复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体及其复性生产舍雷肽酶的方法与流程

本发明涉及一种蛋白质聚集体，具体是涉及具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体，同时涉及由该多肽包涵体复性生产舍雷肽酶的方法。
背景技术：
：舍雷肽酶是一种由叫做serratiae15(沙雷氏菌e15)肠细菌合成的蛋白酶。这种细菌可以在蚕的肠道内发现。沙雷氏菌有很多种类，但除e15菌大部分的沙雷氏菌具有致病性。舍雷肽酶具有很强的溶解纤维蛋白块、消除黏性脓痰和净化炎症病灶面等作用，临床广泛用于呼吸道疾病引起的排痰困难。舍雷肽酶具有化痰、减轻炎症反应、消除水肿或肿胀的作用。舍雷肽酶在许多国家(如日本)都被当做替代药物使用，并且有很长的应用历史。最近的研究还提供了更多它在治疗疼痛和炎症方面有效的证据。其中包括气道慢性肺疾病，慢性耳鼻咽喉疾病，腕管综合征，下颌疼痛，骨关节炎和水肿等。但舍雷肽酶的生产主要是采用从天然菌株沙雷氏菌e15菌种的发酵液中提取，该工艺由于沙雷氏菌研究资料有限，天然菌株发酵不稳定，舍雷肽酶对于菌体本身的毒害性，导致该工艺一直未能取得更大的突破，最终使得舍雷肽酶生产成本高昂，产品市场推广和应用有限。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供一种生产周期短、且复性后具备舍雷肽酶高活性的多肽包涵体。本发明的技术方案是提供一种复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体，编码该多肽包涵体的基因序列如seqidno：3所示，或者基因序列为seqidno：3所示的序列经消除、添加、取代一个或多个碱基后能够编码复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体的基因序列。进一步地，多肽包涵体的氨基酸序列如seqidno：4所示，或者氨基酸序列为seqidno：4所示序列经消除、添加、取代一个或多个氨基酸后能够形成复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体的衍生氨基酸序列。进一步地，合成如seqidno：3所示基因序列的正向引物为spce28-f，序列如seqidno：1所示，反向引物为spce22-r，序列如seqidno：2所示。进一步地，用于转化表达菌株的重组质粒为pet28a-sp。进一步地，上述基因序列的模板基因来源为沙雷氏菌sp基因。本发明还提供上述多肽包涵体的制备方法，即采用来源于沙雷氏菌的舍雷肽酶基因sp，构建重组质粒pet28a-sp，将上述重组质粒转化至宿主细胞即大肠杆菌bl21中进行表达，采用大肠杆菌bl21能高效表达目的序列，然后筛选出高效表达转化子，经乳糖、异丙基硫代半乳糖苷(iptg)或其他乳糖类似物诱导产生复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体。进一步地，上述筛选高效表达转化子时，挑阳性克隆单菌落接种于lb培养基上摇床培养，至od600≈0.5-1时，采用乳糖、异丙基硫代半乳糖苷(iptg)或其他乳糖类似物诱导产生复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体。更进一步地，摇床培养的条件为28℃-40℃，150-250r/min，培养至od600＝0.5-1时，采用乳糖、异丙基硫代半乳糖苷(iptg)或其他乳糖类似物诱导表达。进一步地，通过镍柱纯化多肽包涵体。镍柱使用ni-琼脂糖凝胶6ff(his标签纯化树脂)。进一步地，通过氯化钠使多肽包涵体复性。本发明的优点和有益效果：将舍雷肽酶基因sp通过基因工程技术克隆至载体中构建表达载体，通过转化方法将构建好的表达载体导入宿主细胞即大肠杆菌bl21中，经过培养和诱导表达，该重组使宿主细胞能够表达出复性后具有高舍雷肽酶活性的多肽包涵体。菌株培养周期缩短，生产成本降低，产品纯度更高，提取工艺更为简单。本发明在生物医药
技术领域：
具有极大的应用前景和商业价值。附图说明图1为重组质粒pet28a-sp示意图图2为复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体sds-page电泳。图3为镍柱纯化后的多肽包涵体sds-page电泳。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。目前舍雷肽酶的生产主要是采用发酵工程从菌株发酵液中提取，但舍雷肽酶对于菌体本身具有毒害性，因此从菌株发酵液直接提取舍雷肽酶的发酵工艺一直未能取得更大的突破，使得舍雷肽酶生产成本高昂，产品市场推广和应用有限。包涵体的形成可以有效的解决这个问题。没有活性的包涵体并不会表达出对细胞的毒害，可使细胞正常生长，产出更多的包涵体，再进一步通过复性可以获得高活性的舍雷肽酶。在解决蛋白毒性问题的同时，包涵体还有易分离的优点，这使得后续处理可以获得高纯度的舍雷肽酶，并且操作简单，成本低廉。因此申请人对如何获得舍雷肽酶包涵体、并保证该包涵体复性后能够具有舍雷肽酶活性进行了研究，并最终提出了如下的解决方案。实施例1通过设计同源性引物，进行pcr扩增获得目的基因。其中正向引物为spce28-f：gtgccgcgcggcagccatatggcagcgacaacaggctatgat，反向引物为spce22-r：gtggtggtggtggtgctcgagttaaacgataaaatctgttgcaacat。以来源于沙雷氏菌的舍雷肽酶基因基因组(本实施例利用金斯瑞合成序列提取该基因组)作为模板进行pcr扩增。pcr体系和程序如下pcr反应体系：pcr反应程序：通过pcr扩增得到了目的基因，即复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体的dna序列，如seqidno：3所示，根据该seqidno：3按照中心原则进行翻译，可以得到复性后具有舍雷肽酶多肽包涵体的氨基酸序列，如seqidno：4所示。根据引物(spce28-f、spce22-r)中涉及的限制性核酸内切酶位点对目的基因(sp基因)和pet表达载体进行酶切，酶切产物进行纯化后采用exnaseii连接酶对酶切后的pet28a载体和酶切后的sp基因进行连接，如图1所示为重组质粒pet28a-sp的示意图。连接产物通过热激转化进大肠杆菌dh5α，挑取单菌落在lb培养基中培养10-24小时，提取重组质粒。提取的重组质粒热激转化进bl21大肠杆菌中。在含有100ug/ml的卡那霉素的lb培养平板上涂布培养12-24小时。实施例2待单菌落长出后，挑取单菌落到10ul的无菌水中，作为菌落pcr验证模板进行菌落pcr验证。将pcr验证正确的菌落接种到lb液体培养基中，培养条件37℃，培养摇床转速150-250rpm/min。待菌体浓度长到od(600nm测定)0.5-1之间时，加入iptg进行诱导，iptg诱导终浓度0.1-1mmol/l，诱导时间48h。筛选出复性后高活性的菌株。pcr体系组分体积终浓度双蒸水3.2μlt7引物(10μm)0.4μl0.4μmspce22-r引物(10μm)0.4μl0.4μm2×taqmix5μl1×菌液1μl总体积10μlpcr程序实施例3将pcr验证正确的菌落接种到lb液体培养基中，培养条件37℃，培养摇床转速150-250rpm/min。待菌体浓度长到od(600nm测定)0.5-1之间时，加入iptg进行诱导，iptg诱导终浓度0.1-1mmol/l，诱导时间48h。因为形成包涵体，所以舍雷肽酶不具有对细胞的蛋白毒性，菌浓与正常大肠杆菌菌浓相当，最终获得高活性的舍雷肽酶，结果见下表。表1菌株普通大肠杆菌空载大肠杆菌未诱导表达菌株诱导表达菌株诱导表达菌株48h菌浓2.822.762.782.652.59将培养液转移到离心杯中，7000rpm，离心15min收集菌体，去掉上清。按照菌体:lysisbuffer＝1:10(w/v)将菌体悬浮起来，混匀，冰浴超声破碎。将破碎液转移至离心管中，10000rpm下，4℃离心20-30分钟。如图2所示为复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体sds-page电泳，由图2可知大肠杆菌bl21成功表达了目的蛋白。将离心产物去掉上清，按照菌体:lysisbuffer(含8m尿素)＝1:10(w/v)将包涵体悬浮起来。变性条件下进行his标签蛋白纯化。nintabeads6ff装填好后，用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。使用至少5倍柱床体积的lysisbuffer平衡色镍柱。利用恒流泵上样。用10-15倍柱体积washbuffer冲洗柱子，用5倍柱体积的elutionbuffer进行洗脱。即可获得高纯度的包涵体。如图3所示为镍柱纯化后的多肽包涵体sds-page电泳，由图3可知镍柱纯化之后，目的蛋白没有丢失。具体缓冲液配方见下表表2包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方实施例4将含有包涵体的洗脱样以体积比1：9的复性液(240mm氯化钠)混合，冰上复性过夜。即得高活性的舍雷肽酶。多次进行酶活检测得平均活性高于4000spu/g。结果见表3：通过实施例可见，本发明可以通过基因工程获得具有舍雷肽酶高活性的多肽，培养周期短，有利于生产方法推广。其中，舍雷肽酶的活性检测方法参考日本药典(jpxvi)的检测方法(舍雷肽酶，serrapeptase)，如下(i)样品溶液：将恰好0.100g的舍雷肽酶溶于硫酸铵溶液(1/20)中，精确溶解100ml。吸取1ml该溶液，加入硼酸盐-盐酸缓冲溶液(900毫升去离子水溶解19克硼砂)。用1n盐酸调节ph值至9.0。用去离子水把体积定容至1升)准确定量至200ml，并且使用该溶液作为样品溶液。(ii)酪氨酸标准溶液：在0.2mol/l盐酸中精确溶解0.160g酪氨酸(预先在105℃下干燥3小时)，精确定容到1000ml。吸取10毫升该溶液，并添加0.2mol/l盐酸准确定容100毫升。使用前准备。(iii)底物溶液：酪蛋白预先干燥(60℃，减压(不超过0.67千帕)干燥3小时)。准确称取基于干燥损失计算出的1.20g酪蛋白，添加160ml硼酸钠溶液(19g溶于1000ml纯化水)，并在水浴中加热溶解。冷却后，用1mol/l盐酸将ph调节至9.0，然后加入硼酸盐-盐酸缓冲溶液(900毫升去离子水溶解19克硼砂)，准确定容到200ml。升温至37±0.50c后使用。现配现用。(iv)沉淀试剂：用150ml去离子水溶解9克三氯乙酸(ccl3cooh)，加入15克无水醋酸钠(无水ch3coona)和10毫升冰醋酸(ch3cooh)完全溶解。用去离子水把体积定容至500毫升。升温至37±0.50c后使用。(v)步骤：吸取1ml样品溶液，放入玻璃塞管(15×130mm)中，在37±0.5℃静置5分钟，加入5ml底物溶液，混合均匀。在37±0.5℃放置20分钟，准确加入5ml三氯乙酸，混合，在37±0.5℃放置30分钟，并用干燥的滤纸过滤。吸取2ml滤液，准确加入5ml6％无水碳酸钠溶液(用500毫升去离子水溶解30克无水碳酸钠)，混合，准确加入1ml稀释的folin's溶液(1/3稀释)，充分混合，并使其静置于37±0.50℃30分钟。按照紫外-可见分光光度测定法，使用水作为空白，在660nm处测定该溶液的吸光度a1。单独吸取1ml样品溶液，准确加入5ml三氯乙酸作为舍雷肽酶，混匀，准确加入5ml底物溶液，在37±0.5℃放置30分钟，然后以相同的方式进行如上所述来确定吸光度a2。单独吸取2ml酪氨酸标准溶液，准确加入5ml无水碳酸钠溶液(用500毫升去离子水溶解30克无水碳酸钠(无水na2co3))，混合，准确加入1ml稀释的folin's溶液(1/3稀释)，充分混合，然后进行与上述相同的方式确定吸光度a3。单独吸取2ml0.2mol/l盐酸溶液，按上述方法进行吸光度a4的测定酶活定义：一个舍雷肽酶单位对应于在上述条件下从5ml底物溶液中每分钟产生1mg酪氨酸的舍雷肽酶的量。酶活计算：每毫克舍雷肽酶单位＝(a1-a2)/(a3-a4)×1/20×200×17620:反应时间(分钟)200：稀释率176:转化率(酶反应液总量/取滤液量×2ml酪氨酸标准溶液中酪氨酸的量)本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物医药工程领域的市售产品。以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。序列表<110>宁波希诺亚海洋生物科技有限公司<120>复性后具有舍雷肽酶活性的多肽包涵体及其复性生产舍雷肽酶的方法<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>42<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gtgccgcgcggcagccatatggcagcgacaacaggctatgat42<210>2<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gtggtggtggtggtgctcgagttaaacgataaaatctgttgcaacat47<210>3<211>1428<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ggatccgcagcgacaacaggctatgatgccgtggatgatctgcttcattatcatgaaaga60ggcaatggaattcaaatcaacggcaaagatagcttttctaacgaacaagcaggacttttt120atcacacgcgaaaatcagacatggaacggctataaagtttttggacaaccggtgaaactg180acatttagctttccggattacaaattttcaagcacaaacgtcgcgggcgatacaggactt240tcaaaatttagcgcggaacaacagcaacaggctaaactgtctcttcagtcatgggcggat300gtcgctaacattacatttacagaagttgctgccggccagaaagctaacatcacatttgga360aactactcacaagatagaccgggccattatgattatggaacacaggcctatgcatttctg420ccgaatacaatttggcaaggacaggatcttggcggacaaacatggtataatgtcaaccag480tctaacgttaaacatccggccacagaagattatggccgccaaacatttacacatgaaatt540ggccatgccttaggactgtcacatccgggagattataatgcaggcgaaggaaacccgaca600tatagagatgttacgtatgcagaagatacacgccaatttagcctgatgtcttactggtca660gaaacaaacacaggcggagataacggcggacattatgcagcggctccgttactggatgat720attgccgcaatccagcatctttatggcgcgaatttaagcacaagaacaggcgatacagtt780tacggatttaactcaaacacaggacgcgattttctgagcacaacatcaaacagccaaaaa840gtgatttttgcggcttgggatgcgggcggaaacgatacatttgatttttctggctacaca900gctaaccagagaatcaacctgaacgaaaaatctttttcagatgtgggcggactgaaaggc960aatgttagcattgccgcaggagtgacaattgaaaacgcgatcggcggatctggcaatgat1020gttatcgtgggaaacgcggctaataacgtgctgaaaggcggagctggcaatgatgtcctt1080tttggcggaggcggagcggatgaattatggggcggagctggaaaagatatttttgtcttt1140tctgccgcaagcgattctgcaccgggcgcatcagattggattagagattttcaaaaagga1200attgataaaattgatctgtcatttttcaacaaagaagcacagtcttcagattttatccat1260tttgttgatcattttagcggcgcggctggagaagcccttctgagctacaatgcatctaac1320aacgtgacagatcttagcgtcaacatcggcggacatcaagccccggattttctggtgaaa1380attgtcggacaggtcgatgttgcaacagattttatcgtttaatctaga1428<210>4<211>475<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4glyseralaalathrthrglytyraspalavalaspaspleuleuhis151015tyrhisgluargglyasnglyileglnileasnglylysaspserphe202530serasngluglnalaglyleupheilethrarggluasnglnthrtrp354045asnglytyrlysvalpheglyglnprovallysleuthrpheserphe505560proasptyrlyspheserserthrasnvalalaglyaspthrglyleu65707580serlyspheseralagluglnglnglnglnalalysleuserleugln859095sertrpalaaspvalalaasnilethrphethrgluvalalaalagly100105110glnlysalaasnilethrpheglyasntyrserglnaspargprogly115120125histyrasptyrglythrglnalatyralapheleuproasnthrile130135140trpglnglyglnaspleuglyglyglnthrtrptyrasnvalasngln145150155160serasnvallyshisproalathrgluasptyrglyargglnthrphe165170175thrhisgluileglyhisalaleuglyleuserhisproglyasptyr180185190asnalaglygluglyasnprothrtyrargaspvalthrtyralaglu195200205aspthrargglnpheserleumetsertyrtrpsergluthrasnthr210215220glyglyaspasnglyglyhistyralaalaalaproleuleuaspasp225230235240ilealaalaileglnhisleutyrglyalaasnleuserthrargthr245250255glyaspthrvaltyrglypheasnserasnthrglyargasppheleu260265270serthrthrserasnserglnlysvalilephealaalatrpaspala275280285glyglyasnaspthrpheasppheserglytyrthralaasnglnarg290295300ileasnleuasnglulysserpheseraspvalglyglyleulysgly305310315320asnvalserilealaalaglyvalthrilegluasnalaileglygly325330335serglyasnaspvalilevalglyasnalaalaasnasnvalleulys340345350glyglyalaglyasnaspvalleupheglyglyglyglyalaaspglu355360365leutrpglyglyalaglylysaspilephevalpheseralaalaser370375380aspseralaproglyalaserasptrpileargasppheglnlysgly385390395400ileasplysileaspleuserphepheasnlysglualaglnserser405410415asppheilehisphevalasphispheserglyalaalaglygluala420425430leuleusertyrasnalaserasnasnvalthraspleuservalasn435440445ileglyglyhisglnalaproasppheleuvallysilevalglygln450455460valaspvalalathrasppheilevalserarg465470475当前第1页1 2 3