专利名称：一种mmp2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
一种MMP2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应
用
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种MMP2基因的原位杂交检测试剂盒及 其检测方法和应用
背景技术：
2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做了一个年度报告， “认为人类在抗癌大战中是失败”，也就是说癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战 失败的几个因素是1、肿瘤细胞异质性；2、肿瘤细胞耐药性；3、抗癌药物设计思路不完善 等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。本发明人在研究中发现，导致 癌症死亡率不降的另二个重要原因是1、不能做到真正的早期诊断；2、转移的病理机制不 清楚。依照传统的医学影像及和其它生化(如蛋白标记物)指标来诊断癌症，认为占位性 癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断(更小些有时无症状体征)，这一临床概念值得认 真讨论。影像医学的2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度， 1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿 瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可 能是一年或两年、甚至三年以上，很难证实的是在这个过程中，肿块是癌症唯一的发生地和 单独的病灶。临床上已证实一旦形成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他 部位克隆生长；一旦切除原发灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此， 在临床上以2公分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶 时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，这时已经是晚期了，这是导致癌症死亡率 不降的真正原因。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一组钙锌依赖性蛋白酶家 族，具有降解基底膜和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的作用，在维持ECM的生 理动态平衡过程中发挥重要作用，与其抑制剂金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, T IMP)共同调节着ECM及细胞基底膜的完整性。MMP根据各自特 异底物的不同，大致分为明胶酶类(如MMP-2、MMP-9)，胶原酶类(如MMP-1、MMP-8、MMP_13 等)，基质溶解素类(如MMP-3、MMP-10、MMP-11、ΜΜΡ-7等)膜型基质金属蛋白酶类(如 MTl-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP 等)及其他类(如 MMP_19、MMP_22 等)。TIMP 家族则按发现的 先后顺序命名为 TIMP-I、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIMP-1、TIMP-2、TIMP-4 为可溶性分泌 性蛋白质，而TIMP-3可与ECM结合为不溶性分泌性蛋白质。在肿瘤的浸润转移过程中，MMP 活性上调可促进ECM降解，破坏细胞基底膜，并通过细胞外基质的改建，促进肿瘤新生血管 的形成，从而促进肿瘤的浸润与转移，而TIMP则起抑制作用。高转移倾向的肝细胞癌患者 组织MMP-2水平显著高于低转移倾向患者，MMP-2的表达增加与肝细胞癌的包膜侵犯密切 相关，同时MMP-2的过度表达与肝癌侵袭性有关。在其他类型的肿瘤中，研究发现MMP-2表 达升高为喉癌侵袭转移及不良预后的独立预测指标；MMP-2和MMP-7高表达与膀胱移行上皮肿瘤侵袭及转移相关。研究表明，MMP和TIMP的产生与激活的失平衡是肿瘤浸润和转移 的关键，MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1、MMP-7/TIMP-I的比例失衡与肿瘤侵袭性密切相关。 TIMP-3通过抑制MMP阻止肿瘤的局部生长，阻止继发灶的形成，并限制肿瘤新生血管的形 成，还可通过直接诱导肿瘤细胞凋亡而发挥其肿瘤侵袭、转移的抑制作用。TIMP-3高表达 可以显著抑制具有中等侵袭性的宫颈癌细胞He-la、高侵袭性的纤维肉瘤细胞HT1080以及 肝癌细胞PLC/PRF/5在体外对基底膜的侵袭，TIMP-3表达水平的下调或丢失促进肿瘤的发 展。MMP2(基质金属蛋白酶)，NM_0045303549bp mRNA，16ql3_q21 〃，cds :312…2294bp。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至 今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或本发明采用核酸原为 杂交技术检测MMP2基因的表达量来诊断临床各类癌症，有非常重要临床价值癌细胞形成 (单克隆时)就能做到早期预测诊断。原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起 来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含 有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链 即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细 胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
发明内容本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种MMP2基因的原位杂交检测试 剂盒的用途。本发明的再一的目的是，提供一种MMP2基因的原位杂交检测试剂盒。本发明的另一的目的是，提供一种MMP2基因的原位杂交检测方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种MMP2基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物 中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的癌症是肝癌或宫颈癌。所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P中的一种。所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素 中的一种。所述的非放射性标记物优选自地高辛。所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种MMP2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交 探针序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是一种MMP2基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；
b、检测a步骤得到的杂交复合体。本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂 交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括仪器操作1).将待测标本放入反应槽中；2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；3).仪器自动弃去液体，自动后固定；4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C )；5).仪器自动弃去液体，自动清洗；6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C )；7).仪器自动弃去液体，自动清洗；8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；10).取出封片镜检。本发明优点在于1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。3、本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有 显著不同。本发明可以在基因水平上检测MMP2基因异常表达，在影像医学检查未发现占位 性癌病灶复发之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿瘤之前，能及早做到以上基 因表达异常的信息采集，给临床癌症病患一个真正的早期诊断以及治疗后转移复发及早预 测。这样才有可能实施癌症的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治癌 症恶疾。
图1是本发明实施例中肝癌转移病人MMP2基因表达图片。图2是本发明实施例中宫颈癌转移病人MMP2基因表达图片。图3是本发明实施例中正常人MMP2基因表达图片。
具体实施方式下面结合附图对本发明具体实施方式
作详细说明。实施例1一种MMP2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所 述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和 标本组成如下消化液 100 μ 1/管 1管/盒 无色透明液体保护液 100 μ 1/管 1管/盒 无色透明液体预杂交液 1300 μ 1/管 2管/盒 无色透明液体
正义杂交液10μ1/管 1管/盒 无色透明液体
反义杂交液 ΙΟμΙ/管 1管/‘盒 无色透明液体
封闭液 1000 μ 1/管1管/‘盒 无色透明液体
碱性磷酸酶抗体1 μ 1/管 1管/盒 无色透明液体
显色剂A 175 μ 1/管 1管/盒 黄色液体
显色剂B 320 μ 1/管 1管/盒 无色透明液体
缓冲液I IOx 90ml/瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体
缓冲液II IOx 80ml/瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体
缓冲液III IOx 20m/瓶 3瓶/盒 浅黄色或无色透明液体
缓冲液IV IOx 90ml/瓶 1瓶/盒 浅黄色或无色透明液体
固定液 90ml/瓶 1瓶/‘盒 无色透明液体
阳性对照标本6片/盒
上述试剂成分说明(所有试剂购自SIGMA)
1、消化液:20mg/ml 蛋白酶 K，IOOmg 蛋白酶 K，加 DEPC-H2O 5ml ；
2、保护液0. 2g的glycine加入Iml的IX缓冲液I ；
3、预杂交液1X缓冲液II 7. 5ml
50XD 3ml
10mg/ml yest t-RNA 750ul
llmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul
0.04M EDTA 3ml
50% formamide 15ml
4、封闭液0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入Iml IX缓冲液
5、IOx 缓冲液 I (PH7. 1-7. 4)
NaCl 80g
Na2HPO4. 12H20 360g
KCl 2g
KH2P042g
加三蒸水至11，并高压灭菌；
6、IOx 缓冲液 II (PH7. 0)
NaCl 175.3g
柠檬酸钠88. 2g
HCl几滴
加三蒸水至11，并高压灭菌；
7、缓冲液 III (PH7. 9)
Tris 121.Ig
NaCl 87.66g
HCl 60ml 左右
加三蒸水至11，并高压灭菌；
8、缓冲液IV:
IM Tris-HCl (PH9. 5) =Tirs 121. Ig 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，调 PH 至 9. 5，加 水至11，并高压灭菌；IM NaCl =NaCl 58. 44 加水至 11，并高压灭菌；0. 5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高压灭菌；9、固定液多聚甲醛40g加IX缓冲液I至11，稍加热(约50_60度)搅拌至溶 解；10、显色剂 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、显色剂 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。实施例2一种MMP2基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用一、标本处理1、用IOml的离心管，装4. 5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋 巴细胞分离液(血淋巴细胞分离液=1 1.5)的离心管中，2000r/min离心IOmin ；2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的IX缓冲液I，混 勻，1500g/min 离心 IOmin ；3、弃上清·沉淀加入约两倍的1 X缓冲液I，混勻，1500g/min离心IOmin ；4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用IX缓冲液I洗5min。每缸 可以放16片；6、标本可保存在_20°C，或继续做实验。二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度1、将IOX缓冲液I用三蒸水按1 10稀释成IX缓冲液I ；2、将20X缓冲液II用三蒸水按1 10稀释成2X缓冲液II ；按1 100稀释成0. 2X缓冲液II ；按1 200稀释成0. 1 X缓冲液II ；3、将IOX缓冲液III用三蒸水按1 10稀释成1 X缓冲液III ；4、10 X缓冲液IV用三蒸水按1 10稀释成X缓冲液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、实验步骤1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次 实验做一对阳性对照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX缓冲液199.9ml，即为使用浓 度)20ml。37°C水浴预热10分钟。放进16张玻片，37°C处理12min，再用1 X缓冲液I洗 5min ；3、用0. 2%的保护液(保护液Iml加IX缓冲液I99ml即为使用浓度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在 42°C恒温水浴箱中3h以上；
5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张 加反义杂交液20ul/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内在42°C恒温水浴箱中用2X缓冲液II洗两次，每次15min在42°C恒温水浴箱中用0. 2X缓冲液II洗一次，每次15min在42°C恒温水浴箱中用0. 1 X缓冲液II洗两次，每次15min ；8、用IX缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、将玻片放入保湿盒内，加0.5% 1封闭液(Iml封闭液加5ml IX缓冲液 III) IOOul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min ；10、取出玻片，用IX缓冲液III洗30s，自然干燥；11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml 1 X缓冲液III) IOOul/ 片，盖紧保湿盒在室温下作用30min ；12、取出玻片，用IX缓冲液III洗3次，每次15min;13、IX缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73. 3ul，显色剂B157. 5ul加到30ml 1 X缓冲液IV中，混勻)，室温避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX缓冲液I混勻)封片镜检。四、结果判断在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。阳性对照标本加反义杂交液的应该80%以上染上紫色。所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克 服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探 针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察 mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的MMP2 基因表达量，用来确定癌症是否发生和/或转移。临床研究表明，MMP2基因具有广谱性，因为MMP2基因在正常人中表达低或零表 达。如果MMP2基因高表达，说明癌症已经复发、转移、扩散，从而获得癌症的诊断信息。当 检测到MMP2基因的表达高于正常对照时，则可预测受试者为癌症早期转移或癌症转移易 感者，这些癌症包括肝癌或宫颈癌。本发明实施例采样为肝癌转移病人5名，宫颈癌转移病人5名，正常对照组5名。 抽所有待检人的外周血3-5毫升(分离白细胞)做原位杂交。结果表示，所有癌症转移病 人MMP2基因有过度表达，细胞染色；正常对照组MMP2基因不表达，细胞无染色。具体结果 请见图1，图2和图3。实施例3用MMP2基因试剂盒检测宫颈癌转移疾病与用CA125基因试剂盒检测宫颈癌转移 疾病之间平行实验。
为了科学评价上述基因各自在宫颈癌转移疾病的特异性、敏感性、准确性。我 们用平行试验的方法，同时检测上述基因的mRNA，检测技术采用核酸原位杂交技术，用同 一例宫颈癌转移疾病患者的外周血，同时检测MMP2基因和CA125(CA125(肿瘤标记物)， NM-024690)基因的mRNA(进行核酸原位杂交、免疫组化染色、镜下记数、结果报告等均采用 实施例1和实施例2的原位杂交技术的相同方法和步骤及试剂)。发现MMP2基因在宫颈癌 转移疾病病人中表达量比CA125基因在同一疾病病人的表达量要高。结果表明，MMP2基因 对宫颈癌转移疾病诊断的特异性、敏感性、准确性比CA125基因更好，原位杂交基因表达图 显示，MMP2基因的表达量是70%，CAl25基因的表达量是50%。本发明的试剂盒作于宫颈 癌转移疾病诊断的指标有非常重要的临床意义。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技术(上海)有限公司<120> 一种MMP2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用<130>/<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>3549<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1acatctggcggctgccctcccttgtttccgctgcatccagacttcctcaggcggtggctg60
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权利要求
一种MMP2基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的癌症是肝癌或宫颈癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的杂交探针序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于所述的标记物选自放射性核素或 非放射性标记物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P 中的一种。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物选自生物素、地高 辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物优选自地高辛。
8.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于所述的试剂盒还包括增效剂，所述 的增效剂是碱性磷酸酶抗体。
9.一种MMP2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述的 杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。
10.一种MMP2基因的原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤a、将权利要求9所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。
11.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于a步骤中形成杂交复合体的条件为 核酸杂交的温度为42°C ；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或 组织细胞标本。
全文摘要
本发明涉及一种MMP2基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种MMP2基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物中的应用。本发明优点在于本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
文档编号C12Q1/68GK101993925SQ20091005616
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月10日 优先权日2009年8月10日 公开号200910056161.发明者张云福, 裘建英 申请人:芮屈生物技术(上海)有限公司