本发明涉及功能微生物筛选
技术领域：
，具体涉及一种用于防治植物病害的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
：随着人们对无污染、无公害绿色食品呼声日益提高，生物防治已成为继农业、化学防治之后的又一重要防治方法，许多生物杀菌剂已相继问世，并广泛应用于生产，取得显著效果。生防菌的种类繁多，生产上广泛应用的有真菌、细菌、放线菌、病毒等。真菌主要有木霉菌、毛壳菌、酵母菌、淡紫拟青霉菌、厚壁孢子轮枝菌及菌根真菌等；细菌主要有芽孢杆菌、假单胞杆菌等促进植物生长菌(pgpr)、放射性土壤农杆菌和巴氏杆菌等；放线菌主要有链霉菌及其变种；病毒的弱毒株系；病原菌的无致病力突变菌株。生防菌的生防机制是多种多样的，如产生抗菌素、重寄生、溶菌作用、竞争作用和诱导抗性等。由于大多数据是在试验条件下获得的，而田间条件要复杂的多，所以实际上可能两种或三种机制同时起作用，也可能是在植物不同部位或不同发育时期某一机制在起主要作用。此外，生防机制可能还包括(1)在逆境中如干旱、养分的胁迫下，通过加强根系和植株的发育提高耐性；(2)可诱导植物对病菌的抗性；(3)增加土壤中营养成分的溶解性，并促进其吸收；(4)使病原菌的酶钝化。目前，生防菌在植物病害防治中存在以下问题：一是生防菌在田间自然条件下定殖能力差。大多数生防菌是在试验条件下筛选鉴定的，与田间自然条件有很大区别，这些生防菌在田间施用后往往因定殖能力弱，形不成足够的生物群体而降低防效。二是生防菌的抗药能力差。在试验条件下，有的生防菌生防效果不错，但在田间由于田间残留的农药或施用农药后，种群数量迅速下降。三是菌株稳定性问题。目前生防菌制剂多为活菌制剂，田间应用时常受到温度、湿度、土壤ph值等外界因素的影响,因此防治效果不稳定。因此，筛选具有稳定性好、抗药能力强等特征的新型生防菌株，具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一株新的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，并提供了其在植物病害防治中的应用。所述枯草芽孢杆菌筛选自江苏抚州枯萎病高发病地块，对尖孢镰刀菌具有显著抑制作用，可有效防治常见作物病害，应用前景广泛。本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌vb1700(bacillussubtilisvb1700)，已于2019年6月6日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctccno：m2019441。本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌在植物病害防治中的应用。所述植物病害包括枯萎病、死棵病、烂脖子病、炭疽病、纹枯病、弯孢病、根腐病、白绢病、白粉病、疮痂病、烂果病、灰霉病、褐斑病和果腐病中的任意一种。本发明还提供了一种微生物制剂，包含上述枯草芽孢杆菌vb1700。所述微生物制剂还包含芽孢杆菌、假单胞菌、土壤杆菌、固氮菌、根瘤菌、青霉菌、曲霉菌、根霉菌、链霉菌中的任意一种或两种或多种的组合。所述微生物制剂中枯草芽孢杆菌vb1700的活菌量至少为108cfu/g。本发明还提供了上述微生物制剂在植物病害防治中的应用。本发明筛选到的枯草芽孢杆菌vb1700对尖孢镰刀菌具有较强的抑制作用，抑菌带宽度超过24mm。所述枯草芽孢杆菌可广泛应用于常见植物病害的防治，其中对西红柿枯萎病、甜瓜死棵病和姜烂脖子病的防治效率分别高达94.7％、88.8％和82.1％，取得了意料不到的技术效果。枯草芽孢杆菌vb1700在防治西红柿枯萎病和甜瓜死棵病的同时，还可以显著提高西红柿和甜瓜的产量和品质。与冲施化学药剂的阳性对照组相比，冲施枯草芽孢杆菌vb1700菌粉的处理组2西红柿的产量、vc含量和糖度分别提高15.1％、12.1％和7.8％。与空白对照组相比，处理组甜瓜的产量普遍提高了10.4％-20.1％，甜瓜中可溶性固形物含量提高了12.3％-24.4％，维生素c含量提高了10.6％-36.2％，取得了意料不到的技术效果。本发明提供的枯草芽孢杆菌vb1700可单独作为防治西红柿枯萎病、甜瓜死棵病、姜烂脖子病等植物病害的生防菌剂等，广泛应用于农业生产领域，还可与其他芽孢杆菌、假单胞菌、土壤杆菌、固氮菌、根瘤菌、青霉菌、曲霉菌、根霉菌、链霉菌中的任意一种或多种进行组合，用于其他常见植物病害的防治，防治效率达到70％以上，效果显著，应该前景广阔。具体实施方式本发明实施例中选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。对于本发明所涉及的培养基配方如下：pda培养基：马铃薯洗净去皮，称取200g马铃薯切成小块，加蒸馏水煮烂(煮沸20-30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，加入20g葡萄糖，搅拌均匀，加入15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，稍冷却后再补足水分至1000ml，分装试管或者锥形瓶，封口膜封口，115℃灭菌20min，冷却后贮存备用。psa培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水定容至1000ml，115℃灭菌20min(配制方法同上，不需加入琼脂)；lb培养基：950ml去离子水中加入：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g，溶解，用5mol/lnaoh调ph至7.0用去离子水定容至1l，灭菌条件为121℃20min。下面结合具体实施例进一步阐述本发明。实施例1土壤中微生物的筛选1、土壤微生物的分离纯化：(1)土壤样品：采集自黑龙江省克山县马铃薯种植区疮痂病发病地块。(2)称取0.5g土壤样品溶于4.5ml无菌水中制成1：10的土壤溶液，然后从中吸取0.5ml土壤溶液置于4.5ml无菌水中，制成1：100的土壤溶液，以此方法类推，制备1：106-107的土壤稀释溶液。取3-4个适宜浓度的稀释液0.1ml均匀涂布于lb固体平板上；37℃培养2d后取出，挑取单个菌落继续分离纯化，直至每个平板上长出的菌落形态颜色一致，即为单一菌株。采用上述方法，申请人共筛选出18株菌，分别命名为hk1、hk2、hk3、……、hk18。2、生防菌初筛将上述分离纯化的18株菌分别接种于营养肉汤培养基中，37℃，220r/min培养14h，制备成供试菌液备用。将病原菌尖孢镰刀菌(山东省农科院植保所提供)在pda培养基上培养5天后备用。在营养琼脂培养基的中央接种尖孢镰刀菌菌饼，在菌饼两侧距离培养皿中心2.5cm处分别接种上述供试菌液，然后30℃培养箱中培养72h后，取出测量抑菌带的宽度，以此来判断抑菌效果。具体结果见表1。表1不同菌株对尖孢镰刀菌的抑制效果菌株抑菌带宽度mmhk121.0±1.0hk223.0±1.5hk321.0±1.0hk420.0±1.5hk520.0±1.0hk618.0±1.5hk716.0±0.5hk824.0±0.5hk921.0±1.0hk1019.0±1.5hk1118.0±0.5hk1223.0±1.5hk1320.0±1.0hk1419.0±0.5hk1518.0±1.0hk1622.0±1.0hk1717.0±1.5hk1819.0±0.5从表1中的数据可以看出，本发明从土壤中筛选到的菌株中hk2、hk8、hk12和hk16对尖孢镰刀菌的抑制作用最强。其中，hk8菌株的抑菌效果最好，抑菌带宽度超过24mm。3、传代稳定性分析申请人采用打孔法对hk2、hk8、hk12和hk16四株菌各进行了18代的传代稳定性测试。结果显示，所述四株菌对尖孢镰刀菌的抑菌效果稳定性强，传代间无明显差异。实施例2西红柿枯萎病防治实验1、菌粉制备将hk2、hk8、hk12和hk16四株菌分别在3吨发酵罐中进行液体发酵，当镜检芽孢率达到90％以上时停止发酵；5000rpm离心10min，去除发酵上清液，将菌泥进行喷雾干燥，制得活菌量为10亿/g的菌粉。2、西红柿枯萎病防治实验实验地点：青岛市城阳区夏庄西红柿种植大棚；选取10m×8m的区域作为一个实验区，每个实验区内有10垄西红柿，约800±20株。共设置18个实验区，每个实验区之间设立保护行。每个处理组随机选择3个实验区进行实验。(1)空白对照组：清水冲施；(2)阳性对照：化学药剂36％甲基硫菌灵悬浮剂500倍液冲施；(3)菌粉处理组：在西红柿移栽后，将菌粉(活菌量10亿/g)按3kg/亩的用量随水浇施于西红柿根部，间隔7天用一次，连续使用三次。其中：处理组1：hk2菌粉，用量为3kg/亩；处理组2：hk8菌粉，用量为3kg/亩；处理组3：hk12菌粉，用量为3kg/亩；处理组4：hk16菌粉，用量为3kg/亩。在西红柿结果期，统计各组西红柿枯萎病发病株数，计算发病率以及hk2、hk8、hk12和hk16四株菌对西红柿枯萎病的防治效率，具体结果见表2。发病率＝发病株数/总株数×100％。防治效率％＝(空白对照组发病率-处理组发病率)/空白对照组发病率×100％。表2不同菌株对西红柿枯萎病的防治效果实验分组化学药剂/菌粉平均发病率平均防治效率空白对照组-21.80％-阳性对照组36％甲基硫菌灵悬浮剂1.20％94.5％处理组1hk22.89％86.7％处理组2hk81.15％94.7％处理组3hk122.78％87.2％处理组4hk161.58％92.7％从表2的结果可知，本发明筛选到的hk2、hk8、hk12和hk16四株菌对西红柿枯萎病均有显著的防治效果。其中，hk8菌株对西红柿枯萎病的防治效果最好，防治效率高达94.7％，与冲施化学药剂的阳性对照组相当。而进一步的检测结果显示，与冲施化学药剂的阳性对照组相比，冲施hk8菌粉的处理组2西红柿的产量、vc含量和糖度分别提高15.1％、12.1％和7.8％。从而说明，本发明筛选获得的hk8菌株不仅能有效防治西红柿枯萎病，还可显著提高西红柿的产量和品质，取得了意料不到的技术效果。实施例3hk8菌株的鉴定对hk8菌株进行分子生物学鉴定，测得其16srdna序列，并在genbank核酸数据库中进行blast比对。结合hk8菌株的生物学特性和16srdna比对结果，申请人确认mc7菌株为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，命名为枯草芽孢杆菌vb1700(bacillussubtilisvb1700)。申请人已于2019年6月6日将上述枯草芽孢杆菌vb1700(bacillussubtilisvb1700)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2019441。实施例4枯草芽孢杆菌vb1700在甜瓜死棵病防治中的应用1、实验地点：青岛市莱西市邹家许村甜瓜种植大棚。2、甜瓜死棵病防治实验：选取10m×8m的区域作为一个实验区，每个实验区内有10垄甜瓜，约400±10株。共设置12个实验区，每个实验区之间设立保护行。每个处理组随机选择3个实验区进行实验。(1)空白对照组：清水浇施甜瓜苗根部；(2)vb1700菌粉处理组：将vb1700菌粉(活菌量为10亿/g)按1-5kg/亩的用量在甜瓜苗移栽后随水冲施，每隔7天用一次，连续用三次。其中：处理组1：vb1700菌粉用量为1kg/亩；处理组2：vb1700菌粉用量为3kg/亩；处理组3：vb1700菌粉用量为5kg/亩。在甜瓜收获期，分别统计各组甜瓜的死棵数，计算发病率和枯草芽孢杆菌vb1700对甜瓜死棵病的防治效率，具体结果见表3。发病率＝死棵数/总棵数×100％。防治效率％＝(空白对照组发病率-处理组发病率)/空白对照组发病率×100％。表3枯草芽孢杆菌vb1700对甜瓜死棵病的防治效果实验分组发病率防治效率-空白对照组24.1％-vb1700处理组110.2％57.6％vb1700处理组25.8％75.9％vb1700处理组32.7％88.8％从表3的数据可以看出，施用枯草芽孢杆菌vb1700菌粉的各处理组甜瓜死棵病的发病率仅有2.7％-10.2％，远远低于对照组。从而说明本发明提供的枯草芽孢杆菌vb1700对甜瓜死棵病具有显著的防治效果，防治效率最高达到88.8％，取得了意料不到的技术效果。3、枯草芽孢杆菌vb1700对甜瓜产量和品质的影响进入成熟期后，每天6:00-8:00集中采摘成熟度超过8成的甜瓜，称重，记录各实验区每天的甜瓜产量；并从每个实验区每天采摘的甜瓜中随机挑取20个甜瓜，分别检测其可溶性固形物含量(质量百分比)和维生素c的含量(mg/100g)。全部甜瓜收获完毕后，统计各实验区甜瓜的总产量，分别计算对照组和处理组甜瓜的平均总产量和增产率，具体结果见表4；分别计算对照组和处理组甜瓜中可溶性固形物和维生素c的平均含量，具体结果见表5。增产率＝(处理组甜瓜产量-空白对照组甜瓜产量)/空白对照组甜瓜产量×100％。表4枯草芽孢杆菌vb1700对甜瓜产量的影响实验分组平均产量kg/亩增产率％空白对照组2315-实验组1255610.4％实验组22643.214.2％实验组32779.620.1％表5枯草芽孢杆菌vb1700对甜瓜品质的影响实验分组可溶性固形物含量vc含量mg/100g空白对照组8.2％5.2实验组19.2％5.75实验组29.3％6.12实验组310.2％7.08从表4和表5中的数据可知，通过在甜瓜苗期施用枯草芽孢杆菌vb1700菌粉，不仅可以有效防治甜瓜死棵病，还可以显著提高甜瓜的产量，提升甜瓜的品质。与空白对照组相比，处理组甜瓜的产量普遍提高了10.4％-20.1％，增产效果明显；处理组甜瓜中可溶性固形物含量提高了12.3％-24.4％，维生素c含量提高了10.6％-36.2％，取得了意料不到的技术效果。实施例5枯草芽孢杆菌vb1700在姜烂脖子病防治中的应用1、实验地点：昌邑市围子街道姜种植地，该地块连年种姜，有严重的重茬病害—烂脖子病。2、实验设计：选取10m×8m的区域作为一个实验区，每个实验区内种10垄姜，约400±20株。共设置12个实验区，每个实验区之间设立保护行。每个处理组随机选择3个实验区进行实验。(1)空白对照组：不撒施任何菌粉，直接在姜沟中种姜；(2)vb1700粉处理组：先将vb1700菌粉(活菌量为10亿/g)按1-5kg/亩的用量均匀撒施于姜沟内，然后在姜沟中种姜。其中：处理组1：vb1700菌粉用量为1kg/亩；处理组2：vb1700菌粉用量为3kg/亩；处理组3：vb1700菌粉用量为5kg/亩；在姜的生长过程中，对各实验区均采用相同的田间管理方法。在姜收获时，统计姜烂脖子病的发生情况，计算枯草芽孢杆菌vb1700对姜烂脖子病的防治效率，具体结果见表6。病害分级标准：0级，姜株健康无病；1级，母姜株局部发病，子孙姜株健康无病；2级，子孙姜株有病斑，但无枯死；3级，姜丛局部枯死(30％～50％)；4级，姜丛基本枯死或完全枯死，姜肉变色腐烂60％以下；5级，姜丛完全枯死，姜肉腐烂60％以上。病情指数和防治效率计算公式分别为：病情指数＝(∑(各级发病株数×对应发病级数)/(调查总株数×最高发病级数))×100；防治效率(％)＝[(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100％。表6枯草芽孢杆菌vb1700对姜烂脖子病的防治效果实验分组病情指数防治效率空白对照组74.8-vb1700处理组138.648.3％vb1700处理组222.567.2％vb1700处理组413.482.1％从表6的数据可以看出，与对照组相比，在种姜前撒施枯草芽孢杆菌vb1700菌粉的各处理组姜的烂脖子病病情指数得到大幅度降低，从而说明本发明提供的枯草芽孢杆菌vb1700对姜烂脖子病具有显著的防治效果，防治效率最高达到82.1％，取得了意料不到的技术效果。综上所述，本发明提供的枯草芽孢杆菌vb1700可单独作为防治西红柿枯萎病、甜瓜死棵病、姜烂脖子病等植物病害的生防菌剂等，广泛应用于农业生产领域，还可与其他芽孢杆菌、假单胞菌、土壤杆菌、固氮菌、根瘤菌、青霉菌、曲霉菌、根霉菌、链霉菌中的任意一种或多种进行组合，用于其他常见植物病害的防治，防治效率达到70％以上，效果显著，应该前景广阔。当前第1页1 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