一种同时检测香蕉中丛枝菌根真菌与香蕉枯萎病的引物组合物及qPCR方法与流程

本发明涉及一种同时检测香蕉中丛枝菌根真菌与香蕉枯萎病的引物组合及qpcr方法。

背景技术：

香蕉枯萎病是一种由尖孢镰刀菌古巴转化型(fusariumoxysporumf.sp.cubense,foc)引起的破坏性土传病害，是全球香蕉产业上面临最主要的病害。香蕉园一旦枯萎病菌入侵，轻者造成香蕉植株叶片黄化、假茎由下至上腐烂，重者全株枯死，全园绝收。香蕉foc病原菌有四个生理小种，其中4号生理小种foc4能够感染大多数香蕉品种，是四个生理小种中危害性最广，破坏性最严重的一种。

香蕉枯萎病的传统防治主要是物理法、农业技术、化学法等，存在或foc病菌杀灭不彻底、或土壤农药残留多、或土壤生态紊乱等种种问题。生物防治为当前植物病害防治的主要技术手段，被认为是最环保、无残留、环境友好的防治手段。其中，丛枝菌根(arbuscularmycorrhizae，am)真菌是生物防治中的尤为重要的一类有益微生物。am真菌能够与大多数陆生植物形成互惠共生系统，am真菌一方面接收宿主植物提供的碳水化化合物，一方面为植物提供水分、矿质营养，提高其植物生长势；形成菌根结构，在宿主植物细胞表面构建物理性防御屏障；诱导宿主植物产生获得性系统抗性，从而提高植物抗病能力。研究证明，am真菌通过与foc竞争侵入位点，减缓香蕉根系组织内foc的入侵速度，从而降低香蕉根系foc的丰度。

农业生产上，对香蕉foc4病原菌以及生防菌的快速高效检测是农业病害预测预报、防控和治理等工作的重要基础，更是香蕉产业上迫切解决的问题。当前，宿主植物体内am真菌、foc病原菌的分类鉴定和定量检测的分子手段已有成熟的研究方法报道。但由于am真菌与foc病原菌亲缘关系远，在同一宿主植物内，同时定量检测两种微生物的方法尚未建立。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种同时检测香蕉中丛枝菌根真菌与香蕉枯萎病的引物组合及qpcr方法。

本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：

用于同时检测香蕉中丛枝菌根真菌与香蕉枯萎病的引物组合物，包括：

amfintra1ggtgcgattctgtggagtgtgagg

intra2caagctttcggcaccagagcaacg

foc4focsc-1caggggatgtatgaggaggctaggcta

focsc-2gtgacagcgtcgtctagttccttggag

bananaban-ftcgtcacctattgggatgc

ban-rgctttaataagtgcttcggtg。

一种同时检测香蕉中丛枝菌根真菌与香蕉枯萎病的qpcr体系，包括：体系总体积25ul,am真菌反应程序95℃30sec；95℃15sec，58℃90sec，72℃60sec，40个循环；72℃10min。获得产物进行溶解分析95℃15sec，60℃30sec，95℃15sec。

优选地，qpcr体系总体积25ul,含dna模板1ul，每种引物0.2um。

一种同时检测香蕉中丛枝菌根真菌与香蕉枯萎病的qpcr方法，包括如下步骤：

1)合成前述的引物组合物；提取待测样品的dna；

2)提取得到的样品dna进行amq-pcr，其中，am体系总体积25ul：含×sybrpremixdimereraser12.5ul，intra1/intra2引物浓度10um各0.75ul；模板2ul，ddh2o补充至25ul；amf真菌反应程序95℃30sec；95℃15sec，58℃90sec，72℃60sec，40个循环；72℃10min；

提取得到的样品dna进行foc4q-pcr，其中foc4体系总体积25ul：含2×sybrpremixdimereraser12.5ul，focsc-1/focsc-2引物浓度(10um)各0.75ul；模板2ul，ddh2o补充至25ul；foc4qpcr反应程序95℃30sec；95℃5sec，55℃30sec，72℃30sec，40个循环，72℃10min；

3)根据步骤2)的结果，确定香蕉中丛枝菌根真菌与foc4的dna的量。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

本发明利用两对引物在巴西蕉根系中同时检测gi和foc4的生物丰富度，获得稳定可靠的检测方法。am真菌扩增结果明显，数据准确；采用引物focsc1/focsc2，对其敏感度加以验证发现foc4最低检出值低于0.1pg，说明focsc1/focsc2引物对于检测样品高度敏感，具有良好的可重复性。

本发明构建了同时检测am真菌与foc4丰度的qpcr体系和方法，所建立的qpcr体系检测灵敏度高，最低检出值低至0.1pg；本发明所建立的qpcr体系特异性强，定量准确，稳定性好，在同一体系中不受其它生物信息干扰。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1特异性引物pcr扩增产物凝胶电泳。

图2荧光定量pcr的溶解曲线。

图3特异性片段克隆与及蓝白斑筛选验证

(a)重组质粒图，(b)蓝白斑筛选结果，(c)amf250和foc4242重组质粒pcr验证结果。m为marker1000，1为ck；2为amf250重组质粒扩增；3为foc4242重组质粒扩增。

图4am真菌标准重组质粒的扩增曲线(a)和标准曲线(b)。

图5foc4242标准重组质粒的扩增曲线(a)和标准曲线(b)。

图6为实施例2不同处理巴西蕉根系gi与foc4丰度

具体实施方式

供试香蕉苗：5片叶龄，长势一致的易感品种巴西蕉(musaacuminate.aaagroupcv.cavendish)组培苗，由漳州唯天生物科技有限公司提供。

香蕉枯萎病菌：尖孢镰刀菌生理4号小种(fusariumoxysporumf.sp.cubensrace4，foc4)，由广东省农业科学院果树研究所提供。

丛枝菌根真菌选用根内球囊霉(glomusintraradices，gi)，购自premiertechbiotechnologies，rivière-du-loup，qc，canada。每毫升的孢子悬浮液含有4,000个孢子。

主要试剂

凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司)、rna纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)；反转录试剂盒、taqdna聚合酶、pcr反应试剂、pmd-18tvector、dnamaker，sybrpremixextaqtm(tlirhasehplus)(宝日医生物技术(北京)有限公司)；氨苄青霉素(amp)、异丙基-β-d-硫代半乳糖(iptg)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d半乳糖(x-gal)、引物合成、dna测序(上海生工生物工程有限公司)。其余试剂均为国产分析纯试剂。

实施例1

1qpcr方法的建立

1.1样品dna提取

(1)香蕉dna提取：分别收集每组样品，把三株植物合并在一起混合取样。精确称重200mg提取基因组dna。按生工植物基因组dna提取试剂盒说明书提取香蕉基因组dna。

(2)foc4dna提取：将保藏于4℃冰箱的foc4接种在pda培养基上，置于28℃恒温培养箱中倒置培养5d。取活化后的致病菌饼移入装有100mlpda液体培养基的三角瓶内，180r/min，28℃培养5d。使用无菌纱布滤纸，抽滤得到100mg菌丝体，按照提取真菌基因组dna说明书步骤提取foc4的全基因组dna。

(3)am真菌dna提取：为得到高质量的am真菌的dna，吸取am真菌接种剂置于体视镜下用10ul的枪头吸取12000个孢子体，并在显微镜下去除残留的植物碎片或杂质，作为am真菌的dna提取样品。所有样品在液氮研磨后，再按照真菌基因组dna说明书步骤提取样品dna。

1.2特异性引物设计及检验

香蕉pcr引物在rbcl基因上设计，由植物叶绿体dna编码，其编码区高度的保守。其产物189bp。am真菌与foc4的特异性引物参考表1.

表1所用引物

分别提取香蕉、am真菌和foc4的dna,通过常规pcr扩增，在3％的琼脂糖凝胶上检验引物特异性。

1.3目的基因的克隆转化

切胶回收并纯化目的片段，使用takarapmdtm18-t克隆试剂盒(takara6011)把特异性片段foc4242和amf250连接到pmd-18-tvector载体。具体操作为：在微量离心管中配制5ul插入片段和pmd18-tvector混合dna溶液，加入solutionⅰ在16℃反应45min。取2μl上述连接液加入到50ul大肠杆菌dh5α中进行转化，通过蓝白斑筛选和pcr确认表达foc242和amf250的转化体。

1.4构建荧光定量pcr检测am真菌的分子体系

按照质粒提取说明书提取标准重组质粒，把携带amf250的标准重组质粒，通过implen超微量分光光度计上检测质粒浓度。对标准重组质粒进行10×梯度稀释，范围为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7copies/ml。使用sybrgreen进行qpcr。体系总体积25ul：2×sybrpremixdimereraser12.5ul，intra1/intra2引物浓度(10um)各0.75ul；模板2ul，ddh2o补充至25ul；am真菌反应程序95℃30sec；95℃15sec，58℃90sec，72℃60sec，40个循环；72℃10min。获得产物进行溶解分析95℃15sec，60℃30sec，95℃15sec，每次处理进行三次技术重复。基于qpcr的标准曲线的结果，计算测试样品中病原体的量。

1.5构建荧光定量pcr检测foc4的分子体系

按照质粒提取说明书提取标准重组质粒，把携带foc242的标准重组质粒，通过implen超微量分光光度计上测定质粒浓度。对标准质粒进行10×梯度稀释，范围为10^-1-10^-6copies/ml。使用takarasybrpremixextaqtm进行qpcr。体系总体积25ul,2×sybrpremixdimereraser12.5ul，focsc-1/focsc-2引物浓度(10um)各0.75ul；模板2ul，ddh2o补充至25ul。

foc4qpcr反应程序95℃30sec；95℃5sec，55℃30sec，72℃30sec，40个循环。72℃10min。获得产物进行溶解分析95℃15sec，60℃30sec，95℃15sec，每次处理进行三次技术重复。基于qpcr的标准曲线的结果，计算测试样品中am真菌与foc4的丰富度。

2qpcr体系

2.1引物验证

用香蕉、am真菌和foc4的dna为模板，以对应的引物进行qpcr扩增，在3％的凝胶电泳的扩增结果见图1。结果表明，各对引物均可在原物种中扩增目的条带，三个长度都是200bp左右，引物扩增条带清晰，符合qpcr的扩增要求。

另外qpcr的溶解曲线表明特异性强，定量结果准确。香蕉、am真菌和foc4扩增产物的溶解温度tm分别是78.45℃，81.14℃和83.53℃。溶解曲线呈单一峰，无杂峰，无非特异性荧光，不受引物二聚体影响(图2)。

2.2目的基因的克隆转化

特异性片段foc242和amf250克隆到pmd-18-tvector载体，连接后转入到大肠杆菌dh5α中，进行蓝白斑筛选(图3b)，挑取白斑过夜培养后，进行质粒提取及pcr确认构建foc4242和amf250的标准重组质粒的结果(图3c)。结果表明，两个重组质粒能在特异性引物中扩增目的条带，片段长度正确，引物扩增条带清晰明亮，证明标准重组质粒构建成功，能够满足构建绝对定量pcr程序所需标准品的要求。

对标准重组质粒进行10×梯度稀释，范围为10^-1～10^-7copies/ml。am真菌的扩增标准曲线方程y＝-3.14x+36，r²＝0.999,e％＝108.44。各个浓度的重组质粒标准片段的扩增曲线较光滑，扩增呈现典型s型曲线，各个循环阈值间隔均匀分布，扩增效果理想(图4)。

2.4qpcr检测foc4生物量的分子体系

对标准重组质粒进行10×梯度稀释，范围为10^-1～10^-7copies/ml。foc4的扩增标准曲线方程y＝-3.46x+38.49，r²＝-0.992，e％＝94.62。各个浓度的重组质粒标准片段的扩增曲线较光滑，扩增曲线呈现典型s型，各个循环阈值间隔均匀分布，扩增效果理想(图5)。

本发明利用两对引物在巴西蕉根系中同时检测gi和foc4的生物丰富度，获得稳定可靠的检测方法。am真菌扩增结果明显，数据准确；采用引物focsc1/focsc2，对其敏感度加以验证发现foc4最低检出值低于0.1pg，说明focsc1/focsc2引物对于检测样品高度敏感，具有良好的可重复性。

本发明所用的根内球囊霉属gi和香蕉枯萎病菌foc4虽同为土壤真菌，但是亲缘关系较远。成功建立同时检测巴西蕉中am真菌与foc4丰富度的qpcr体系，本发明同时检测指用同一个dna模板检测，上两次机；香蕉、am真菌和foc4的特异性引物产物的溶解温度均可明显分离，溶解曲线呈单一峰，无杂峰，无非特异性荧光信号，表明在同一dna样本中，各自的生物信息不受其他物种信息所影响，定量结果准确，能够为am真菌抑制香蕉枯萎病菌的提供有力的技术支持。

实施例2

在本实施例中，设接种gi与foc4两因素处理，共四个处理组：1)ck，不接种gi和foc4；2)gi组，巴西蕉苗单接种gi；3)foc4组，巴西蕉苗单接种foc4；4)gi+foc4组，巴西蕉苗同时接种gi和foc4。

清水洗净巴西蕉组培苗根围培养基，把组培苗根系浸于gi与foc4接种剂中，ck处理以清水替代接种剂，接种剂体积按1ml/棵香蕉苗计算，浸根处理30min。在方形塑料盆中加入100g的混合基质，把浸根处理的巴西蕉苗定植于盆中，然后把浸根处理剩余的接种剂均匀施于同一处理塑料盆中，最后将200g沙土填充塑料盆，完全覆盖根部，浇透水。

试验共四个处理，每个处理重复10盆，每盆定植1棵巴西蕉苗。所有盆栽随机排列，置于华侨大学园艺系温室中培养，日/夜温度平均为30/22℃，相对湿度为80％。定植后两周，每天水雾喷洒巴西蕉叶片三次；每隔2周，每盆加入25ml去磷hoagland营养液。

巴西蕉苗定植60d后，收集样品，待测。

精确称取不同处理的香蕉根部样品200mg。按植物dna提取试剂盒说明书提取植物基因组dna。每个反应体系添加2ul作为qpcr反应模板。

反应体系和反应程序同实施例1。

从图6可以看出，本发明建立的qpcr检测体系，可以同时检测巴西蕉根系中gi和foc4丰度。接种gi处理，巴西蕉根系gi丰度达到2×10⁵copies/ml；接种foc4处理，巴西蕉根系foc4丰度达到1.2×10⁵copies/ml；然而，同时接种gi和foc4处理，巴西蕉根系gi与foc4丰度为1.3×10⁵copies/ml、0.3×10⁵copies/ml，较单接种处理，gi和foc4丰度分别下降35％、75％，但foc4丰度下降更为明显。以上结果表明，同时接种gi和foc4，gi具有良好的巴西蕉枯萎病菌foc4抑制作用。

序列表

<110>华侨大学

<120>一种同时检测香蕉中丛枝菌根真菌与香蕉枯萎病的引物组合物及qpcr方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggtgcgattctgtggagtgtgagg24

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<212>dna

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