一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测大豆根腐病的引物探针组合物、试剂盒及其应用与流程

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测由终极腐霉引起的大豆根腐病的引物探针组合物、试剂盒及其应用。

背景技术：

终极腐霉(pythiumultimum)是一种常见的土传病原菌，也是最有致病力的腐霉属之一，能侵染大量的经济作物，包括小麦、玉米、大豆、马铃薯、番茄等。终极腐霉引起的大豆根腐病给大豆生产带来了严重的损失。因此，终极腐霉的分子检测对农业生产的作物病害的意义重大，快速准确的检测为病害的防治提供参考，有效利用最佳防治时期，降低损失。

腐霉菌的检测是病害防控的关键一步，传统的检测方法基于特定培养基上腐霉菌的微观形态和生长特性，耗费时间且需要经验丰富的实验人员。近些年来，基于核酸扩增技术的分子检测方法被广泛应用于植物病原物的检测，目前已经建立了多种植物病原腐霉菌的分子检测方法，主要是基于聚合酶链式反应(pcr)和实时荧光定量pcr(realtimepcr)等技术。但这些技术依赖于精密昂贵的温度循环装置，需要专业的技术人员和复杂的反应试剂，所需的检测时间仍然比较长。因此，建立一种简单、快速、灵敏、准确的方法来检测腐霉菌所致植物病害是至关重要的。该方法中筛选特异性强灵敏度高的引物组合物是检测终极腐霉的关键。

重组酶聚合酶扩增(rpa)技术是新发展的一种等温扩增技术，技术体系中主要是三种酶发挥作用，即结合寡核苷酸引物的重组酶、单链dna结合蛋白和具有链置换活性的dna聚合酶。由于这三种酶在常温下具有活性，重组酶聚合酶扩增反应一般在37-42℃进行，这比lamp反应的温度更低，反应条件更易实现，而且反应更加快速，一般反应20分钟就可以进行检测，是一种非常有潜力的分子检测工具。目前以rpa技术为基础的分子检测方法在人体医学、动物医学上的研究和应用较多，在植物病原菌分子检测方面的应用较少，因此围绕终极腐霉建立重组酶聚合酶扩增检测技术具备很大的潜力。

技术实现要素：

针对现有技术中终极腐霉生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测终极腐霉的引物探针组合物、试剂盒及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现上述的发明目的：

一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测终极腐霉的引物探针组合物，该引物探针组合物由正向引物purpa-f、反向引物purpa-r和探针puprobe组成，所述的正向引物purpa-f具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，反向引物purpa-r具有如seqidno.2所示的核苷酸序列，探针puprobe具有如seqidno.3所示的核苷酸序列。各引物和探针的序列如下所示：

正向引物purpa-f：ttcacgatgtatggagacgctgcatttagttg

反向引物purpa-r：biotin-tcctccgcttattgatatgcttaagttcag

探针puprobe：fam-tatcattgtcaattgcaagattgtgtatgg-thf-atctcaattggacct-c3space

上述的引物探针组合物在制备用于检测终极腐霉的试剂盒中的应用。

一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测终极腐霉的试剂盒，该试剂盒中包含上述的引物探针组合物。作为一种优选技术方案，该试剂盒中各试剂的浓度和用量为：2.1μl10μm的正向引物purpa-f、2.1μl10μm的反向引物purpa-r、0.6μl10μm的探针puprobe、29.5μlrehydrationbuffer、12.2μldepc处理水、2.5μl280mmmgac和酶干粉，配成49μl的反应体系。

上述的试剂盒在检测终极腐霉中的应用。

上述的引物探针组合物在检测终极腐霉中的应用。

一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测终极腐霉的方法，提取待检测样品的基因组dna作为反应模板，采用上述的引物探针组合物进行重组酶聚合酶扩增，然后使用侧流层析试纸条检测扩增产物，判断检测结果：当检测线和控制线上都出现指示带时，则表示待测病菌为终极腐霉。作为一种优选技术方案，该方法的具体工艺参数为：提取待检测样品的基因组dna，取1μl待检微生物的dna作为反应模板，加入49μl权利要求3或4所述的试剂盒中的检测溶液进行重组酶聚合酶扩增，反应程序为：39℃反应扩增20min。

该方法的具体步骤为：提取待检测样品的基因组dna，取1μl样品dna作为反应模板，利用上述的检测试剂盒体系进行重组酶聚合酶扩增反应；由于探针包含羧基荧光素(fam)标记和3’端阻断物，下游引物包含生物素b，rpa反应体系中核酸外切酶可以特异性地识别并切割探针序列中的thf分子，剪切后的探针与下游引物形成既带有fam标记也带有生物素b的双标记扩增子。取5μl扩增产物与95μl的hybridetectassaybuffer混合，将一根侧流层析试纸条垂直放置，样品端浸入混合液中，室温放置3min后观察结果。

侧流层析试纸条样品端携带有纳米金粒颗粒，检测线含有生物素抗体。利用生物素标记的引物和fam标记的探针对目的基因扩增后，将试纸条样品端浸入扩增液，在检测线上会形成生物素抗体-核酸-纳米金粒复合体而呈现暗红色条带。因此，反应结束后通过侧流层析试纸条上检测线的颜色变化，来判断终极腐霉的有无；检测线和控制线都出现指示带表示检测为阳性，存在终极腐霉；只有控制线出现指示带，检测线未出现条带表示检测为阴性，不存在终极腐霉。

本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：

(1)操作方便：不像pcr法和环介导等温扩增技术(lamp)必须经过热循环或高温孵育，本发明摆脱了对热循环仪器和稳定热源的依赖，只要在常温下重组酶聚合酶扩增反应就可以发生，极大的扩展了其使用范围。本发明中的检测方法在25-45℃的恒温条件，不需要复杂仪器，能很好的满足对终极腐霉菌进行现场检测的要求，适合基层单位和条件受限的地区使用。

(2)检测速度快：传统鉴定主要是根据形态特征来进行鉴定，操作繁琐且耗时冗长。普通pcr反应以及lamp等检测技术也需要1-2个小时的检测时间。而重组酶聚合酶扩增反应整个过程进行得非常快，一般可在10-20min之内获得可检出水平的扩增产物，侧流层析试纸条检测扩增产物仅需5min。重组酶聚合酶扩增技术的使用不受检测场地的限制，尤其适合基层对病原菌的快速检测。

附图说明

图1为终极腐霉的重组酶聚合酶检测的引物探针组合物的特异性验证结果：

使用终极腐霉的特异性引物探针组合对不同病原菌进行重组酶聚合酶扩增反应，随后使用侧流层析试纸条对反应产物进行结果判定。结果显示：只有终极腐霉的检测线和控制线上都出现指示带，表示阳性检测结果，而其它腐霉菌的检测线没有出现指示带，表示阴性检测结果。

图2为终极腐霉的重组酶聚合酶检测的灵敏度验证结果：

扩增不同浓度的终极腐霉的基因组dna：从左到右为50μl的反应体系中分别含有1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fgdna和不含基因组dna的扩增结果。基于检测线条带判定检测的灵敏度。结果显示：50μl的反应体系中分别含有1ng、100pg、10pg、1pg、100fg终极腐霉dna的检测线可以观察到条带，呈阳性反应；50μl的反应体系中含有10fg终极腐霉dna和不含dna的检测线无条带，呈阴性反应。试纸条检测线条带显色结果表明终极腐霉重组酶聚合酶检测的灵敏度为100fg。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案更清楚明白，本发明用具体实例做进一步的说明，但并非仅限用于这些例子。

实施例1：终极腐霉的特异性引物和探针组合物的设计、筛选及验证

为了筛选得到终极腐霉特异的引物和探针组合物，本发明首先基于生物信息学分析工具，以常用的its序列作为检测靶标，从ncbi数据库下载了终极腐霉和其它二十余种腐霉的its序列，通过多序列比对分析，在终极腐霉和其它腐霉有明显序列差异的区域设计特异性的引物组合物，从设计的引物组合物中初步选择了3组引物组合物，引物组合物1：f1(ttcacgatgtatggagacgctgcatttagttg)，r1(tcctccgcttattgatatgcttaagttcag)；引物组合物2：f2(tttcagcagtggatgtctaggctcgcacatcg)，r2(gattctcgatcgaaaaaacgaacgcaaccat)；引物组合物3：f3(ccttttaaatggacacggtcttttctatgg)，r3(agcgtctccatacatcgtgaaaatgctctact)。针对以上3组引物组合物，通过普通pcr的方法来筛选特异性强灵敏度高的引物组合物，结果显示只有引物组合物1能够实现对终极腐霉的特异性扩增，而其它的引物组合物的扩增效率极低。于是采纳引物组合物1用于后续的终极腐霉的重组酶聚合酶检测，f1即为所述的正向引物purpa-f，r1即为反向引物purpa-r，并在此基础上设计了特异的探针piprobe。

实施例2：终极腐霉的引物和探针组合物的特异性试验

用于检测终极腐霉的引物和探针组合：正向引物具有如seqidno.1所示的purpa-f核苷酸序列，所述反向引物具有如seqidno.2所示的purpa-r核苷酸序列，所述探针具有如seqidno.3所示的puprobe核苷酸序列。

正向引物purpa-f：ttcacgatgtatggagacgctgcatttagttg

反向引物purpa-r：biotin-tcctccgcttattgatatgcttaagttcag

探针puprobe：fam-tatcattgtcaattgcaagattgtgtatgg-thf-atctcaattggacct-c3space

采用上述的引物和探针组合制成试剂盒，该试剂盒中各试剂的浓度和用量为：2.1μl10μm的正向引物purpa-f、2.1μl10μm的反向引物purpa-r、0.6μl10μm的探针puprobe、29.5μlrehydrationbuffer、12.2μldepc处理水、2.5μl280mmmgac和酶干粉，配成49μl的反应体系。

提取待检测样品的基因组dna，取1μl样品dna作为反应模板，加入49μl试剂盒中的检测溶液进行重组酶聚合酶扩增，反应程序为：39℃反应扩增20min，然后使用侧流层析试纸条检测扩增产物，判断检测结果。

为了验证终极腐霉引物和探针的特异性，以终极腐霉和其它六种亲缘关系较近的腐霉菌(pythiumaphanidermatum,py.helicoides,py.irregulare,py.heterothallicum,py.splendens,py.arrhenomanes)为供试菌株评估特异性。检测结果显示：只有终极腐霉的检测线和控制线上都出现指示带，表示阳性检测结果，而其它腐霉菌的检测线没有出现指示带，表示阴性检测结果(图1)。

实施例3：终极腐霉菌重组酶聚合酶检测的灵敏度试验

为了确定重组酶聚合酶检测方法的灵敏度，将终极腐霉的基因组dna用分光光度计测定浓度后进行10倍梯度稀释，设置dna浓度范围为1ng-10fg，分别取稀释后的各浓度dna稀释液1μl作为模板，depc处理水作为阴性对照，加入49μl试剂盒溶液进行重组酶聚合酶扩增反应，反应程序为：39℃孵育20min。反应结束后使用侧流层析试纸条检测扩增产物，根据检测线指示带颜色变化，判断检测结果。结果显示：dna浓度在1ng-100fg的范围都可以观察到试纸条检测线处有条带，dna浓度为10fg以及阴性对照试纸条检测线没有条带，说明当终极腐霉dna浓度为100fg时就足以用重组酶聚合酶方法检测出来(图2)。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测大豆根腐病的引物探针组合物、试剂盒及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ttcacgatgtatggagacgctgcatttagttg32

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tcctccgcttattgatatgcttaagttcag30

<210>3

<211>45

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tatcattgtcaattgcaagattgtgtatggatctcaattggacct45