一种细胞快速穿膜肽及其用途的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种细胞快速穿膜肽及其用途。
背景技术：
：穿膜肽是一类能高效携带外源物质进入细胞的短肽，在药物递送中应用广泛。部分穿膜肽可以实现直接穿膜递送。所以，穿膜肽一直是新型纳米递送体系的研究热点之一。然而现有的穿膜肽大多为天然序列，递送速度(一般为10min以上)不尽人意，序列较长不易合成，具有免疫原性，所以目前依然急需一种安全经济的细胞快速穿膜肽。技术实现要素：本发明提供一种细胞快速穿膜肽，以解决现有技术中穿膜肽的穿膜速度慢的问题。本发明的细胞快速穿膜肽采用如下技术方案：一种细胞快速穿膜肽，所述穿膜肽的氨基酸序列为：arg-trp-lys-arg-trp。优选的，所述穿膜肽30s内即可穿过细胞膜。本发明还提供了一种复合物，具体技术方案为：所述复合物包括如上所述的细胞快速穿膜肽和外源物质。优选的，所述外源物质为货物分子和/或标记分子。优选的，所述货物分子包括但不限于下述任意一种或几种的组合：糖类、蛋白质、核苷酸、药物分子前体和纳米粒子；所述标记分子为荧光素和/或生物素。本发明还提供了如上述任意一项所述的细胞快速穿膜肽的用途，具体技术方案为：所述穿膜肽在将外源物质递送至细胞内中的应用。优选的，所述穿膜肽在制备可穿透细胞膜的药物中的应用。本发明的有益效果是：本发明的细胞快速穿膜肽30s内即可从细胞外进入细胞内，穿膜速度快。本发明的细胞快速穿膜肽安全性好，无细胞毒性；本发明的细胞快速穿膜肽仅包含5个氨基酸，无免疫原性。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明的实施例3测得的贴壁细胞分别与fitc和fitc标记的细胞快速穿膜肽(arg-trp-lys-arg-trp)共培养30s的荧光显微镜观察图；其中，左图为在贴壁细胞中仅加入fitc30s后的荧光显微镜观察图，右图为在贴壁细胞中加入fitc标记的穿膜肽30s后的荧光显微镜观察图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。实施例1本发明的细胞快速穿膜肽的合成1)活化树脂：称取1000mgfmoc-trpwangresin，加入30mldmf浸泡30min，使其充分溶胀。2)脱保护：抽滤除去浸泡树脂的30mldmf，加入含质量百分比为20％哌啶的dmf溶液30ml，氮气吹沸25min，然后抽滤除去，用10ml异丙醇和dmf交替洗涤树脂三次，而后用茚三酮法检测树脂，树脂应成黑色或紫色。3)缩合反应：连接下一个氨基酸，称取1.4mmol/g树脂的fmoc-氨基酸，以tbtu/hobt/diea的30mldmf为反应液，室温下氮气吹沸反应2h。反应后，用10ml异丙醇和dmf交替洗涤树脂三次。检测氨基。4)重复步骤2)-3)过程：按多肽的顺序自c端向n端延伸多肽。多肽序列为：arg-trp-lys-arg-trp。5)多肽切割：用氮气将多肽-树脂复合物吹干，按tfa/phenol/超纯水/thioanisole/edt/tis(80/5/5/5/3/2，体积比)的比例配成30ml混和切割试剂。将肽树脂置于圆底烧瓶中，加入切割液磁力搅拌2h，砂芯过滤器除去树脂，滤液直接滴入冷冻乙醚中，5000r/min离心沉淀，冻干至恒重即得粗肽。6)粗肽用hplc纯化，纯化条件为10％至100％的乙腈梯度洗脱30分钟，产物纯度为97％。得到纯化后的多肽，多肽序列为：arg-trp-lys-arg-trp。实施例2细胞毒性实验1)取48孔板，每孔加入含有5×104个宫颈癌hela细胞培养液，37℃，5％二氧化碳培养箱24小时至细胞贴壁。2)配置含1mm浓度的穿膜肽(arg-trp-lys-arg-trp)的培养基，以无穿膜肽的培养基为阴性对照孔(control)，37℃，5％二氧化碳培养48h。培养基配方为：含10％胎牛血清的dmem培养基。3)贴壁细胞每孔加入20μlmtt，继续孵育4h之后弃掉培养液，每孔加入150μldmso，振荡10min。4)选择490nm波长，在酶标仪免疫检测仪上通过光吸收值计算细胞存活率。表1穿膜肽毒性测试由表1可知，本发明的穿膜肽在高浓度(1mm)条件下长时间(48h)培养对细胞存活率没有明显影响，穿膜肽安全无毒。实施例3本发明的细胞快速穿膜肽的穿膜速率测试1)在贴壁细胞中分别加入含有一定浓度fitc和fitc荧光标记的穿膜肽(arg-trp-lys-arg-trp)的培养基，孵育30s后小心吸去培养基，并肝素-pbs洗涤贴壁细胞三次。培养基配方为：含10％的dmem培养基。2)在荧光显微镜下进行拍照(详见说明书附图图1，图1中左图为在贴壁细胞中加入fitc30s后的荧光显微镜观察图；图1中右图为在贴壁细胞中加入fitc标记的穿膜肽30s后的荧光显微镜观察图)。由图1可知，本发明的细胞快速穿膜肽能够在30s内高效穿膜，其穿膜十分迅速。实施例4穿膜肽穿膜暨荧光检测实验1)在贴壁细胞中分别加入含有一定浓度fitc、fitc荧光标记的穿膜肽(arg-trp-lys-arg-trp)和荧光fitc标记的参照肽(arg-arg-arg-arg-arg)的培养基，孵育0.5和30min后小心吸去培养基，并pbs洗涤贴壁细胞三次。培养基配方为：含10％的dmem培养基。2)加入胰酶反应5min至细胞浮起，再加入新鲜培养基中止反应。3)在流式细胞仪中测定10000个细胞具有的荧光量。以fitc为对照和参比(100％)。表2穿膜肽穿膜暨荧光检测实验fitcfitc荧光标记穿膜肽fitc荧光标记参照肽0.5min胞内总荧光量％100600050030min胞内总荧光量％10070006000由表2可知，fitc荧光标记穿膜肽组胞内总荧光量较fitc组有几何数量级增长，本发明的穿膜肽可高效穿膜。和参照肽相比，则在0.5min有明显的数量级优势，证明其可迅速穿膜。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>南阳师范学院<120>一种细胞快速穿膜肽及其用途<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>5<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1argtrplysargtrp15<210>2<211>5<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2argargargargarg15当前第1页1 2 3