用于肝素检测和pH响应的AIE荧光探针、合成方法以及应用与流程

本发明涉及有机发光材料领域，涉及ph响应以及肝素检测aie荧光探针的制备与发光性质的研究。

背景技术：

荧光传感器具有灵敏度出众、检测速度快、选择性高、便于操作等优点，目前已被广泛应用于生物医学、环境监测等诸多领域。在众多的荧光传感材料中，有机小分子为基础的荧光探针具有合成简单、成本低、易于操作等优点，获得了许多学者的青睐。

有机荧光分子目前在荧光传感领域得到了广泛的应用，是一类重要的荧光传感材料。然而，传统的有机荧光探针(如荧光素类、罗丹明类、花青素类探针)通常只在稀溶液中有较强的荧光发射，而在高浓度或聚集态会发生荧光淬灭现象。同时传统荧光探针的stokes位移通常也较小，并常常受到复杂环境的干扰。因此，合成灵敏度高、选择性好、光物理性质优异的有机荧光探针来克服聚集淬灭效应(aggregationcausedquenching,acq)是非常必要的。由于aie(聚集诱导发光)分子在聚集态下独特的发光性能，为解决传统荧光分子的聚集淬灭问题、制备turn-on型荧光传感器开辟了一个全新的思路。得益于聚集态(固态)下扭曲的分子构型，aie分子通常具有大的stokes位移。与此同时，研究表明聚集态下分子的抗光漂白能力明显要强于单分子状态。这些特点和优势均为提高aie荧光传感器的灵敏度，降低背景噪声提供了有利条件。

ph响应型荧光分子一般含有大量的弱电解质基团，它们容易发生质子化或者水解，如吡啶、氨基和羧基等。这些基团在ph变化的条件下这些基团会结合或者释放氢离子，从而会影响荧光分子在溶剂中的溶解度特别是极性较大的溶剂。

肝素带有很强的负电荷，具有复杂且广泛的生物学功能，并且可以和鱼精蛋白发生拮抗作用，还可以增加脂蛋白酶的活性，有效防治动脉粥样硬化。在医药学领域肝素具有重要的地位。传统的检测肝素的方法如分光光度法和毛细管电泳法等均存在一定的缺陷例如灵敏度较差，检测时间长，甚至部分药品有一定毒性，实验操作比较复杂等。

技术实现要素：

为了克服上述缺陷，本发明提供了一种用于肝素检测和ph响应的aie荧光探针、合成方法以及应用。本发明将电解质基团造成溶解度的变化与aie分子独特的发光性质联系起来成以设计ph响应型aie荧光探针。本发明中，用荧光探针与鱼精蛋白组成的复合物来检测肝素，利用静电作用来改变荧光探针的聚集状态通过分子的aie性质来实现检测肝素。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于肝素检测和ph响应的aie荧光探针，所述的aie荧光探针为bda-4cooh，其结构式如下：

所述的荧光探针具有良好的aie性质，在水和ch3oh的混合溶剂中，bda-4cooh的荧光强度会随着水含量的增加而出现增强，在520nm处出现发射峰。

bda-4cooh在v水：vch3oh＝9：1和ph为1的条件下荧光发射波长为520nm，随着ph不断的升高其荧光强度逐渐下降。

本发明还提供用于肝素检测和ph响应的aie荧光探针的合成方法，所述的荧光探针的合成方法包括以下步骤：

1)蒽与多聚甲醛在充满盐酸气体的环境下进行反应，得到9,10-二氯甲基蒽；

2)将步骤1)的产物通过与亚硫酸三乙酯反应，得到磷叶立德，10-二(二乙氧基磷酸甲基)蒽；

3)将步骤2)所得的产物在叔丁醇钾的催化下与4,4-二氰基二苯甲酮反应得到化合物bda-4cn；

4)将步骤3)所得产物经过naoh水解得到粗产物，所得粗产品纯化后即得到用于肝素检测和ph响应的aie荧光探针。

进一步的，所述步骤4)中，将步骤3)所得产物加入naoh、thf和，比例为naoh:thf:c2h5o5＝1:2:3。

进一步的，所述步骤4)中，反应温度为90℃，反应时间为20h。

更具体的合成方法为：

1.9,10-二氯甲基的制备

在1000ml三颈瓶中，依次加入蒽(ammol)，多聚甲醛(bmmol)，50mlhcl溶液和300ml1,4-二氧六环溶液，搅拌。在通入hcl气体的条件下，回流2h，反应液中不断有黄色固体析出，2h后停止通入hcl气体，反应液继续回流3h。然后，冷却至室温，抽滤，滤饼用1,4-二氧六环溶液淋洗两次，再用水淋洗一次，得到黄绿色固体，产率80％。

2.10-二(二乙氧基磷酸甲基)蒽的制备：

在反应瓶中加入9,10-二氯甲基蒽(ammol)和30ml亚磷酸三乙脂溶液，搅拌下回流反应12h。冷却至室温，抽滤，滤饼用石油醚淋洗两次得黄绿色固体，产率83％。

3.bda-4cn的制备：

氮气保护条件下，向250ml干燥的二颈瓶中，依次加入化合物9,10-二(二乙氧基磷酸甲基)蒽(ammol)、叔丁醇钾(bmmol)和100ml无水四氢呋喃溶液，置于0℃的冰水浴中冷却搅拌，待用。将化合物4,4-二氰基二苯甲酮(cmmol)的无水四氢呋喃溶液(20ml)逐滴加入上述溶液中，滴加完毕后，室温搅拌12h。然后，通过旋转蒸发仪旋干混合物，再加入5ml二氯甲烷溶液使其溶解，最后加入到200ml甲醇溶液中，过滤。

4.bda-4cooh的制备：

向100ml干燥的圆底烧瓶中加入化合物bda-4cn(ammol)、naoh与thf及乙醇按照一定比例配置的混合溶液90℃反应20h。产物真空浓缩后，用hcl酸化至ph＝1，萃取出有机层溶液，浓缩即得到所需产物。

本发明还提供aie荧光探针在鱼精蛋白定量检测和/或肝素定量检测中的应用。

本发明还提供aie荧光探针在鱼精蛋白定量检测中的应用，在v水：vch3oh＝9：1和ph为6的条件下，aie荧光探针的荧光强度随着鱼精蛋白浓度的增加而增加。

本发明提供aie荧光探针在肝素定量检测中的应用，在v水:vch3oh＝9:1和ph为6的条件下，aie荧光探针与鱼精蛋白复合物的荧光强度随着肝素浓度的增加而降低。

本发明还提供所述aie荧光探针的肝素检测方法，取荧光探针的甲醇溶液，充分震荡后向其中加入鱼精蛋白溶液，再向其中加入待检测溶液，温育培养后进行荧光检测。

相对于现有技术，本发明的有益效果：

本发明提供了一种具有aie性质的荧光探针bda-4cooh，实验结果表明这种荧光探针可以灵敏地对于不同的ph进行荧光响应，其荧光强度表现出显著的变化而且灵敏度极高(本发明的荧光探针对ph变化敏感特别是在碱性区域)，因此具有很高的应用价值；荧光探针bda-4cooh在一定条件下对鱼精蛋白具有较强的结合能力，利用肝素可以和鱼精蛋白发生拮抗作用从而实现了对肝素的异性响应。并且本发明所合成的aie荧光探针具有较大的改造空间，可以进行基团修饰，大大提升了探针应用于生物体内的可能性。

相比传统的aie荧光探针，本发明的bda-4cooh具有独特的激发波长和发射波长，比如本发明的荧光探针的发射波长为520nm；有识别作用，可直接用于荧光标记；

附图说明

为了更加清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需使用的附图作简要的介绍。

图1为本发明实施例中式结构荧光探针(bda-4cooh，以下同)的核磁h谱；

图2本发明实施例中式结构荧光探针的核磁c谱；

图3本发明实施例中式结构荧光探针的核磁质谱；

图4本发明实施例中式结构荧光探针的红外光谱；

图5本发明实施例中式荧光探针的aie性质荧光光谱；

图6本发明实施例中式结构荧光探针的在不同ph值条件下的荧光光谱；

图7本发明实施例中式结构荧光探针鱼精蛋白响应的荧光光谱；

图8本发明实施例中式结构荧光探针鱼精蛋白线性荧光光谱；

图9发明实施例中式结构荧光探针肝素响应的荧光光谱；

图10发明实施例中式结构荧光探针肝素线性荧光光谱；

图11发明实施例中式结构荧光探针肝素选择性。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施例，进一步阐述本发明。

实施例1，9,10-二氯甲基蒽的合成

在1000ml三颈瓶中，依次加入蒽(250mmol)，多聚甲醛(40g)，50ml浓hcl溶液和350ml1,4-二氧六环溶液，搅拌。在通入hcl气体的条件下，回流2h，反应液中不断有黄色固体析出，2h后停止通入hcl气体，反应液继续回流3h。然后，冷却至室温，抽滤，滤饼用1,4-二氧六环溶液淋洗两次，再用水淋洗一次，得到黄绿色固体，产率85％。

实施例2，10-二(二乙氧基磷酸甲基)蒽的合成

在反应瓶中加入9,10-二氯甲基蒽(20mmol)和20ml亚磷酸三乙脂溶液，搅拌下回流反应12h。冷却至室温，抽滤，滤饼用石油醚淋洗两次得黄绿色固体10-二(二乙氧基磷酸甲基)蒽，产率83％。反应流程如下所示：

实施例3，bda-4cn合成

氮气保护条件下，向250ml干燥的二颈瓶中，依次加入10-二(二乙氧基磷酸甲基)蒽(6mmol)、叔丁醇钾(20mmol)和100ml无水四氢呋喃溶液，置于0℃的冰水浴中冷却搅拌，待用。将化合物4,4-二氰基二苯甲酮(15mmol)的无水四氢呋喃溶液(20ml)逐滴加入上述溶液中，滴加完毕后，室温搅拌12h。然后，通过旋转蒸发仪旋干混合物，再加入5ml二氯甲烷溶液使其溶解，最后加入到200ml甲醇溶液中，过滤。反应流程如下所示：

实施例4，bda-4cooh的合成

向100ml干燥的圆底烧瓶中加入上述所得产物(50mg，2.1mmol)、naoh与thf及乙醇按照一定比例配置的混合溶液(naoh:thf:c2h5o5＝1:2:3)、90℃反应20h。产物真空浓缩后，用hcl酸化至ph＝1，萃取出有机层溶液，浓缩即得到所需最终产物bda-4cooh。反应流程如下：

图1为本发明实施例中式结构荧光探针(bda-4cooh，以下同)的核磁h谱；图2本发明实施例中式结构荧光探针的核磁c谱；图3本发明实施例中式结构荧光探针的核磁质谱；图4本发明实施例中式结构荧光探针的红外光谱。

实施例5，荧光探针的aie效应

将荧光探针配成1mm的甲醇溶液，接着分别取0.2ml的该溶液放置于5ml的玻璃瓶中，分别加入不同体积的甲醇溶液，最后补加水至总体积为4ml，混合均匀后获得不同含水量的混合溶液，最后将其逐一导入石英比色皿中进行荧光光谱测试。实验结果发现随着水含量的增加，其荧光强度不断的增强，这就表明该溶液具有良好的aie性质(图5)。本发明的荧光探针的aie性质：在水和ch3oh的混合溶剂中，当环境中不良溶剂的比例逐渐增加时bda-4cooh分子在环境体系中的溶解度逐渐降低，分子发生聚集导致分子内单键旋转受限和分子震动受限，这就导致非辐射跃迁的通道被关闭，能量主要以辐射形式发散。此时bda-4cooh分子的荧光强度会随着水含量的增加而出现增强，在520nm处发出强烈的荧光。

实施例6，不同ph值下荧光探针荧光发射光谱测试

取50微升0.5mg/ml荧光探针的甲醇溶液分别加入到3ml不同ph溶液中，充分震荡后转移至石英比色皿中进行荧光检测。在酸性介质条件下，荧光探针溶解度不高自身发生聚集，这种聚集使得分子内转动的非辐射能量衰减得到抑制,产生聚集诱导发光现象；在碱性介质条件下，荧光分子结构中羧基发生质子解离，探针处于离子状态，溶解度增加聚集程度下降，此时分子激发态能量主要以非辐射跃迁的方式发散从而导致荧光强度下降(图6)。本发明的荧光探针对于ph的变化有较高的灵敏度：bda-4cooh在v水:vch3oh＝9:1(其指甲醇溶液中水与甲醇的体积比)和ph为1的条件下荧光发射波长为520nm，随着ph不断的升高其荧光强度逐渐下降。

实施例7，荧光探针鱼精蛋白响应

取50微升3.5mg/ml荧光探针的甲醇溶液分别加入到3ml不同ph缓冲溶液中，充分震荡后再向其中加入不同浓度的鱼精蛋白溶液，之后进行荧光检测。bda-4cooh分子中存在四个羧基为该分子表面提供了负电荷，所以bda-4cooh分子会和溶液中带有正电荷的鱼精蛋白发生静电作用并相互结合，分子从游离态变为聚集态从而引发了荧光增强，因此利用该分子的aie性质实现了对鱼精蛋白的“turn-on”的检测。实验结果发现随着体系中鱼精蛋白浓度的不断增加，溶液荧光强度不断地增加。根据实验数据算出其检测限为29.8ng/ml，线性范围为0.02-0.4μg/ml(图7-8)。本发明的荧光探针对于鱼精蛋白有较高的灵敏度：在v水:vch3oh＝9:1和ph为6的条件下，探针的荧光强度随着鱼精蛋白浓度的增加而增加；

实施例8，荧光探针肝素响应

取50μl3.5mg/ml荧光探针的甲醇溶液分别加入到3ml不同ph缓冲溶液中，充分震荡后再向其中加入60微升0.1mg/ml鱼精蛋白溶液，再向其中加入不同浓度的肝素溶液。混合物温育培养30分钟，最后再进行荧光检测。鱼精蛋能够与肝素成稳定的盐而使肝素失去抗凝作用。因此，当肝素加入到bda-4cooh分子和鱼精蛋白复合物体系中时，肝素会从鱼精蛋白中剥离出bda-4cooh分子，此时分子的状态由聚集态变为游离态，从而导致荧光强度下降。实验结果发现随着体系中肝素的浓度不断增加，溶液荧光强度不断地减弱。根据实验结果得出肝素的检测限为37ng/ml、线性范围为0.08-8μg/ml(图9-10)。本发明的荧光探针和鱼精蛋白复合物对于肝素有较高的灵敏度,在v水:vch3oh＝9:1和ph为6的条件下，aie荧光探针与鱼精蛋白复合物的荧光强度随着肝素浓度的增加而降低。

实施例9，荧光探针的肝素选择性

取50微升3.5mg/ml荧光探针的甲醇溶液分别加入到3ml不同ph缓冲溶液中，充分震荡后再向其中加入60微升0.1mg/ml鱼精蛋白溶液，再向其中加入60微升1mg/ml的不同肝素结构类似物，混合物温育培养30分钟，最后再进行荧光检测。由于这些肝素类似物与鱼精蛋白的结合能力相对较弱，所以不能有效的将bda-4cooh分子从鱼精蛋白上剥离。实验结果证明荧光探针-鱼精蛋白复合物只对肝素有明显的荧光响应。(图11)

本发明所述的实例是对本发明的说明而不能限制本发明，在与本发明相当的含义和范围内的任何改变和调整，都应认为是在本发明的范围内。