效应大，而bc的交互系数较小，说明麸皮水浓度和磷酸二氢钾之间的交互效应小。

为了检验方程的有效性，对测定的凝结芽孢杆菌13002的芽孢数量的数学模型进行方差分析，并对各因子的偏回归系数进行检测。一次项中b、c的回归系数高度显著，p均小于0.01，说明麸皮水浓度和磷酸氢二钾对凝结芽孢杆菌13002的芽孢数量的影响有高度显著作用。二次项中a、c的偏回归系数达到极显著水平(p<0.01)，b的偏回归系数达到显著水平(p<0.05)。交互项ac的回归系数较其他因素显著，说明葡萄糖和磷酸二氢钾的交互项对凝结芽孢杆菌13002的芽孢数量影响较为显著。决定系数r²＝0.9515，说明该方程对实验拟合度良好。

为了得到最大的芽孢数量，培养基中葡萄糖、麸皮水浓度和磷酸二氢钾浓度需要有合适的比例。因此，根据图2和方差分析得知，对凝结芽孢杆菌13002的生长影响大小顺序为ac>ab>bc。

对二元回归方程求一阶偏导，当响应值y(芽孢数量)为最大值时各因子水平为按质量计，每100份培养基中，葡萄糖(a)为1.5份，麸皮水浓度(b)为10％，磷酸二氢钾(c)为0.3份。此时理论预测凝结芽孢杆菌的芽孢数量为2.97×10⁹cfu/ml。

对所获得的培养基配方进行验证试验，实际芽孢数量测得为3.048×10⁹cfu/ml。

4.培养条件的优化

在上述优化后的发酵培养基中，对培养条件进行优化，改变发酵培养基的ph值、发酵培养的接种量、转速、温度来确定最佳培养条件。所述优化后的发酵培养基配方为：葡萄糖1.5份，细菌学蛋白胨1份，酵母提取粉2份，氯化钠1份，硫酸锰0.02份，磷酸氢二钾0.3份，用10％的麸皮水定容至100份。

4.1培养基ph值优化

改变发酵培养基的ph值，测定芽孢数量。从表13可以看出，当ph为7.0时，芽孢数最多为2.82×10⁹cfu/ml，此时最有利于凝结芽孢杆菌芽孢数量的增长。

表13培养基ph对芽孢数量的影响

4.2培养基接种量的优化

改变发酵培养基的种子液接种量，测定芽孢数量。从表14可以看出，当接种比例为种子液：发酵培养基＝6：100(即接种量6％)时，芽孢数最高可达2.97×10⁹cfu/ml，此时最有利于凝结芽孢杆菌芽孢数量的增长。

表14接种量对芽孢数量的影响

4.3培养温度的优化

改变发酵培养的温度，测定芽孢数量。从表15可以看出，当温度为45℃时，芽孢数最高可达3.21×10⁹cfu/ml，此时最有利于凝结芽孢杆菌芽孢数量的增长。

表15温度对芽孢数量的影响

4.4培养转速的优化

改变发酵培养过程中的转速，测定芽孢数量。从表16可以看出，当转速为200rpm时，芽孢数最高可达2.88×10⁹cfu/ml，此时最有利于凝结芽孢杆菌芽孢数量的增长。

表16转速对芽孢数量的影响

为更好说明所得菌液的安全性及抗氧化性，下面结合实施例2及例3对本发明做进一步详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

实施例2:凝结芽孢杆菌安全性研究

第一步将处于对数生长期的凝结芽孢杆菌菌悬液以体积比为2～10：100的比例接于种子培养基中进行活化培养。所述种子培养基为：按质量比计算，葡萄糖0.5～2.5份、细菌学蛋白胨0.5～1.5份，酵母提取粉1～3份，氯化钠0.5～1.5份，用蒸馏水定容至100份，调节ph于6.0～7.5，灭菌冷却后即可使用。

第二步以体积比为2～10：100的比例，将种子培养液接入发酵培养基中，在40～50℃，摇床转速150～250rpm条件下，发酵培养48-60h后收集发酵培养液。所述发酵培养基的配方为：按质量比计算，葡萄糖0.5～2.5份，细菌学蛋白胨0.5～1.5份，酵母提取粉1～3份，氯化钠0.5～1.5份，硫酸锰0.01～0.03份，磷酸氢二钾0.1～0.5份，用5～10％的麸皮水定容至100份，调节ph于6.0～7.5，灭菌冷却后即可使用。

经第一步、第二步将所得发酵液用于安全性评价研究

1.硝基还原酶检测

将发酵培养后的凝结芽孢杆菌13002按3％接种量(v/v)接种于硝基还原酶检测培养基中，37℃恒温培养72h，依次向发酵培养液中加入α-萘胺溶液和对氨基苯磺酸溶液，观察培养基颜色的变化。大肠杆菌atcc25922为阳性对照菌株。未接种细菌的硝基还原酶检测培养基为空白对照。所述硝基还原酶检测培养基为：蛋白胨10.0g，硝酸钾1.0g，加蒸馏水至1l，ph调至7.4，121℃灭菌15min。培养基变红则表明硝基还原酶检测结果为阳性，否则为阴性。结果如图3所示，凝结芽孢杆菌13002的硝基还原酶检测结果为阴性，即菌液内无活性的硝基还原酶，无法将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

2.溶血活性检测

将发酵培养后的凝结芽孢杆菌13002在无菌条件下，用灭菌的接种环划线和穿刺于哥伦比亚血琼脂平板，37℃倒置培养48h后，若菌落周围形成透明圈则为β-溶血；若出现绿色圈，则为α-溶血；若无溶血环，则为γ-溶血，也称无溶血。以金黄色葡萄球菌atcc25923为阳性参照菌株。结果如图4所示，质控菌株金黄色葡萄球菌菌落周围出现溶血圈，而凝结芽孢杆菌13002周围无溶血圈出现，即凝结芽孢杆菌13002不会产生可以使红细胞溶解的溶血毒素，是安全的。

3.吲哚实验

将发酵培养后的凝结芽孢杆菌13002按3％接种量(v/v)接种于蛋白胨水培养基中，37℃恒温培养72h，在培养液中加入乙醚1～2ml，静置片刻后沿管壁缓慢加入吲哚试剂8滴，观察试验结果，同时做空白实验。大肠杆菌atcc25922为阳性对照菌株。所述蛋白胨水培养基的成份是蛋白胨1.0g与氯化钠0.5g，水加到100mlph调至7.8。若液面出现红色则为阳性，不变色则为阴性。结果如图5所示，大肠杆菌atcc25922的培养基出现红色环，吲哚实验结果为阳性，而接有凝结芽孢杆菌13002的培养基没有明显颜色变化，结果为阴性。

4.溶明胶实验

将发酵培养后的凝结芽孢杆菌13002按3％接种量(v/v)接种于明胶培养基中，37℃恒温培养48h后，取出置于4℃冰箱中使明胶完全凝固，凝固后取出在室温放置，观察接菌管与无菌对照管的融化速度，若融化明显加快则为阳性反应，否则为阴性。结果如图6所示，接菌管明胶融化速率与无菌管无明显差异，结果为阴性。

实施例3：凝结芽孢杆菌抗氧化性研究

第一步将处于对数生长期的凝结芽孢杆菌菌悬液以体积比为2～10：100的比例接于种子培养基中进行活化培养。所述种子培养基为：按质量比计算，葡萄糖0.5～2.5份、细菌学蛋白胨0.5～1.5份，酵母提取粉1～3份，氯化钠0.5～1.5份，用蒸馏水定容至100份，调节ph于6.0～7.5，灭菌冷却后即可使用。

第二步以体积比为2～10：100的比例，将种子培养液接入发酵培养基中，在40～50℃，摇床转速150～250rpm条件下，发酵培养48-60h后收集发酵培养液。所述发酵培养基的配方为：按质量比计算，葡萄糖0.5～2.5份，细菌学蛋白胨0.5～1.5份，酵母提取粉1～3份，氯化钠0.5～1.5份，硫酸锰0.01～0.03份，磷酸氢二钾0.1～0.5份，用5～10％的麸皮水定容至100份，调节ph于6.0～7.5，灭菌冷却后即可使用。

经第一步、第二步将所得发酵液进行动物实验用于研究其抗氧化性

1.小鼠的分组与处理

小鼠饲养温度为20～25℃，相对湿度45～55％。40只spf级balb/c雄性小鼠经一周预饲养后，随机分为正常组、模型组、阳性组和凝结芽孢杆菌组4组，每组10只，组间体重无显著性差异，具体如表17所示。

表17小鼠分组及处理

除正常组外，其余组腹腔注射50mg/kg环磷酰胺，连续3d，建立肝损伤小鼠模型。建模后，按表17方式对各组小鼠进行灌胃，每天一次，注射量为1.0ml/100g，持续两周。记录小鼠每天体重变化，以调整灌胃量。

2.小鼠体内抗氧化指标检测

实验第15d，小鼠禁食过夜，颈椎脱臼处死小鼠，取肝脏，加生理盐水制成10％的肝组织匀浆，按试剂盒说明书测定肝组织中sod、cat和mda含量。所述超氧化物歧化酶(sod)测定试剂盒，过氧化氢酶(cat)测定试剂盒，丙二醛(mda)测定试剂盒均来自南京建成生物工程研究所。

结果如表18所示，模型组小鼠肝脏sod、cat活性均显著低于正常组(p<0.05)，脂质过氧化产物mda含量显著高于正常组(p<0.05)，表明环磷酰胺的注射造成了小鼠肝脏抗氧化系统的损伤，同时说明肝损伤小鼠模型建模成功。凝结芽孢杆菌组小鼠肝脏中sod、cat活性显著高于模型组(p<0.05)，mda含量显著低于模型组(p<0.05)。且凝结芽孢杆菌组小鼠的提高抗氧化酶活性的效果比阳性组更好。

表18小鼠体内抗氧化指标结果

环磷酰胺的代谢产物丙烯醛可刺激机体产生大量的活性氧，使sod、cat的活性下降。在生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛(mda)，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性，可以反映环磷酰胺造成了脂质氧化损伤程度。从表18可见，凝结芽孢杆菌能显著提高肝损伤小鼠的sod、cat活性，同时降低mda的含量，表明凝结芽孢杆菌有助于提高机体的抗氧化能力，减少脂质过氧化的发生。