本发明涉及体外诊断技术领域，尤其是涉及一种β-葡萄糖醛酸酶的纯化方法。
背景技术：
β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuroidase）是一种糖苷类水解酶，具备对β-葡萄糖苷酸类、固醇类的酶解/水解能力。该酶除了在高等植物、微生物中被发现外，也存在于动物的几乎所有组织中，在肝组织中含量最多。在高等动物中类固醇激素是以葡萄糖醛酸苷的形式运送到靶细胞中，在β-葡萄糖醛酸酶的作用下，转变成游离的类固醇，由此表现出激素的作用；该酶还参与粘多糖代谢中的分解过程，可从寡糖断片的非还原末端将葡萄糖醛酸残基游离出来。目前该酶被广泛应用于类固醇、非类固醇类等物质的检测。
此外，β-葡萄糖醛酸酶活性测定对早期肿瘤具有一定的临床意义，当机体组织细胞异常增生或发生恶变时，该酶的活性明细增高，正常人血清中β-葡萄糖醛酸酶的活性最低，随着细胞的增生变化，其活性逐渐增高，至发生癌变时，呈显著性增高。
目前国内外许多专家和学者从各种植物原料和微生物中获得了多种β-葡萄糖醛酸酶，但植物来源酶的活性远比微生物来源酶的活性低。早在80年代，国外学者就开始将β-葡萄糖醛酸酶的检出用于判断大肠杆菌的存在，说明大肠杆菌中富含β-葡萄糖醛酸酶，从大肠杆菌中提取β-葡萄糖醛酸酶的方法是利用硫酸铵对蛋白质的分级沉淀作用结合柱层析，但是来源于细菌和真菌中产生的一些β-葡萄糖醛酸酶普遍存在酶表达量不高，诱导产酶缓慢，酶活偏低等问题。目前天然动物提取来源的β-葡萄糖醛酸酶纯化方法是以动物的肝脏或内脏为原料，匀浆后分别用硫酸铵和乙醇分级沉淀，再经等点聚焦，分子筛层析，但回收率不高（仅有0.19%），并且纯化过程步骤过多，操作繁琐。因此，寻求一种相对简单、实用、回收率较高的纯化β-葡萄糖醛酸酶的方法势在必行。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种方法简单、周期短、成本低且回收率高的β-葡萄糖醛酸酶的纯化方法。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的β-葡萄糖醛酸酶的纯化方法包括下述步骤：
第一步，取成年蜗牛，饥饿1-2天排出消化道内的食物后，从壳口顺着贝壳螺旋的方向沿缝合线剪开贝壳，直至壳顶，然后将旋绕在壳轴上的软体部分取下来；
第二步，将剪下的软体部分置于培养皿中，剪开内脏团外包裹的体壁，将卷曲的内脏轻轻拉伸，裸露出充盈红棕色消化液的消化腺；用手术钳夹住消化腺的一端拉出使其与其他内脏组织分离后，立即放入搁置在冰板上的培养皿中；
第三步，用针头刺穿消化腺，将里面流出的粘稠液体和消化腺分别收集起来，并在4℃条件下，经8500-15000r/min离心15-45min，除去沉淀，然后将两者的上清合并；
第四步，将合并的上清过0.22-0.45μm的滤膜过滤，得到含β-葡萄糖醛酸酶粗提物；
第五步，将第四步得到的粗提物过deae离子交换柱进行线性梯度洗脱，得到的洗脱液首先测定酶活性，然后将酶活性较高的洗脱液合并，得到β-葡萄糖醛酸酶纯化物，加入防腐剂（叠氮化钠或/和p300，添加量为0.1%-0.5%）及抗氧化剂后低温（2℃~8℃）保存。
本发明所述的成年蜗牛可为白玉蜗牛、罗曼蜗牛、华蜗牛、玛瑙蜗牛或散大蜗牛，其体重约为30~50g。
第二步中，当消化腺与其他内脏组织分离的同时在消化腺上滴加保护缓冲液。所用的保护缓冲液可以为ph6.5-7.50.01m的磷酸盐缓冲液、tris-hcl、goods、heps中的任意一种。保护缓冲液中含有浓度0.1m-0.2m的抗氧化剂，所用的抗氧化剂为维生素c、异维生素c、还原性谷胱甘肽中的一种或两种以上混合物。
第五步对粗提物过deae离子交换柱进行线性梯度洗脱时，所用的洗液为含有0.01-1mnacl的ph7.4-8.00.01m的磷酸盐缓冲液或tris-hcl。
本发明的优点在于活材（蜗牛）来源丰富，价格低廉且易获得，纯化方法简便易行，周期短，纯化得到的β-葡萄糖醛酸酶活性达100000u/ml以上，稳定性好，回收率高（达到60%以上），可完全满足体外诊断试剂盒的要求，具有较高的开发应用价值。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明方法做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。
实施例1本发明所述的β-葡萄糖醛酸酶的纯化方法包括下述步骤：
第一步，取体重35g成年白玉蜗牛，饥饿1天，使其排出消化道内的食物后，从壳口顺着贝壳螺旋的方向沿缝合线剪开贝壳，直至壳顶，然后将旋绕在壳轴上的软体部分取下来；需要注意的是，在剪的过程中需要不断用镊子去除碎贝壳，只保留中央壳轴，然后小心地将旋绕在壳轴上的软体部分取下来，不要破坏内部的软体结构；
第二步，将剪下的软体部分置于培养皿中，用剪刀剪开内脏团外包裹的体壁，掀开体壁，将卷曲的内脏轻轻拉伸，即可看到充盈红棕色消化液的消化腺，在消化腺上滴加ph6.5-7.50.01m磷酸盐缓冲液后，用手术钳夹住消化腺的一端缓慢拉出使其与其他内脏组织分离，注意保证腺体不被临近的肠道和卵巢-睾丸污染，拉出后的消化腺立即放入搁置在冰板上的培养皿中；
第三步，用注射器针头刺穿消化腺，将里面流出的棕色的粘稠液体（有些还含有未消耗的食物碎片）和消化腺分别收集起来，并在4℃条件下，分别将液体和刺破的消化腺8500-15000r/min离心20min，除去沉淀，然后将两者的上清合并；
第四步，将合并的上清过0.22μm的滤膜，过滤后得到含β-葡萄糖醛酸酶的粗提物；
第五步，将得到的粗提物过deae离子交换柱进行线性梯度洗脱（先用ph7.4-8.0的平衡缓冲液如0.01m的磷酸盐或tris-hcl缓冲液冲洗除去杂蛋白，然后再用nacl从浓度0.01-1m进行线性梯度洗脱），得到的洗脱液首先测定酶活性，然后将od值≥0.05（稀释5000倍）的洗脱液合并，即为β-葡萄糖醛酸酶纯化物，加入0.1%叠氮化钠、0.1m维生素c，4℃保存。
经测定，其回收率为68%。
实施例2本发明所述的β-葡萄糖醛酸酶的纯化方法包括下述步骤：
第一步，取体重45g成年罗曼蜗牛，饥饿2天，使其排出消化道内的食物后，从壳口顺着贝壳螺旋的方向沿缝合线剪开贝壳，直至壳顶，然后将旋绕在壳轴上的软体部分取下来；需要注意的是，在剪的过程中需要不断用镊子去除碎贝壳，只保留中央壳轴，然后小心地将旋绕在壳轴上的软体部分取下来，不要破坏内部的软体结构；
第二步，将剪下的软体部分置于培养皿中，用剪刀剪开内脏团外包裹的体壁，掀开体壁，将卷曲的内脏轻轻拉伸，即可看到充盈红棕色消化液的消化腺，在消化腺上滴加ph6.5-7.50.01mtris-hcl缓冲液后，用手术钳夹住消化腺的一端缓慢拉出使其与其他内脏组织分离，注意保证腺体不被临近的肠道和卵巢-睾丸污染，拉出后的消化腺立即放入搁置在冰板上的培养皿中；
第三步，用注射器针头刺穿消化腺，将里面流出的棕色的粘稠液体（有些还含有未消耗的食物碎片）和消化腺分别收集起来，并在4℃条件下，分别将液体和刺破的消化腺8500-15000r/min离心30min，除去沉淀，然后将两者的上清合并；
第四步，将合并的上清过0.22μm的滤膜，过滤后得到含β-葡萄糖醛酸酶的粗提物；
第五步，将得到的粗提物过deae离子交换柱进行线性梯度洗脱（先用ph7.4-8.0的平衡缓冲液如0.01m的磷酸盐或tris-hcl缓冲液冲洗除去杂蛋白，然后再用nacl从浓度0.01-1m进行线性梯度洗脱），得到的洗脱液首先测定酶活性，然后将od值≥0.05（稀释5000倍）的洗脱液合并，即为β-葡萄糖醛酸酶纯化物，加入0.2%p300、0.1m还原性谷胱甘肽，2℃保存。
经测定，其回收率为70%。
实施例3纯化物性能测定
1、酶活力测定方法：
以对硝基苯基-β-d--葡萄糖苷（pnpg）为底物进行酶解，底物水解后释放出来的对硝基苯酚在400-420nm可见光范围内有特征吸收峰，可直接在400-420nm之间比色测定。
2、酶稳定性测定方法：37℃热加速测定稳定性。
3、测定结果
3.1酶活力测定结果
按照上述酶活力测定方法测定实施例1和实施例2纯化得到的β-葡萄糖醛酸酶，其结果如下表1所示：
表1
结论：从表1中数据可以看出，本发明实施例1和实施例2纯化得到的β-葡萄糖醛酸酶od值基本一致，高于对照，说明酶活力高于对照。
3.2稳定性测定结果
按照上述酶稳定性测定方法测定实施例1和实施例2纯化得到的β-葡萄糖醛酸酶，其结果如下表2、表3所示：
表2
表3
从表2、表3数据可以看出：本发明实施例1和实施例2纯化得到的β-葡萄糖醛酸酶2℃-8℃放置14d和37℃放置14d稳定性降幅均在10%以下，优于对照。
实施例4纯化物用途说明
以醛固酮检测试剂盒为例进行测试，该试剂盒的反应模式为竞争法。用此试剂盒检测ald存在异常高值样本，将实施例1纯化的β葡萄糖醛酸酶添加至抗体稀释液中，（抗体稀释液中其实无抗体，作为试剂盒一个组分），其结果如下表4所示：
表4
结论：从表4数据可以看出，该试剂盒通过添加本申请实施例1纯化的β葡萄糖醛酸酶，能有效的消除异常高值。